專利名稱：含有心肌細胞的裝置及其制造和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及測定化學化合物的心臟毒性(cardiotoxicity)的裝置。本發(fā)明進一步涉及制造這種裝置的方法。本發(fā)明還進一步涉及使用這種裝置測定化學化合物的心臟毒性的方法。本發(fā)明進一步涉及所述裝置用于藥物靶標發(fā)現和/或藥物開發(fā)的應用。本發(fā)明進一步涉及為由細胞的拉伸所導致或改變的疾病開發(fā)疾病模型的方法，特別是心臟疾病模型。
背景技術：
許多藥物具有心臟毒性副作用，例如心律失?；驅π募∈湛s能力的負面影響。在過去的幾年中已明顯得知許多藥物的一個常見副作用是對心動周期中QT間期的延長影響，這是藥物誘發(fā)的危及生命的心律失常的重要原因。例如，在過去，數種藥物的研發(fā)由于對體表心電圖(ECG)的QT間期的不希望影響已經中止于臨床前試驗或臨床試驗的后期，甚至上市后。該間期延長至超過440至460毫秒可能會導致危及生命的心律失常的發(fā)生，例如尖端扭轉型室性心動過速(torsade de pointes，TdP)，并且與多種藥物相關。1998年當Food and Drug Administration (FDA)認定QT間期的延長為重大藥物安全問題時，該現象得到公認。因此，QT延長和臨床尖端扭轉型室性心動過速的確認導致一些藥物從美國市場的清除，包括特非那定、阿司咪唑、硫利達嗪和格帕沙星，同時許多其它藥物被FDA要求攜帶警告潛在風險的附加安全標簽。目前，延遲的心室復極化和QT間期延長的風險評估是被FDA和EMEA采用的用于所有研發(fā)中藥物的NCE標準非臨床評價的一部分。不幸的是，目前可得到的檢測心臟毒性的臨床前體外細胞基模型系統對于檢測這些副作用的大多數是不足的，同時預測性體內動物試驗非常昂貴，并且受到道德上的挑戰(zhàn)。 另外，從動物研究獲得的心臟毒性結果不能容易地推及到人類。檢測過程由于以下事實被進一步復雜化藥物的這些心臟毒性影響可能只在發(fā)生在體內跳動心臟中的實際心肌拉伸和收縮期間，特別是在(劇烈)體育運動期間；以及在心臟疾病中，例如與心臟超負荷相關的疾病，如心臟衰竭，和以炎癥為特征的疾病中，如在流感感染過程中，才變得明顯。目前沒有模擬，在生理狀態(tài)，即拉伸-收縮周期，或者與心臟衰竭相關的病理生理狀態(tài)，例如針對增加的壓力的過度拉伸/收縮，的正常跳動心臟的檢測模型系統存在。此外，不同的藥物對心臟功能可能有不同的負面影響。一些基于人類細胞的模型系統可獲得而用于心臟毒性檢測。這些模型系統典型地可由在標準的多電極陣列(MEA)上的心肌細胞(動物的或人的，原代心肌細胞(primary cardiomyocytes)或干細胞衍生的心肌細胞)組成，在“Pluripotent stem cell lines”J. Yu和JA. Thomson, Genes Dev. 2008，22，p. 1987-1997中公開。然而這些系統的有效性受到以下事實的限制這些是靜態(tài)模型系統，沒有考慮跳動心臟的動態(tài)特性。^ iAn Electro-Tensile Bioreactor for 3-D Culturing of Cardiomyocytes^,Zhonggang Feng^. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine, July/August 2005，第73-79頁中，公開了一種生物反應器，其允許布置在可拉伸硅酮板上的含有心肌細胞的凝膠層的面內拉伸以模擬體內心肌的機械和電響應。這一裝置的一個缺點是其相當復雜并且由于心肌細胞包埋在凝膠中的事實而不是特別適合心臟毒性檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明尋求提供一種改進的用于測定化學化合物的心臟毒性的裝置。本發(fā)明進一步尋求提供一種制造這種改進的裝置的方法。本發(fā)明還進一步尋求提供一種使用這種改進的裝置測定化學化合物的心臟毒性的方法。本發(fā)明進一步尋求提供一種使用這種改進的裝置開發(fā)(心臟)疾病模型的方法。根據本發(fā)明的第一方面，提供了用于測定化學化合物的心臟毒性的裝置，包括承載有可變形疊層(stack)的基板(substrate)，所述疊層通過允許所述疊層的面外 (out-of-plane)變形的空腔(cavity)從基板部分分離，所述疊層包括第一可變形層，第二可變形層及夾在所述第一可變形層和第二可變形層間的多電極結構，所述第二可變形層承載有粘附其上的心肌細胞(cardiomyocytes)圖案，以及安裝在基板上的用于使心肌細胞暴露于所述化學化合物的液體容器。所述空腔的存在確保第一可變形層例如彈性體層的至少中心區(qū)域不連接到基板， 從而該區(qū)域可以自由移動，例如被心肌細胞的收縮引發(fā)。所述空腔的提供確保了可以以相對簡單的方式方便心肌細胞收縮引起的移動，從而與現有技術的裝置相比減少本發(fā)明裝置的成本。在一實施方式中，所述可變形疊層的一端從基板分離以方便心肌細胞收縮時的面外變形，例如卷曲。這具有的優(yōu)勢是心肌細胞收縮可以通過電極設置以電學方式監(jiān)控，以及可以通過卷曲量以光學方式監(jiān)控。