排污口水體中陰溝腸桿菌的多重pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，通過陰溝腸桿菌抗體溶液制備和免疫磁珠溶液制備，將待測水樣中用免疫磁珠溶液富集，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液，然后用DNA提取試劑盒提取DNA模板，再通過多對引物的PCR檢測，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，則水樣中含有陰溝腸桿菌；該方法水樣中陰溝腸桿菌富集程度高，利于檢測，檢測靈敏，多對引物同時檢測，準確性高。
【專利說明】排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及細菌的PCR檢測技術(shù)，具體涉及排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]陰溝腸桿菌iBnterobacter cloacae)是腸桿菌屬的成員之一,該菌為革蘭陰性粗短桿菌，廣泛存在于自然界中，在人和動物的腸道、糞便水、泥土、植物中均可檢出，陰溝腸桿菌已成為醫(yī)院感染越來越重要的病原菌。因此排污口水體中陰溝腸桿菌的檢測就可以反應(yīng)該城鎮(zhèn)的居民感染陰溝腸桿菌的狀況。多重PCR技術(shù)針對多個DNA模板或者同一模板的不同區(qū)域進行擴增的過程，可一次擴增多個靶基因或基因片段，使檢測的準確性更高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，該方法對排污口水體中的陰溝腸桿菌進行富集，并用多對引物同時檢測，檢測靈敏度高，準確性高。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，其步驟如下:
a、陰溝腸桿菌抗體溶液制備:挑取陰溝腸桿菌單個菌落接種于由胰蛋白酶酶解的酪蛋白大豆液-瓊脂液體培養(yǎng)基(TSBA)中，震蕩培養(yǎng)過夜，7000~8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用生理鹽水水洗I次，再用生理鹽水懸浮，加入質(zhì)量百分濃度為0.5%~1%的甲醛過夜；次日7000~8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用生理鹽水洗3次，并用生理鹽水分別配成濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液和濃度為101° cfu /ml陰溝腸桿菌菌液，將濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，間隔一周，用濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用濃度為101° cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加強免疫，加強免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37°C下溫育0.5h，4°C下3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清，該上清為陰溝腸桿菌抗體溶液；
b、免疫磁珠溶液制備:取100~200μ I羧基磁珠置于離心管中，加入500 μ L活化緩沖液，在漩渦振蕩器上混合均勻，將離心管放置于磁分離架上，待納米磁珠完全被吸附于離心管壁，移出管中液體，用活化緩沖液洗滌納米磁珠一次，洗滌后在離心管中加入活化緩沖液500μ 1、碳二亞胺0.5mg和N-羥基琥珀酰亞胺lmg，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫下活化20 min，移出管中液體，得到活化磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌活化磁珠二次，洗滌后在離心管中加入濃度為6 mg/ml的上述陰溝腸桿菌抗體溶液15 μ 1，室溫下反應(yīng)3 h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌免疫磁珠二次，然后加入含有質(zhì)量百分濃度I %牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)緩沖液500 μ I封閉免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化緩沖液為PH為6.0含有吐溫-20 (Tween-20)的NaH2PO4溶液，所述偶聯(lián)緩沖液為pH為7.4含有吐溫-20的NaH2PO4溶液，所述活化緩沖液和所述偶聯(lián)緩沖液中，NaH2PO4濃度為0.01M,吐溫-20的質(zhì)量百分濃度為0.05% ；
C、待測樣品富集:取排污口水樣2ml于試管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室溫輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min，移出試管中液體，用磷酸緩沖液洗滌免疫磁珠3~5次，洗滌后加入
0.5ml無菌水，將試管置于磁性細胞分離架上磁性分離3min，取出免疫磁珠，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液；
