一種誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的β1腎上腺素受體單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種β1-AA單克隆抗體，所述單克隆抗體利用以下兩條多肽作為免疫原產(chǎn)生，多肽1：序列與HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性為85％至100％的多肽；多肽2：序列與CHWWRAES?DEARR同一性為85％至100％的多肽。本發(fā)明使用兩條肽段進行免疫，其中多肽1段為β1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)的氨基酸序列，但免疫原性較低；而多肽2段為針對多肽1段設(shè)計的免疫原性較高的肽段。因此，用這兩條肽段分別免疫，在保證獲得正確抗體的同時也提高了免疫原性。針對β1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)、且與臨床病人血清中存在的β1-AA具有相同的生物學(xué)效應(yīng)的單克隆抗體首次制備成功，使用該單克隆抗體進行科學(xué)研究可以得到更可靠的實驗結(jié)果。
【專利說明】—種誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的β1腎上腺素受體單克隆抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新型的導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的β I腎上腺素受體單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]P1腎上腺素受體自身抗體是一種針對P1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)產(chǎn)生的自身抗體，它主要存在于擴張性心肌病、恰加斯病以及心衰等多種心血管疾病中。研究發(fā)現(xiàn)，β !腎上腺素受體自身抗體對于研究心血管疾病的免疫學(xué)機制具有重要意義，且該自身抗體可以直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡(Daniel Jane-wit等，Betal-adrenergic receptorautoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonisticalIy inducingcardiomyocyte apoptosis.Circulation.2007 ；116:399-410.)。以往的研究中運用的自身抗體多為從血清中獲得的多克隆抗體。通過純化抗體分子可提高多克隆抗體的滴度。根據(jù)抗體與靶分子的相互作用，將抗體從蛋白質(zhì)混合物中分離出來。
[0003]已經(jīng)有人采用MAb Trap Kit試劑盒，從β 1_ΑΑ為陽性的血清中提純總IgG，雖然其中以抗β ^AR抗體為主，并可以通過β丨-AR特異性阻斷劑metoprolol和人工合成的β ^AR-EC11抗原肽段間接驗證效應(yīng)主要是由抗P1-AR抗體引起(Antonio S.Tutor等.2007.Ant1-β 1-adrenergic receptor autoantibodies are potent stimulators ofthe ERK1/2 pathway in cardiac cells.Cardiovascular Research76:51-60.)。該方法提純的抗體為血清中 總的IgG，并不是特異針對P1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)，無法排除其他IgG的干擾。
[0004]還有一種方法從血清中提純總的IgG，經(jīng)過掛有β !-AR-EC11抗原肽段的特異性親和柱，以便提純血清中高純度的抗β !-AR抗體(Wallukat G等1995.Ant1-beta1-adrenoceptor autoantibodies with chronotropic activity fromtheserum of patients with dilatedcardiomyopathy:mapping of epitopes inthe firstand second extracellular loops.J Mol Cell Cardiol.27 (I):397-406)。通過此方法雖能得到特異性針對P1-AR-EC11的抗體，但得到的β「ΑΑ的濃度過低無法進行后續(xù)實驗，且經(jīng)濟成本太高,因此,該技術(shù)應(yīng)用并不廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明構(gòu)建一種針對β rAR細(xì)胞外第二環(huán)并且與心衰患者血清中的β !-AA具有相同生物學(xué)效應(yīng)的新型β !-AA單克隆抗體。