另外，卷曲原理確保疊層對收縮心肌細胞的變形力的內在抵抗性低，從而收縮沒被該抵抗性明顯阻礙。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述基板包含所述空腔，所述疊層在所述空腔上方延伸，其中疊層的相對端連接到基板上，從而方便由外部施加的力引起的疊層的面外變形。這具有的優(yōu)勢是該裝置也可以用于通過在可變形疊層的面外變形期間拉伸細胞來培養(yǎng)未成熟的心肌細胞，從而活心肌細胞的分化和成熟過程被加速。另外，心肌細胞的收縮由于以下事實仍然是便利化的疊層的可拉伸(Stretchable)性質允許面內的心肌細胞誘導的可變形層的拉伸，這樣分別在心臟舒張期和收縮期期間的心肌細胞拉伸和收縮都可以用該裝置在適當的拉伸-收縮周期頻率以定量方式模擬。這可進一步促進干細胞衍生的心肌細胞的分化和成熟。所述裝置可包含用于用流體填充空腔的進口。在一實施方式中，所述流體是氣體 (例如空氣)，從而疊層的面外變形可以通過控制空腔內的氣體(例如空氣)壓力進行控制，從而模擬心臟的跳動。這具有的優(yōu)勢是不需要與疊層接觸而引起面外變形，從而減少污染或損壞心肌細胞的風險。在一個可選的實施方式中，所述流體是液體，并且所述疊層包含所述進口。疊層中進口的提供進一步方便了心肌細胞收縮周期期間疊層的拉伸，從而例如使得能夠使用線形電極陣列。在該實施方式中，任何置于容器中的流體都將包圍疊層的兩個表面，使得流體在疊層上的載荷將有效地為零。在這種情況下，疊層的面外變形可以是以機械方式產生的?？傻玫?00%或更大的疊層的面外變形。在一實施方式中，所述疊層是波紋狀的以使得其可變形。波紋進一步降低了疊層對心肌細胞收縮力的內在抵抗性，從而改善所述裝置的心肌細胞收縮行為。按照本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明裝置的制造方法。該方法包括生長所述基板的氧化物層；在氧化物層上沉積第一可變形層；在第一可變形層上沉積并圖案化導電層 (conductive layer)，從而形成多電極結構，在第一可變形層上沉積第二可變形層，圖案化第二可變形層以提供至多電極結構的通路(to provide access to the multi-electrode structure)，在圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案，將心肌細胞粘附于所述粘性圖案， 將液體容器粘附到第二可變形層上并形成在第一可變形層下面的空腔。這種方法的優(yōu)勢在于本發(fā)明的裝置可以以低成本形成，從而使該方法對大規(guī)模生產目的具有吸引力。這種方法的步驟執(zhí)行的順序可以改變而不超出本發(fā)明的范圍。例如，在圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案和將心肌細胞粘附于所述粘性圖案的步驟可以在形成在第一變形層下面的空腔后進行。這具有的優(yōu)勢在于心肌細胞可以在即將使用前施加到第二可變形層，從而確保在使用期間心肌細胞處于良好的狀況。在一實施方式中，形成所述空腔包括在沉積第一可變形層前在氧化物層上沉積犧牲層，所述犧牲層限定空腔容積并且在沉積第二可變形層后移除所述犧牲層。這具有的優(yōu)勢在于疊層可以在犧牲層上而不是在所述空腔上形成，從而由于不需要復雜步驟以在空洞上形成疊層而簡化制造工藝。在一個可選的實施方式中，形成所述空腔包括在基板背面上施加掩模；圖案化所述掩模以限定空腔區(qū)域；蝕刻基板的背面以暴露第一可變形層；和從基板背面移除圖案化的掩模。這具有的優(yōu)勢在于疊層可以在基板上而不是空腔上形成，從而如以上解釋的那樣簡化制造工藝。有利地，所述方法進一步包括在形成氧化物層前在基板中形成波紋狀圖案。這具有的優(yōu)勢在于變形能力可通過波紋(corrugations)的柔韌性(flexibility)實現，如前面解釋的那樣其有助于心肌細胞的收縮周期。在一實施方式中，所述波紋狀圖案通過軋壓(milling)形成。在一個可選的實施方式中，形成所述波紋狀圖案(corrugated pattern)包括在基板上沉積氧化硅層；在氧化硅層上沉積氮化硅層；圖案化氧化硅和氮化硅層，從而暴露基板的選定部分；將所述選定部分暴露于一系列蝕刻步驟以形成所述波紋狀圖案；和移除氧化硅和氮化硅層。這具有以下優(yōu)勢波紋狀圖案可以使用容易得到的半導體加工技術形成，從而限制了裝置制造的復雜性和成本?？蛇x擇地，所述波紋狀圖案可以通過L0C0S氧化步驟、隨后進行其中移除L0C0S氧化物的蝕刻步驟而形成。這同樣有以下優(yōu)勢波紋狀圖案可以使用容易得到的半導體加工技術形成，從而限制裝置制造的復雜性和成本。根據本發(fā)明的又另一方面，提供了測定化學化合物的心臟毒性的方法，包括提供根據本發(fā)明的一個實施方式的裝置；用含有化學化合物的介質填充所述容器以使心肌細胞暴露于所述化合物；并且測量心肌細胞對所述暴露的反應。