d、DNA模板制備:待檢樣品溶液用DNA提取試劑盒提取DNA，得到DNA模板，具體提取依DNA提取試劑盒說明書進行；
e、PCR檢測:30μ I的PCR反應(yīng)體系為:10 XPCR緩沖液2.5 μ 1，濃度25mM的MgCl2液
1.5 μ 1，濃度IOmM的dNTP液1.5 μ 1，濃度5U/ μ I的T aq DNA聚合酶0.2 μ 1，濃度都為10 μ M 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R, Slt-F、Slt-R 各 1.0 μ 1，上述DNA模板2 μ 1，余量為雙蒸水；PCR反應(yīng)條件為94° C變性5 min, 94° C變性45s，55° C退火45s，72° C延伸lmin，35個循環(huán)，72° C延伸10 min ;PCR反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量百分濃度1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，則排污口水體中含有陰溝腸桿菌，所述引物irp2-F的核苷酸序列為:AAGGATTCGC TGTTACCGGA C，所述引物 irp2_R 的核苷酸序列為:AACTCCTGAT ACAGGTGGC,所述引物FhuA-F的核苷酸序列為:CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，所述引物FhuA-R的核苷酸序列為:TTGAGGTCGT GGCGTAATCG T，所述引物SodB-F的核苷酸序列為:ACCACCAGGCGTATGTCACT AA,所述引物SodB-R的核苷酸序列為:TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,所述引物SI t-F的核苷酸序列為:CGCAGCCGCT ACGCACAAAT，所述引物SI t_R的核苷酸序列為:TCGGTTACAT CGCTACCCAT CA。
[0005]上述引物是根據(jù)陰溝腸桿菌的基因組序列，應(yīng)用primer Express 3.0軟件設(shè)計并篩選得到，引物由上海生工合成。
[0006]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，通過陰溝腸桿菌抗體溶液制備和免疫磁珠溶液制備，將待測水樣中用免疫磁珠溶液富集，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液，然后用DNA提取試劑盒提取DNA模板，再通過多對引物的PCR檢測，若得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，則水樣中含有陰溝腸桿菌；該方法水樣中陰溝腸桿菌富集程度高，利于檢測，檢測靈敏，多對引物同時檢測，準確性高。
【具體實施方式】
[0007]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0008]實施例1
陰溝腸桿菌抗體溶液制備:挑取陰溝腸桿菌(ATCC 13047)單個菌落接種于TSBA液體培養(yǎng)基(購于上海生工)中震蕩培養(yǎng)過夜，7000~8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用生理鹽水水洗I次，再用生理鹽水懸浮，加入質(zhì)量百分濃度為0.5%~1%的甲醛過夜；次日7000~8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用生理鹽水洗3次，并用生理鹽水分別配成濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液和濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液，將濃度為IO7~IO9 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，間隔一周，用濃度為IO7~IO9 Cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用濃度為101°cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加強免疫，加強免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37°C下溫育0.5h，4°C下3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清，該上清為陰溝腸桿菌抗體溶液待用；