[0006]該新型β rAA單克隆抗體通過以下方法獲得:首先設(shè)計合成抗原肽段，并將肽段進行偶聯(lián)；免疫小鼠，獲得血清；監(jiān)測血清，制備單克隆雜交瘤細(xì)胞株；篩選特異性單克隆抗體，選取雜交瘤細(xì)胞株擴大培養(yǎng)，接種小鼠，收集腹水并Protein G純化。
[0007]該抗體以單一的親和性和特異性與β !腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)結(jié)合，可有效排除其他抗體的干擾，并且與臨床病人血清中存在的β rAA具有相同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，使用該單克隆抗體進行科學(xué)研究可以得到更可靠的實驗結(jié)果。
[0008]本發(fā)明使用了兩條肽段進行免疫，其中多肽I段為β i腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)的氨基酸序列，但免疫原性較低；而多肽2段為針對多肽I段設(shè)計的免疫原性較高的肽段。因此，用這兩條肽段分別免疫，在保證獲得正確抗體的同時也提高了免疫原性。
[0009]針對β I腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)、且與臨床病人血清中存在的β rAA具有相同的生物學(xué)效應(yīng)的單克隆抗體首次制備成功。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1: β「AR細(xì)胞外第二環(huán)的單克隆抗體的構(gòu)建。圖1的A顯示了 ELISA檢測雜交瘤細(xì)胞上清液中β rAA的含量,其中，< 0.01vs載劑組；η = 3/組；圖1的B顯示了蛋白質(zhì)印記檢測β rAA單克隆抗體與H9C2細(xì)胞表面β rAR的結(jié)合，η = 3，其中β rAA是制備合成的β rAA單克隆抗體。
[0011]圖2:激光共聚焦技術(shù)檢測β 1-AA單克隆抗體與心肌細(xì)胞的表面的β ι-AR的結(jié)合情況。
[0012]圖3:乳鼠心肌細(xì)胞跳動頻率實驗檢測P1-AA單克隆抗體的功能，其中心衰病人載劑組是來自β rAA陰性心衰病人血清中的總IgG，η = 3 ;心衰病人β rAA組是來自β j-AA陽性心衰病人血清中的總IgG,η = 3 ;單克隆抗體載劑組是生理鹽水對照組,η = 3 ；單克隆抗體β rAA組是制備合成的β ι_ΑΑ單克隆抗體，η = 3。
[0013]圖4 J1-AA單 克隆抗體誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2凋亡，A是細(xì)胞流式結(jié)果圖(各小圖右下象限結(jié)果為凋亡率)，Β是統(tǒng)計柱狀圖，圖中#Ρ < 0.01vs.載劑組；η = 4/組；其中對照組為溶劑對照組，β rAA組為β rAA刺激組，肽組為β !-AR-EC11肽段組，上清組為β rAA和^1-AR-EC11共同刺激組。
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明的新型P1-AA單克隆抗體通過包括以下步驟的方法制備:1.抗原多肽的合成；2.利用所合成的抗原多肽通過雜交瘤細(xì)胞融合的方法制備單克隆抗體。
[0015]本發(fā)明中，抗原多肽的合成可以為以下合成:根據(jù)人β !腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)的氨基酸序列，合成兩條抗原肽段，其中多肽1:序列與HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性為85%至100%的多肽；多肽2:序列與CHWffRAES DEARR同一性為85%至100%的多肽。
[0016]本發(fā)明所用的兩條抗原肽段中，多肽I為序列與HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性為85%至100%的多肽，優(yōu)選90%至100%，更優(yōu)選95%至100% ;多肽2序列與CHWffRAES DEARR同一性為85%至100%的多肽，優(yōu)選90%至100%，更優(yōu)選95%至100%。
[0017]將合成的多肽用于雜交瘤細(xì)胞融合的方法來制備單克隆抗體:1)將多肽I和多肽2分別偶聯(lián)至載體蛋白KLH、BSA作為免疫原；2)使用偶聯(lián)制備的兩種免疫原分別免疫多只小鼠，制備多抗血清；3)以多抗血清進行生物活性驗證；4)選擇其中滴度最高的1-2只小鼠，分別進行融合，制備單克隆雜交瘤細(xì)胞株；5)對所獲得的雜交瘤細(xì)胞通過ELISA方法進行篩選，挑選出I~5株高親和力的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并將其擴大培養(yǎng)；6)挑選的I株克隆，接種小鼠，收集腹水并Protein G純化。用ELISA、蛋白質(zhì)印記及激光共聚焦技術(shù)檢測β rAA單克隆抗體與細(xì)胞表面β !-AR的結(jié)合。