在這種方法中本發(fā)明裝置的使用提供了化學化合物例如試驗藥物的心臟毒性測定的準確性改進。本發(fā)明進一步涉及為由細胞的拉伸導致或改變的疾病開發(fā)疾病模型的方法，所述方法包括步驟將至少一個細胞附著至粘性表面圖案通過外部施加的力拉伸所述至少一個細胞以電學方式和/或光學方式測量所述至少一個細胞的動作電位，隨時間監(jiān)控和/ 或解析所述動作電位。所述方法特別適用于建立心臟疾病模型(除了其中細胞拉伸與測量離子通道活性(activity)和電勢(electric potential)相關的疾病模型之外)。心臟細胞毒性可以在模擬體育鍛煉期間增加的心臟負荷(壓力)的情況下或與增加的心臟輸出相關的其他情況下測量是一個很大的優(yōu)點。心臟細胞毒性可以在心臟疾病，例如心力衰竭、心肌癥等情況下測定是一個進一步的優(yōu)勢。在所述方法中可以考慮特定遺傳變量(genetic variable) 對心臟毒性(cardiotoxicity)的影響。在一個有利的方法中，所述至少一個細胞的拉伸可以相對于所述粘性表面圖案是面內和/或面外的。面內細胞拉伸百分比超過30 %并且拉伸時間是不同的。優(yōu)選地，在測量過程中添加化學或生物化合物。根據本發(fā)明的裝置的使用允許用于藥物發(fā)現和開發(fā)的精確心臟疾病模型的開發(fā)， 以及在個體化的基礎上，考慮人類遺傳變量。


本發(fā)明的實施方式被更詳細地且通過參考附圖的非限制性實例進行了描述，其中圖1 (a)-(g)示意性描繪了依照本發(fā)明的一個實施方式制造測定化學化合物心臟毒性的裝置的方法；圖2示意性描繪了通過圖1的方法得到的測定化學化合物心臟毒性的裝置的頂視圖；圖3(a)_(c)示意性描繪了依照本發(fā)明另一實施方式的測定化學化合物心臟毒性的裝置；圖4示意性描繪了用于本發(fā)明的測定化學化合物心臟毒性的裝置的一個示例電極設置；圖5示意性描繪了用于本發(fā)明的測定化學化合物心臟毒性的裝置的一個可選示例電極設置；圖6(a)_(j)示意性描繪了依照本發(fā)明的一個可選實施方式制造測定化學化合物心臟毒性的裝置的方法；圖7 (a)-(h)示意性描繪了依照本發(fā)明又一實施方式制造測定化學化合物心臟毒性的裝置的方法；以及圖8-10顯示了圖7方法的一部分的可選方式。
具體實施方式
應該理解附圖僅僅是示意性的并且不是依照比例繪制的。還應該理解貫穿附圖使用同樣的附圖標記代表相同或相似的部件。本發(fā)明測定化學化合物心臟毒性的裝置是基于下述一般結構原理。將基于彈性體的疊層設置在基板中的空腔之上。該空腔有效地將基于彈性體的疊層的一部分從基板分離，這樣該部分的彈性特性被便利化以移出基板的表面平面。設計了這種裝置的幾個實施方式，如下面將更詳細地描述的那樣。在圖1中，描繪了制造本發(fā)明裝置的第一實施方式的方法。在第一步驟(a)中，提供基板10例如硅片、玻璃基板或任何其它合適的基板材料以及在基板10表面上形成介電層12例如氧化硅層?；?0上的介電層12的形成是本領域技術人員公知的，并且僅由于簡潔原因而不再進一步解釋。在下一步驟(b)中，犧牲材料14沉積在介電層12上并且隨后圖案化。圖案化的犧牲材料14限定了將形成的空腔?？墒褂萌魏芜m宜的犧牲材料，例如可溶的或可分解的聚合物。這種聚合物的適宜的非限制性例子是聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。在步驟(c)中，在圖案化的犧牲材料14和介電層12上形成基于彈性體的疊層。該疊層包含第一彈性體層16，在第一彈性體層16上形成的圖案化的金屬層18以及覆蓋圖案化的導電層18使得導電層被夾在第一彈性體層16和第二彈性體層20之間的第二彈性體層20?？梢允褂萌魏芜m宜的彈性體層。在一實施方式中，第一彈性體層16是聚二甲基硅氧烷(PDMS)層，其可通過旋涂施加?？梢栽谠搶由鲜┘尤魏芜m宜的導電材料，例如金屬。例如，TiN層或Ti/Au層疊層可沉積在PDMS層16上并且隨后圖案化。第二 PDMS層20可以旋涂在圖案化的導電層18上。該圖案化的導電層典型地包含電極、焊盤以及焊盤和電極之間的連接。后面將對此進行更詳細地解釋。在步驟(d)中，以任何適宜的方式形成到圖案化的導電層18中的電極和焊盤 (bond pads)的接觸(contacts) 22，例如通過RIE蝕刻。在這之后，如步驟(e)中所示，將固定層對施加于圖案化的導電層18中的電極上的第二彈性體層20的區(qū)域，用于將活的心肌細胞固定至基于彈性體的疊層。所述活的心肌細胞可以是任何適宜類型的心肌細胞，例如人或動物原代細胞(primary cells)，或人干細胞衍生的細胞。用于固定層M的適宜的材料的一個實例是纖連蛋白(fibronectin)，其可以通過壓印印刷(stamp-printing)、絲網印刷或噴墨印刷施加。所述心肌細胞可以隨后粘附到該層上。對于本領域技術人員來說顯而易見的是，纖連蛋白是這種固定層的一個非限制性實例，并且也可以考慮其它適宜的粘附材料。限定電極陣列箔(foil)的基于彈性體的疊層的尺寸可以通過(激光)切割疊層和犧牲材料層確定，從而提供切口 25，其也充當至犧牲材料14的通路。該步驟之后是步驟(f)，其中液體容器25以任何適宜的方式連接到所述裝置，例如通過膠合。最后，如步驟(f)中所示，犧牲材料被移除。例如，在犧牲材料是PIPMAAm的情況下，其可以通過在 Tyrode' s溶液中溶解該層而移除。其具有心肌細胞可以早已經位于固定層M上的優(yōu)勢， 由于Tyrode' s溶液的等滲特性。在可熱分解的材料的情況下，移除可以通過將該裝置暴露到高于所述材料的分解溫度的溫度來實現。