免疫磁珠溶液制備:取濃度為30mg /ml納米磁珠液100~200 μ I置于離心管中，再加入活化緩沖液500 μ I，在漩渦振蕩器上混合均勻，將離心管放置于磁分離架上，待納米磁珠完全被吸附于離心管壁，移出管中液體，用活化緩沖液洗滌納米磁珠一次，洗滌后在離心管中加入活化緩沖液500μ 1、碳二亞胺0.5mg和N-羥基琥珀酰亞胺lmg，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫下活化20 min，移出管中液體，得到活化磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌活化磁珠二次，洗滌后在離心管中加入偶聯(lián)緩沖液485 μ I和濃度為6 mg/ml的上述陰溝腸桿菌抗體溶液15μ 1，室溫下反應(yīng)3 h，抽掉上清液，得到免疫磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌免疫磁珠二次，然后加入含有質(zhì)量百分濃度1% BSA的偶聯(lián)緩沖液500 μ I封閉磁珠30min，得到免疫磁珠溶液待用；上述活化緩沖液為PH 6.0、含有質(zhì)量百分濃度為0.05%的Tween-20、濃度0.01M的NaH2PO4溶液，上述偶聯(lián)緩沖液為pH 7.4、含有質(zhì)量百分濃度為0.05%Tween-20、濃度為
0.01M 的 NaH2PO4 溶液；
待測樣品富集:取寧波市象山縣象山港排污口水樣2ml于試管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室溫輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min，移出試管中液體，用磷酸緩沖液洗滌免疫磁珠3~5次，洗滌后加入0.5ml無菌水，將試管置于磁性細胞分離架上磁性分離3min，取出免疫磁珠，得到陰溝腸桿菌富集的待檢樣品溶液；
DNA模 板制備:待檢樣品溶液用DNA提取試劑盒(購于上海生工)提取DNA，得到DNA模板，具體提取依DNA提取試劑盒說明書進行；
PCR檢測:30μ1的PCR反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液2.5 μ 1，濃度25mM的MgCl2液
1.5 μ 1，濃度IOmM的dNTP液1.5 μ 1，濃度5U/ μ I的T aq DNA聚合酶0.2 μ 1，濃度都為10 μ M 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R, Slt-F、Slt-R 各 1.0 μ 1，上述DNA模板2 μ 1，余量為雙蒸水；PCR反應(yīng)條件為94° C變性5min，94° C變性45s，55° C退火45s，72° C延伸lmin，35個循環(huán)，72° C延伸10 min ;PCR反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量百分濃度1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段，得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個基因片段，排污口水體中含有陰溝腸桿菌，引物irp2-F的核苷酸序列為:AAGGATTCGCTGTTACCGGA C，引物 irp2_R 的核苷酸序列為:AACTCCTGAT ACAGGTGGC,引物 FhuA-F 的核苷酸序列為:CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，引物FhuA-R的核苷酸序列為:TTGAGGTCGTGGCGTAATCG T，引物 SodB-F 的核苷酸序列為:ACCACCAGGC GTATGTCACT AA，引物 SodB-R的核苷酸序列為:TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,引物Slt-F的核苷酸序列為:CGCAGCCGCTACGCACAAAT，引物 Slt-R 的核苷酸序列為:TCGGTTACAT CGCTACCCAT CA。
[0009]實施例2
與實施例1基本相同，所不同的只是排污口水樣取自于寧波市奉化江江東排污口，PCR檢測后，得到816bp基因片段，排污口水體中未含有陰溝腸桿菌。
[0010]實施例3
與實施例1基本相同，所不同的只是排污口水樣取自于寧波市奉化江海曙排污口，PCR檢測后，得到1216bp基因片段，排污口水體中未含有陰溝腸桿菌。[0011]實施例4
與實施例1基本相同，所不同的只是排污口水樣取自于寧波市甬江江東排污口，得到816bp、502bp 二個基因片段，排污口水體中未含有陰溝腸桿菌。
[0012]實施例5
與實施例1基本相同，所不同的只是排污口水樣取自于定波市甬江江北排污口，得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個基因片段，排污口水體中含有陰溝腸桿菌。
[0013]實施例6:特異性和 靈敏性
與實施例1的DNA模板制備和PCR檢測基本相同，所不同的只是直接用陰溝腸桿菌(ATCC 13047)，和陰溝腸桿菌接近的熒光假單胞菌(ATCC 13525)，遲緩愛德華菌(ATCC15947)、大腸桿菌(ATCC25922)進行DNA模板制備和PCR檢測，只是陰溝腸桿菌得到816bp、1507bp、502bp和1216bp四個目的基因片段，另外3種其它細菌仍只得到1_2個基因片段，說明特異性高。陰溝腸桿菌DNA模板濃度梯度l-100ng，分別用PCR檢測，檢測限為(100cfu/ml,說明靈敏性強。
【權(quán)利要求】