[0018]雜交瘤技術(shù)是1975年k0hler和miIstein首先報道的，他們用細(xì)胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞(srbc)免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立起第一個b細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，并成功地制得抗srbc的單克隆抗體(monoclonal antibody, mcab)。迄今世界已研制成數(shù)以千計的mcab。
[0019]采用雜交瘤技術(shù)獲得的單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易。
[0020]細(xì)胞的選擇與融合
[0021]建立雜交瘤技術(shù)的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的b細(xì)胞,通常來源于免疫動物的碑細(xì)胞。脾是b細(xì)胞聚集的重要場所,無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不斷增殖，只有腫瘤細(xì)胞才具備這種特性。選擇同一體系的細(xì)胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是b細(xì)胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細(xì)胞融合伴侶。目前常用的 b 細(xì)胞瘤株有:p3_x63_ag8 (kohlerandmi I stein, 1975), p3-nsi/l-ag4_l (kohlerandmilstein, 1976)，x63_ag8.563(kearneyetal, 1979)，sp2/0_agl4(schulmanetal,1978)等，這些細(xì)胞株皆為hat敏感細(xì)胞株。
[0022]有限稀釋與抗原特異性選擇
[0023]在動物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇,一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實質(zhì)是眾多b細(xì)胞群的抗體分泌。而針對目標(biāo)抗原表位的b細(xì)胞只占極少部分。由于細(xì)胞融合是一個隨機的過程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中，有相當(dāng)比例的無關(guān)細(xì)胞的融合體，需細(xì)篩選去除。篩選過程一般分為兩步進行:一是融合細(xì)胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進行的特異性抗體篩選。將融合的細(xì)胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在O至數(shù)個細(xì)胞之間(30%的孔為O才能保證每個孔中是單個細(xì)胞)，培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞；這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細(xì)胞再進行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的elisa找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。
[0024]經(jīng)過ELISA、蛋白質(zhì)印記及激光共聚焦技術(shù)檢測確認(rèn)的本發(fā)明單克隆抗體通過以下方式來檢驗生物學(xué)功能:乳鼠心肌細(xì)胞跳動頻率實驗評價P1-AA單克隆抗體的功能。Annexin V/PI雙染經(jīng)流式檢測β ^AA單克隆抗體對心肌細(xì)胞H9C2凋亡的影響。ELISA檢測結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞上清液中β ^AA的含量明顯高于對照組(2.9896±0.1873vs.0.0635±0.0386，P < 0.01)(圖1A);而蛋白質(zhì)印記的結(jié)果也證實，β ^AA單克隆抗體與商業(yè)化抗-β 1-AR多克隆抗體陽性對照具有相同分子量的條帶(圖1B);激光共聚焦結(jié)果表明，β rAA單克隆抗體可以與H9C2細(xì)胞表面的β rAR結(jié)合(圖2);而乳鼠心肌細(xì)胞跳動頻率實驗也發(fā)現(xiàn)，β ^AA單克隆抗體與心衰病人血清中的β i_AA具有相同的生物學(xué)效應(yīng)，均可使增加乳鼠心肌細(xì)胞跳動頻率(圖3)。以上`結(jié)果均提示:針對β rAR細(xì)胞外第二環(huán)的單克隆抗體已構(gòu)建成功。Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示:β ^AA單克隆抗體可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2發(fā)生凋亡(圖4)。