在該實施方式中，需要注意選擇在足夠低的溫度分解的材料以避免損壞裝置的其它層。為此，可以在移除可熱分解的材料后將固定層24和心肌細胞兩者施加于基于彈性體的疊層。在一個實施方式中，基于彈性體的疊層或箔的厚度在3-10微米的范圍。在該范圍內，基于彈性體的疊層或箔具有特別好的柔韌性。圖1 (g)展示了操作中的依照本發(fā)明這一實施方式的裝置。液體容器沈填充有包含準備在心肌細胞28上檢測的化學化合物的溶液30。包埋心肌細胞的溶液30可以含有不同濃度的被測化學化合物以及模擬不同體內(病理)生理狀況，例如由劇烈運動引起的狀態(tài)，所需的不同濃度的分子，例如電解質，如鉀、鈉、鈣、葡萄糖、氧氣、C02。在承載心肌細胞28的基于彈性體的疊層下的空腔32允許該疊層的由心肌細胞 28的收縮觸發(fā)的面外卷曲。在心肌細胞觀的拉伸-收縮周期期間通過圖案化的金屬層 18中的電極紀錄的場電位可以用于測定化學化合物對心肌細胞觀的離子通道中的傳導性 (conductivity)的影響。在本發(fā)明的上下文中，應該理解短語“化學化合物”并不意在限于準備用作藥物的化合物或只限于單一化合物。通常，任何物質，例如含有一種或多種化合物的化合物混合物、乳液和溶液，都可以使用本發(fā)明的裝置檢測。移除犧牲層14前圖1(f)中顯示的裝置的電極陣列的頂視圖顯示于圖2中。圖案化的導電層18包含許多通過導電連接器(connectors) 112連接到相應電極144的焊盤 110。成型液體容器沈從而其圍起所有電極114。也顯示了切口 25，如前面解釋的那樣，其限定了可以卷起的疊層部分。切口 25延伸至下面的犧牲層14。如前面解釋的那樣，這促進了該層的移除。固定層對，例如蛋白纖連蛋白，優(yōu)選在疊層的長度方向以條帶(未顯示) 的形式圖案化。這使得當粘附在這些條帶上的心肌細胞觀收縮時引起的疊層卷曲最大化。在本發(fā)明的一個可選的實施方式中，空腔32在基板10中形成，可變形疊層覆蓋到空腔32的通路，從而基于彈性體的疊層上壓力的改變將允許疊層進入或遠離空腔32的變形。在第一實施方式中，可以使用基于彈性體的疊層，其操作原理在圖3中示出。如圖3(a) 中顯示，基板10包含延伸穿過基板的空腔32，其被基于彈性體的疊層34覆蓋。疊層34可以由第一彈性體層16、圖案化的導電層18和第二彈性體層20形成并且典型地承載由液體容器26圍起的心肌細胞觀的圖案，如前面解釋的那樣。僅僅由于清楚的原因，這些特征沒有明確地顯示在圖3(a)中。疊層或箔34典型地保持為非常薄以優(yōu)化其可拉伸性。如圖3(b)所示，所述裝置可進一步包含具有入口 36的腔室32'。腔室32與空腔 32連通接觸，從而空腔32中的壓力可以被調節(jié)，例如通過經由入口 36抽出或加入氣體例如空氣來降低或增加。這迫使疊層34在基板10面外的方向拉伸，例如當降低空腔32中的壓力時向空腔32中拉伸或當增加其中的壓力時遠離空腔32。因此，粘附在疊層34上活的心肌細胞在該過程中也被拉伸。在圖3(c)中，心肌細胞的自主收縮引發(fā)疊層34的面內變形， 其包括心肌細胞下的疊層34的增厚(收縮)和在心肌細胞所位于的區(qū)域外疊層32的變薄 (拉伸)。圖3(a)_(c)中所示的裝置具有可以拉伸的疊層34的事實具有兩個主要優(yōu)勢。第一，重復的拉伸可以施用于未成熟的干細胞以將這些干細胞分化為心肌細胞，從而產生包含完全分化的心肌細胞的用于測定化學化合物心臟毒性的裝置，這改善了用該裝置獲得的臨床數據的相關性。第二，疊層34可以與心肌細胞的收縮節(jié)奏同步被拉伸以模仿跳動的心臟。這例如允許附著的心肌細胞被動拉伸以允許在模擬靜息(at rest)和在受控(病理)生理應力下心臟的動態(tài)心肌細胞模型體系中離子通道的測量。心肌細胞收縮節(jié)奏可以是自主的或電誘導的。疊層34中的電極設置可以采取任何適當的形狀。在圖4顯示的一個實施方式中， 電極設置包含環(huán)形設置，被圓柱狀液體容器沈覆蓋，液體容器沈用于盛放包含營養(yǎng)物和/ 或一種或多種化學化合物即藥物的液體。容器沈圍起粘性條帶M例如纖連蛋白條帶(心肌細胞固定，例如粘附，在其上)的放射狀圖案。條帶的放射狀圖案促進放射狀圖案的心肌細胞的收縮，如前面解釋的那樣，導致疊層34中心部分的增厚。出于清楚的原因僅僅示出了四條條帶。疊層34可以承載任何適宜數目的條帶。電極114的圖案與這些條帶對齊。如先前所解釋的那樣，電極114經由連接器112連接到焊盤110。焊盤110可以以任何適宜的圖案，例如矩形或方形圖案設置。關于這一點，要強調的是疊層34的可拉伸特性并不必須通過使用彈性材料實現。 可選擇地，疊層34可以是波紋狀的，這樣必需的可拉伸性通過波紋實現，如在下面將更詳細地說明的那樣。對于這種實施方式，可以使用除了彈性體之外的材料。圖5顯示了這種波紋狀疊層的一個示例電極設置。從焊盤110到電極114的連接112是基本上線性性質的并且沿垂直于疊層中波紋140的方向。心肌細胞條帶典型地也沿垂直于疊層中波紋140的方向。為便于圖5的疊層設置的拉伸，沿著疊層提供開口 120。因此，含有營養(yǎng)物和待測化學化合物例如藥物的液體將圍起疊層的兩面，即也填充空腔32，作為液體重量的結果而導致疊層上“零”加載。在這種情況下，疊層的面外拉伸可以以機械方式引發(fā)。應該指出的是包含圖4的環(huán)狀電極設置的疊層也可以包含開口 120以降低疊層上的“零”加載。