1.排污口水體中陰溝腸桿菌的多重PCR檢測方法，其特征在于步驟如下：a、陰溝腸桿菌抗體溶液制備：挑取陰溝腸桿菌單個菌落接種于由胰蛋白酶酶解的酪蛋 白大豆液_瓊脂液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)過夜，7000?8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用 生理鹽水水洗1次，再用生理鹽水懸浮，加入質(zhì)量百分濃度為0. 5%?1%的甲醛過夜；次日 7000?8000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，沉淀用生理鹽水洗3次，并用生理鹽水分別配成濃度為 107?109 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液和濃度為101Q cfu /ml陰溝腸桿菌菌液，將濃度為107? 109 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中首次免疫，間隔一周，用濃度為107? 109 cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml腹腔注射于小鼠中第二次免疫，再隔一周，用濃度為1(T cfu /ml陰溝腸桿菌菌液0.2ml注射于于小鼠中加強免疫，加強免疫后第四天，摘除小鼠眼 球取血，血液置于37°C下溫育0. 5h，4°C下3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清，該上清為陰溝 腸桿菌抗體溶液；b、免疫磁珠溶液制備：取100?200yl羧基磁珠置于離心管中，加入500 u L活化緩 沖液，在漩渦振蕩器上混合均勻，將離心管放置于磁分離架上，待納米磁珠完全被吸附于離 心管壁，移出管中液體，用活化緩沖液洗滌納米磁珠一次，洗滌后在離心管中加入活化緩沖 液500ia、碳二亞胺0. 5mg和N-羥基琥珀酰亞胺lmg，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫下活 化20 min，移出管中液體，得到活化磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌活化磁珠二次，洗滌后在離心 管中加入濃度為6 mg/ml的上述陰溝腸桿菌抗體溶液15 yl，室溫下反應(yīng)3 h，抽掉上清液， 得到免疫磁珠，用偶聯(lián)緩沖液洗滌免疫磁珠二次，然后加入含有質(zhì)量百分濃度1 %牛血清白 蛋白的偶聯(lián)緩沖液500 u 1封閉免疫磁珠30min，得到免疫磁珠溶液；所述活化緩沖液為pH 為6. 0含有吐溫-20的NaH2P04溶液，所述偶聯(lián)緩沖液為pH為7. 4含有吐溫_20的NaH2P04 溶液，所述活化緩沖液和所述偶聯(lián)緩沖液中，NaH2P04濃度為0. 01M，吐溫-20的質(zhì)量百分濃 度為0. 05% ；c、待測樣品富集：取排污口水樣2ml于試管中，加入0.2ml上述免疫磁珠溶液，室溫 輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min，移出試管中液體，用磷酸緩沖液洗滌免疫磁珠3?5次，洗滌后加入，0.5ml無菌水，將試管置于磁性細胞分離架上磁性分離3min，取出免疫磁珠，得到陰溝腸桿 菌富集的待檢樣品溶液；d、DNA模板制備：待檢樣品溶液用DNA提取試劑盒提取DNA，得到DNA模板，具體提取依 DNA提取試劑盒說明書進行；e、PCR檢測：30iil的PCR反應(yīng)體系為：10XPCR緩沖液2.5 yl，濃度25mM的MgCl2液，1.5u 1，濃度10mM的dNTP液1. 5 y 1，濃度5U/ yl的T aq DNA聚合酶0. 2 y 1，濃度都為 10 uM 的引物 irp2-F、irp2_R、FhuA-F、FhuA-R、SodB-F、SodB-R、Slt_F、Slt-R 各 1. 0 y 1， 上述DNA模板2 iil，余量為雙蒸水；PCR反應(yīng)條件為94° C變性5 min,94° C變性45s， 55° C退火45s，72° C延伸lmin，35個循環(huán)，72° C延伸，10 min ;PCR反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量百 分濃度1. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因片段，若得到816bp、1507bp、502bp和，1216bp 四個目的基因片段，則排污口水體中含有陰溝腸桿菌，所述引物irp2-F的核苷酸序列為： AAGGATTCGC TGTTACCGGA C，所述引物 irp2_R 的核苷酸序列為：AACTCCTGAT ACAGGTGGC, 所述引物FhuA-F的核苷酸序列為：CAGCAGAACA ACCGAAGCAA GA，所述引物FhuA-R的核 苷酸序列為：TTGAGGTCGT GGCGTAATCG T，所述引物SodB_F的核苷酸序列為：ACCACCAGGC GTATGTCACT AA,所述引物SodB-R的核苷酸序列為：TGCCGAAAGA TTTGGCGATT,所述引物SI t-F的核苷酸序列為:CGCAGCCGCT ACGCACAAAT，所述引物SI t_R的核苷酸序列為:TCGGTTACAT CGC TACCCAT CA。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540666SQ201310496295
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】蘇秀榕, 周君, 張春丹, 李曄, 王中華, 李春麗, 張迪駿, 何偉娜 申請人:寧波大學