[0025]實施例
[0026]實施例1:肽段合成:[0027]根據(jù)人β i腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)的氨基酸序列，合成兩條抗原肽段，其中多肽 I 序列為 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC ;多肽 2 序列為 CHWffRAES DEARR。
[0028]實施例2:通過雜交瘤細(xì)胞融合的方法合成單克隆抗體:
[0029]I)將多肽I和多肽2分別偶聯(lián)至載體蛋白KLH、BSA作為免疫原；
[0030]2)使用兩種免疫原分別免疫3只小鼠，制備多抗血清；
[0031]3)以多抗血清進行生物活性驗證；
[0032]4)選擇其中滴度最高的1-2只小鼠，分別進行融合，制備單克隆雜交瘤細(xì)胞株；
[0033]5)對所獲得的雜交瘤細(xì)胞通過ELISA方法進行篩選，挑選出I~5株高親和力的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并將其擴大培養(yǎng)；
[0034]6)挑選的I株克隆,接種小鼠，收集腹水并Protein G純化。
[0035]實施例3:所獲得的單克隆抗體的生物學(xué)活性測試
[0036]用ELISA、蛋白質(zhì)印記及激光共聚焦技術(shù)檢測β ^AA單克隆抗體與細(xì)胞表面β rAR的結(jié)合。
[0037]乳鼠心肌細(xì)胞 跳動頻率實驗評價β rAA單克隆抗體的功能。
[0038]Annexin V/PI雙染經(jīng)流式檢測β rAA單克隆抗體對心肌細(xì)胞H9C2凋亡的影響。
[0039]ELISA檢測結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞上清液中β「AA的含量明顯高于對照組(2.9896±0.1873vs.0.0635±0.0386，P < 0.01)(圖 1Α);而蛋白質(zhì)印記的結(jié)果也證實，?^-ΑΑ單克隆抗體與商業(yè)化抗-P1-AR多克隆抗體陽性對照具有相同分子量的條帶(圖1Β);激光共聚焦結(jié)果表明，P1-AA單克隆抗體可以與H9C2細(xì)胞表面的P1-AR結(jié)合(圖2);而乳鼠心肌細(xì)胞跳動頻率實驗也發(fā)現(xiàn)，P1-AA單克隆抗體與心衰病人血清中的P1-AA具有相同的生物學(xué)效應(yīng)，均可使增加乳鼠心肌細(xì)胞跳動頻率(圖3)。以上結(jié)果均提示:針對β !-AR細(xì)胞外第二環(huán)的單克隆抗體已構(gòu)建成功。
[0040]Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示:β ^AA單克隆抗體可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2發(fā)生凋亡(圖 4)。
【權(quán)利要求】
1.一種P1-AA單克隆抗體，所述單克隆抗體利用以下兩條多肽作為免疫原產(chǎn)生， 多肽 1:序列與 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC 同一性為 85%至 100%的多肽； 多肽2:序列與CHWffRAES DEARR同一性為85%至100%的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的β「ΛΑ單克隆抗體，所述抗體通過雜交瘤融合方法制備。
3.如權(quán)利要求2所述的P1-AA單克隆抗體，所述雜交瘤融合方法包括以下步驟: 1)將多肽I和多肽2分別偶聯(lián)至載體蛋白KLH、BSA作為免疫原； 2)使用步驟I)獲得的兩種免疫原分別免疫多只小鼠，制備多抗血清； 3)驗證多抗血清的生物活性； 4)選擇其中多抗血清滴度最高的I至2只小鼠，分別取脾細(xì)胞進行融合，制備單克隆雜交瘤細(xì)胞株； 5)對所獲得的雜交瘤細(xì)胞通過ELISA方法進行篩選，挑選出I~5株高親和力的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并將其擴大培養(yǎng)； 6)挑選的I株克隆，接種小鼠，收集腹水并ProteinG純化。
4.如權(quán)利要求1所述 的P1-AA單克隆抗體，所述多克隆抗體的序列與權(quán)利要求3所述方法制備的抗體的序列具有 85%至100%的序列同一性。
【文檔編號】C07K16/28GK103626873SQ201310687137
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】劉慧榮, 杜蕓輝, 李笑, 張?zhí)K麗, 商建宇, 馬新亮 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)