在一個優(yōu)選的實施方式中，在基于彈性體的疊層中的圖案化的導電層18包含Ti/ Au作為導電材料，因為已顯示薄的鈦和金層可以拉伸達100%，因此允許導電圖案無損壞地拉伸。可選擇地，可考慮TiN或其它適當的可拉伸導體。圖6示意性地描繪了根據圖3的裝置的一種制造方法，其中疊層34是基于彈性體的。在步驟(a)中，提供厚度在大約300-400微米的硅基板10并且其背面提供有合適的硬-蝕刻掩模(hard-etch mask) 50，例如LPCVD生長的氮化硅(Si3N4)。蝕刻掩模50被圖案化以限定將在基板10中形成的空腔。換句話說，蝕刻掩模圖案限定了可拉伸區(qū)域的位置和大小。在下一步驟(b)中，在基板10的前側生長介電層12，例如熱氧化物層，至1微米或更小，例如0. 5微米的厚度。在這之后是第一彈性體層16，例如第一 PDMS層的沉積和圖案化，如步驟(c)所示。該層可以以任何適宜的方式沉積，例如通過旋涂。PDMS是特別適宜的材料，因為其是生物相容的和可以拉伸達100%。在步驟(d)中，在第一彈性體層16上形成圖案化的導電層18。這可以以任何適宜的方式實現。例如，Ti/Au疊層或TiN可以作為導電材料使用，并且可以濺射涂覆并圖案化以形成電極和互連圖案，例如圖4中顯示的圖案。注意，第一彈性體16已經被圖案化，這樣焊盤下不存在彈性體以允許可靠的引線接合。在步驟(e)中完成基于彈性體的疊層，其中以任何適宜的方式沉積第二彈性體層 20，例如第二 PDMS層以密封互連圖案112并且被圖案化以暴露例如圖4中示出的電極114 和焊盤110。
接下來，如步驟(f)中所示通過用任意適宜的蝕刻劑濕-蝕刻暴露的基板10的背面，其中HF/HN03/乙酸(HNA)蝕刻劑是一個非限制性實例，形成基板10中的空腔(圖 6(f))。在步驟(g)中移除硬-蝕刻掩模之后，基板10，其典型地是承載多個傳感器裝置的晶片(wafer)，在步驟(h)中被切塊，從而分開獨立的傳感器裝置。在介電層12還沒有被濕-蝕刻步驟完全移除的情況下，可以施加進一步的濕蝕刻步驟以移除剩余的介電層材料。最后，在步驟(i)中將容器沈膠合到裝置的前側。用于將心肌細胞粘附至基于彈性體的疊層的粘性層圖案，例如纖連蛋白圖案，可以在容器26內施加，例如通過壓印，之后心肌細胞被施加至該粘性圖案。這優(yōu)選在即將使用該裝置前進行以保證心肌細胞當使用時是 “新鮮的”。圖6(j)示出了導電層18的焊盤110和電極114間的互連112的一個實施方式。 所述互連112被設計成蜿蜒的形狀以進一步方便基于彈性體的疊層的拉伸。圖7顯示了形成具有可以依靠包含波紋的疊層進行變形的疊層的裝置的方法的第一實施方式，如前面在圖6的描述中討論的那樣。在步驟(a)中，提供厚度大約300-400 微米的硅基板10并且其背面提供有適宜的硬-蝕刻掩模50，例如LPCVD生長的氮化硅 (Si3N4) 0蝕刻掩模50被圖案化以限定將在基板10中形成的空腔。該步驟基本上與圖6中步驟(a) —樣。接下來，如步驟(b)所示，以任意適宜的方式在基板10中形成波紋10'，例如通過軋壓或蝕刻。需要注意的是，雖然波紋顯示為具有三角形的形狀，但是這只作為非限制性實例。優(yōu)選地，波紋剖面具有更圓化(rounded)或波狀(wavy)的形狀。如何可以實現這種波狀的波紋圖案將在下面進行更詳細地討論。在步驟(c)中，生長熱氧化物蝕刻阻擋層，隨后在步驟(d)中沉積共形的第一層16。所述共形的材料可以是任意適宜的材料。一種優(yōu)選的候選材料是聚對二甲苯(parylene)，因為其是生物相容性材料，具有可以在室溫CVD沉積的特別階躍式覆蓋 (exceptional st印-coverage)。在焊盤的位置，在層16中蝕刻開口。在步驟(e)中，形成圖案化的導電層18，例如濺射涂覆并圖案化TiN層以形成電極和互連圖案。如步驟(f)中所示，沉積第二彈性體層20，例如第二聚對二甲苯層以密封互連 112并且圖案化以暴露電極114和焊盤110。在步驟(g)中，通過用HNA濕-蝕刻基板的暴露背面在可延伸區(qū)下面形成空腔32。 如果必要的話，可以施加額外的濕蝕刻步驟以移除任何殘余熱氧化物蝕刻阻擋層。在步驟 (h)中移除硬-蝕刻掩模50之后，通過在步驟⑴中將基板晶片切塊分離單獨的裝置，之后在步驟(j)中將容器26粘附到基板10的前側。用于將心肌細胞粘附至可拉伸區(qū)域的粘性層圖案，例如纖連蛋白圖案，可以在容器26內施加，例如通過壓印，之后心肌細胞被施加至該粘性圖案。需要重申的是，優(yōu)選提供帶有具有圓化的或波狀形狀的波紋10'的基板10。這樣做的其中一個原因是將在波紋上形成的后續(xù)層，例如彈性體層16和20，由于這些層連續(xù)性的減小的中斷風險，可以更容易地形成，由于用這些隨后的層適當地鑲襯這些拐角的困難性，所述中斷可能在三角形波紋底部的銳角拐角中發(fā)生。圖8顯示形成圓化的波紋10'的方法的第一實施方式，其利用當暴露至各向同性濕蝕刻步驟時硅的蝕刻行為。在步驟(a)中，提供帶有適合的圖案化的硬掩模50'的硅基板10，該圖案反映了希望的波紋10'的凹進處的位置?？梢允褂眠m宜的硬-蝕刻掩模例如LPCVD生長的Si3N4層。在步驟(b)中，基板10正面的暴露的部分暴露于各向同性濕蝕刻混合物，例如HNA 或HF/HN03/H20混合物。該各向同性蝕刻步驟導致向下蝕刻(under-etch)，其橫向擴展至蝕刻深度的約0.7倍。可選擇地，可使用干法蝕刻，例如CF4/02等離子體。最后，硬蝕刻-掩模50'在步驟(c)中移除。這產生波紋圖案，其中在基板10中的“谷” 10'是圓化的，而分隔相鄰“谷”的“峰”是平坦的。在第二實施方式中，這些“峰”也是圓化的，從而實現更加波浪狀的，即波狀波紋圖案。這顯示在圖9中。在步驟(a)中，在沉積硬-蝕刻掩模50'之前，在基板10上生長氧化物層12'。氧化物層12'和硬-蝕刻掩模50'被圖案化以暴露基板10的在其中將蝕刻波紋“谷” 10'的區(qū)域。接下來，如步驟(b)中所示，硅基板10被各向同性蝕刻至小于最終所需深度的中間深度。該蝕刻不影響硬-蝕刻掩模50'，例如Si3N4掩模50'，并且僅輕微影響氧化物層 12'。在隨后的蝕刻步驟(c)中，硬-掩模層50'下面的氧化物12'被蝕刻，例如通過由 NH4F/HF的混合物組成的緩沖的氧化物蝕刻。注意將需要一定量的“過蝕刻”。接下來，在蝕刻步驟(d)中硅再次被各向同性蝕刻。由于各向同性蝕刻優(yōu)先攻擊尖銳的硅拐角，該步驟將導致波狀的硅圖案。在步驟(e)中移除硬掩模50'和殘存的氧化物層12'后，裝置制造可以如圖7及其詳細解釋中的描述繼續(xù)進行。所述波狀圖案可以通過調節(jié)圖案間的間距(Pitch)和氧化物層12'的厚度進行優(yōu)化。如圖10中所示，通過使用LOCOS可以得到具有更細間距的“波狀”波紋結構。僅由于LOCOS技術為本領域技術人員所公知，所以這將進行簡要描述。在步驟(a)中，提供承載有適宜的由墊氧化物12 ‘和LPCVD沉積的Si3N4硬掩模層50 ‘組成的LOCOS疊層的硅基板10。該疊層被圖案化以暴露基板10的將形成波紋10'的區(qū)域。在步驟(b)中，硅基板的暴露區(qū)域被熱氧化以形成熱氧化物層52。Si3N4硬掩模層50'將不會被氧化；然而在Si3N4 硬掩模層50'的邊緣，熱氧化物層52將在氮化物下面延伸，即形成與LOCOS氧化相關的公知的鳥嘴(birds beaks)。所述鳥嘴的大小和形狀由墊氧化物(pad-oxide)層12'、Si3N4硬掩模層50'的厚度以及氧化條件決定。通過優(yōu)化這些條件和波間的間距，在步驟(c)中移除Si3N4硬掩模層50'以及在步驟(d)中移除氧化物后將得到波紋結構。可選擇地，波紋硅圖案可使用灰度光刻(gray-scale lithography)或使用抗蝕劑流動(resist flow)得到。應該提及的是，纖連蛋白或任何其它適合的粘合劑，可以通過壓印、結合光刻的噴涂施加。在一個優(yōu)選的實施方式中，纖連蛋白通過噴墨印刷施加。粘性纖連蛋白圖案優(yōu)選地在可拉伸疊層上放置容器后施加，之后心肌細胞被施加于該粘性圖案。進一步指出的是，除了電極之外電極陣列可以補充有許多傳感器。這種傳感器的非限制性實例包括可以測量由心肌細胞收縮導致的力的量的應變計，和可以測量這些細胞產生的熱的量的微熱量計。最后應該指出的是，雖然本發(fā)明裝置的實施方式被顯示為僅在圖案化的導電層18 中包含無源器件(passive device)，在其中形成的電極陣列作為選擇可以包含用于形成電路的有源器件(active device)，其例如可以執(zhí)行信號放大和信號整形功能。
應該理解的是，本發(fā)明的裝置使得能夠測量心肌細胞離子通道活性以檢測QT延長，即代表心室去極化和隨后復極化持續(xù)時間的間期的延長，從QRS復合波的開始到心律T 波的結束測量，以及心臟細胞中的其它電生理異常。相比于在穩(wěn)態(tài)系統中進行的電生理測量，其中沒有考慮由于在心臟舒張期期間左心室填充引起的被動心肌細胞拉伸的影響，本發(fā)明的裝置可以用于開發(fā)能夠準確模擬多種心律不齊的心臟細胞模型，例如由以下引起的心律不齊在體力消耗(physical exertion) 期間發(fā)生的長QT綜合癥，或者與增加的心輸出量相關的病理生理狀況(像發(fā)燒、貧血)， (當心率、舒張末期心室容積和填充壓力均增加引起所需的心輸出量增加時)。心室壁心肌細胞的拉伸水平和心肌細胞收縮力之間的直接關系在 Frank-Marling定律中描述。隨著增加的拉伸，收縮力增加直到達到進一步的拉伸引起心輸出量減少的點。這已被描述為機電反饋(electromechanical feedback)。心肌細胞的這種(病理)生理拉伸在離子通道活性和易發(fā)心律不齊中起作用。本發(fā)明的可拉伸裝置使得在心肌細胞拉伸和收縮的受控(病理)生理條件下測量離子通道活性成為可能。如上所述的離子通道活性的這種測量可以在特定的心臟病模型中執(zhí)行，例如用于肥厚型心肌病和心力衰竭的疾病模型。心臟心室壁中的心肌細胞的長時間的過度拉伸(與增加的心臟負荷相關)導致肥大，潛在地導致心力衰竭。施加于粘附在本發(fā)明裝置可拉伸疊層上的心肌細胞的受控拉伸-收縮循環(huán)的較長周期(施加了過度的被動拉伸)，預期引起心肌細胞肥大并且模擬心力衰竭，并且離子通道活性和收縮力的連續(xù)紀錄可以顯示關于潛在的發(fā)病機制的信息。上述肥厚型心肌病的模型系統可以用于藥物靶標發(fā)現，即鑒定在疾病過程中起原因作用的特定藥物靶標分子以及可用于治療所述疾病的化合物的發(fā)現，以及用于藥物研發(fā)。顯然，化學化合物的心臟毒性也可以在這種疾病狀態(tài)中檢測。上述疾病模型可以通過將活的心肌細胞暴露于以指示所模擬的疾病的濃度含有血液中存在的溶質例如電解質、02、CO2、葡萄糖等等的溶液來實施。因此，心肌細胞對這些溶質的反應可以用于獲得模擬的疾病對這些細胞的影響的更好的理解。為由細胞拉伸引起或改變的疾病開發(fā)疾病模型的方法包括以下步驟-將至少一個細胞連接至粘性表面圖案04)-通過外部施加的力拉伸所述至少一個細胞-以電學方式和/或以光學方式測量所述至少一個細胞的動作電位，隨時間監(jiān)控和/或解析所述動作電位。為發(fā)展并構建用于藥物靶標發(fā)現和藥物研發(fā)和藥物毒性測量的疾病模型，執(zhí)行一些試驗步驟1.根據已有方案，生產/培養(yǎng)代表患病組織的所需活細胞。它們可以直接從細胞系或從動物或人類組織源獲得，并且準備用于培養(yǎng)。它們也可以從已被誘導分化成所需的細胞類型的動物或人類干細胞獲得。2.在上面描述的裝置的表面上，可以沉積或印刷纖連蛋白或其它細胞外基質或其它粘性層，以使細胞連接至所述表面并保持存活。3.所需要數量的細胞(根據表面積和細胞種類)被安放在前面描述的基板上，并且在正確的培養(yǎng)基中維持在健康的存活條件，以測定某些細胞特異性變量，像離子通道活性或電動作電位(electric action potential)。
4.有時可能需要額外的或重復的動作/程序以進一步發(fā)展所述疾病模型，有時這可能需要一次、連續(xù)或重復拉伸細胞至它們原始長度的100-200%或更長，在面內或以(通常)拉伸到面外的方式，模仿所需的疾病狀況。有時更短或更長的拉伸周期后接著規(guī)定的松弛期。在該過程中，測量細胞的動作電位，并且關于涉及產生了生成電勢改變的離子流 (ion fluxes)的一個或多個膜離子通道的活性進行解析。5. 一個或多個疾病-特異性變量被測量以證實疾病模型類似于實際疾病到其可以用于藥物靶標發(fā)現、藥物研發(fā)和藥物毒性的程度。6.為了藥物靶標發(fā)現、藥物研發(fā)或藥物毒性的目的，細胞將以與中的描述相同的方式被拉伸，以至拉伸發(fā)生在面內或(大部分)在面外并且連續(xù)監(jiān)測并解析動作電位。 在該過程中可以添加需要研究的化學或生物化學化合物。7.完成試驗的拉伸部分后，可以在細胞上執(zhí)行一些其它的測量，像DNA/RNA/蛋白 /代謝物分析，以研究加入的化合物或其它細胞環(huán)境的改變，像PH或電解質、葡萄糖、氧氣或營養(yǎng)補充物或代謝物濃度改變，對細胞功能/活性/成活力的影響。可以以這樣的方式創(chuàng)建的疾病模型可根據以下被分為一些類型-所需的拉伸百分比，其或者通過體內發(fā)生的生理拉伸決定，例如在心臟跳動過程中，當心肌細胞和內皮細胞被拉伸至生理水平，取決于每次跳動的心輸出量/血壓；或者通過病理生理拉伸決定，像例如發(fā)生在腫瘤或腦內出血或硬膜下血腫中。-拉伸發(fā)生在面外的水平。例如對于模擬跳動心臟的模型，心肌細胞層在拉伸過程中必須被推出面外，并且在心跳舒張期返回面內。如果模型例如模擬心力衰竭，則心肌細胞將更加廣泛地拉伸出面外以模擬增加的血液對心室的填充，超過Frank-Marling曲線的頂點。對于生長的腫瘤模型中的拉伸，拉伸將更加在面外。-隨時間施加拉伸的方式一次短的、連續(xù)較長時間的或重復的。在心臟或內皮模型中拉伸被重復施加。例如，在腫瘤模型中拉伸是連續(xù)并增加的。例如，在腦內出血模型中， 拉伸是短的并且迅速增加到高/最大水平。-施用拉伸的時間周期例如具有在不同情況下心跳頻率的間歇(拉伸-收縮周期)；或者在腦中硬膜下血腫模型的情況下，在幾個小時期間拉伸緩慢增加；在腦內出血模型的情況下，幾小時內拉伸快速增加，在腦腫瘤模型的情況下非常緩慢。-個體細胞之間粘附的類型。拉伸降低細胞間粘附的程度取決于粘附分子連接的強度和調節(jié)這些連接的細胞過程。例如在癌模型的情況下，模擬癌細胞中特定致病改變需要的拉伸水平將被調節(jié)到細胞間粘附的強度，其對于不同的腫瘤可能是特異性的，這樣細胞層上的電阻被降低。上面描述的開發(fā)疾病模型的方法非常適合于那些由細胞拉伸引發(fā)或改變的疾病， 導致異常的動作電位或離子通道功能。實例是內皮疾病(endothelial diseases)如動脈粥樣硬化和高血壓和偏頭痛；神經系統疾病(neurological diseases)如揮鞭傷、震蕩、腦腫瘤、腦內出血和硬膜下血腫；肌肉疾病如Ducherme，和胃腸疾病如腸易激綜合癥。需要注意的是，上面提及的實施方式說明而不限制本發(fā)明，并且本領域技術人員能夠設計許多可選的實施方式而不偏離附加的權利要求的范圍。在權利要求中，任何置于括號中的附圖標記將不解釋為限制權利要求。詞語“包含”不排除列于權利要求中的那些之外的要素或步驟的存在。在要素前的詞語“a”或“an”不排除存在多個這種要素。某些措施在相互不同的從屬權利要求中被描述的簡單事實并不表示不能有利地使用這些措施的組合。
權利要求
1.用于測定化學化合物的心臟毒性的裝置，包含-承載有可變形疊層(34)的基板(10)，所述疊層通過空腔(3 從所述基板部分地分離以允許所述疊層的面外變形，所述疊層包含第一可變形層(16)、第二可變形層00)和夾在所述第一和第二可變形層間的多電極結構(18)，所述第二可變形層承載有粘附到其上的心肌細胞08)的圖案；以及-安裝在所述基板上的液體容器(26)，用于使所述心肌細胞暴露于所述化學化合物。
2.權利要求1所述的裝置，其中所述可變形疊層(34)的一端從所述基板(10)分離以方便當所述心肌細胞(28)收縮時所述疊層的面外變形。
3.權利要求1所述的裝置，其中 -在所述基板(10)中形成所述空腔(32)； -所述疊層(34)在所述空腔上方延伸，并且-所述疊層的相對端連接到所述基板(10)，從而方便所述疊層(34)的由外部施加的力導致的面外變形。
4.權利要求3所述的裝置，進一步包含用于用流體填充所述空腔(32)的進口(36， 120)。
5.權利要求4所述的裝置，其中所述疊層(34)包含進口(120)。
6.權利要求3所述的裝置，其中所述心肌細胞08)的圖案是放射狀圖案。
7.權利要求3所述的裝置，其中所述疊層(34)是波紋狀的。
8.根據上述任一項權利要求所述的裝置，其中所述疊層(34)的面外變形大于30%。
9.制造根據權利要求1的裝置的方法，包括在所述基板(10)上生長氧化物層(12)； -在所述氧化物層上沉積所述第一可變形層(16)；-在所述第一可變形層上沉積并圖案化導電層(18)，從而形成所述多電極結構；-在所述第一可變形層上沉積第二可變形層00)；-圖案化所述第二可變形層以提供到所述多電極結構的通路；-在圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案04)；-將心肌細胞08)粘附至所述粘性圖案；-將所述液體容器06)粘附至所述第二可變形層；以及-在所述第一可變形層下面形成所述空腔(32)。
10.權利要求9所述的方法，其中在所述圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案04) 和將心肌細胞08)粘附至所述粘性圖案的步驟在所述空腔(3 在所述第一可變形層下面形成之后進行。
11.權利要求10所述的方法，其中形成所述空腔(32)包括-在所述第一可變形層(16)的沉積前，在所述氧化物層(1 上沉積犧牲層(14)，所述犧牲層限定空腔體積；以及-在所述第二可變形層OO)的沉積后除去所述犧牲層。
12.權利要求10所述的方法，其中形成所述空腔(32)包括 -在所述基板(10)的背面上生長掩模(50)；-圖案化所述掩模以限定空腔區(qū)域；-蝕刻所述基板的背面以暴露所述第一可變形層(14)；以及-從所述基板的背面移除所述圖案化的掩模。
13.權利要求12所述的方法，進一步包括在形成所述氧化物層(1 前在所述基板 (10)中形成波紋狀圖案(10')。
14.權利要求13所述的方法，其中形成所述波紋狀圖案包括 -在所述基板(10)上沉積氧化硅層(12')；-在所述氧化硅層上沉積氮化硅層(50')； -圖案化所述氧化硅層和氮化硅層，從而暴露所述基板的選定部分； -將所述選定的部分暴露至一系列蝕刻步驟以形成所述波紋狀圖案；以及 -移除所述氧化硅層和氮化硅層。
15.權利要求13所述的方法，其中所述波紋狀圖案通過以下方式形成L0C0S氧化步驟，隨后是其中移除LOCOS氧化物的蝕刻步驟。
16.測定化學化合物的心臟毒性的方法，包括 -提供權利要求1-8中任一項所述的裝置；-用含有所述化學化合物的介質填充所述容器06)以使所述心肌細胞08)暴露于所述化合物；以及-測量所述心肌細胞對所述暴露的反應。
17.根據權利要求1-8任一項所述裝置用于藥物靶標發(fā)現和/或藥物開發(fā)的用途。
18.為由細胞拉伸導致或改變的疾病開發(fā)疾病模型的方法，所述方法包括以下步驟 -將至少一個細胞附著至粘性表面圖案04)-通過外部施加的力拉伸所述至少一個細胞-以電學方式和/或光學方式測量所述至少一個細胞的動作電位，隨時間監(jiān)測和/或解析所述動作電位。
19.根據權利要求18的方法，其中所述至少一個細胞的所述拉伸相對于所述粘性表面圖案是在面內和/或面外。
20.根據權利要求18-19的方法，其中面內細胞拉伸百分比大于30%并且拉伸時間是變化的。
21.根據權利要求18-20的方法，其中在測量期間添加化學或生物化合物。
22.根據權利要求18-21任一項的方法，其中所述疾病模型是心臟疾病模型。
全文摘要
公開的是用于測定化學化合物心臟毒性的裝置，包含承載有可變形疊層(34)的基板(10)，所述疊層通過空腔(32)從所述基板部分分離以允許所述疊層的面外變形，所述疊層包含第一可變形層(16)、第二可變形層(20)和夾在所述第一和第二可變形層間的多電極結構(18)，所述第二可變形層承載有粘附其上的心肌細胞(28)的圖案；以及安裝在所述基板上的液體容器(26)，用于使所述心肌細胞暴露于所述化學化合物。還公開了制造這樣的裝置的方法。本發(fā)明進一步涉及所述裝置用于藥物靶標發(fā)現和/或藥物開發(fā)的用途以及為由細胞的拉伸導致或改變的疾病開發(fā)疾病模型的方法，特別是心臟疾病模型。
文檔編號C12N5/00GK102333856SQ201080007261
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權日2009年2月9日
發(fā)明者德 斯托爾佩 A·范, R·德克 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司