專利名稱：基于siRNA的細胞特異性有效的分子和用于制備其的應(yīng)用試劑盒及其用途的制作方法
基于siRNA的細胞特異性有效的分子和用于制備其的應(yīng)用
試劑盒及其用途
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及基于“短干擾RNA”(siRNA)的特異性生物學有效分子。當激活后， 所述生物學有效分子與靶基因的RNA相互作用，并與特定的內(nèi)切核糖核酸酶形成稱為 “RISC” (RNA誘導的沉默復(fù)合物)的RNA蛋白復(fù)合物。RISC復(fù)合物結(jié)合靶mRNA，并且內(nèi)切核酸酶切割靶mRNA。以這種方式抑制了基因表達，并由此防止形成靶蛋白?？梢允褂媚軌蚣毎禺愋约せ畹纳飳W有效分子在例如衰老特異性治療中等來防止異常細胞并抑制它們的生長，特別是治療腫瘤和病毒感染。通常，能夠細胞特異性激活的生物學有效分子可以用于調(diào)節(jié)靶細胞的基因表達。但是通過生物學活性分子，其不僅可以降低基因的表達，還可以通過降低靶基因的負調(diào)節(jié)基因表達來增加基因表達。已經(jīng)描述了在真核細胞中通過引入短(19_23bp)雙鏈RNA分子(siRNA)來抑制基因表達，該RNA分子對靶基因的mRNA序列片段是特異性的Elbashir SM et al. Duplexes of 21—nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells,Nature,2001 May 24，411(6836)，494-8 ;Liu Y et al. =Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb. 24，43 (7)，1921-7 ；US 5, 898, 031 ；US 7,056,704)。此類分子并不抑制基因的閱讀和mRNA的產(chǎn)生，但是siRNA引發(fā)破壞靶mRNA的細胞自身的機制。最后，抑制了特定蛋白的形成而不破壞其他基因的表達(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)。為了抑制基因的表達，可以通過轉(zhuǎn)染試劑和電穿孔將siRNA直接引入細胞。Ghang M et al. DownreguIation enhanced green fluorescence protein gene expression by RNA interference in mammalian cells, RNA Biol.2004 May, 1(1) ,74-7 ；Gilmore IR et al. :Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing, Epub 2004 May 22.， Curr Drug Deliv.2006 Apr. ,3(2), 147-5 ；US 6，506，559)。這種方法的劣勢在于siRNA較不穩(wěn)定，但是這可以通過化學修飾而加以改善(US 6，107，094)。生物學有效分子的治療應(yīng)用中的一個特殊問題是體內(nèi)應(yīng)用。對于此類應(yīng)用已經(jīng)提出了方法來穩(wěn)定 siRNA 以減少分解(Morrissey et. al. =Chemical Modifications of Synthetic siRNA, Pharmaceutical Discovery, May 1, 2005)，并且還開發(fā)了諸如納米顆粒體內(nèi)-jetPEITM(Polyplus)的轉(zhuǎn)染試劑來在體內(nèi)將siRNA引入細胞(Vernejoul et al. Antitumor effect of in vivo somatostatin receptor subtype 2 gene transfer in primary and metastatic pancreatic cancer models, Cancer Research 62,2002, 6124-31 ；Urban-Klein B, Werth S, Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A :RNAi_mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine(PEI)-complexed siRNA in vivo, Gene Ther 12 (5),2005,461-6.).而且，還開發(fā)了方法來在體內(nèi)增加靶細胞的siRNA細胞轉(zhuǎn)染(Ikeda et. al.Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA, Pharmaceutical Research, Vol.23, No. 8, August 2006)。然而，體內(nèi)施用生物學活性物質(zhì)通常伴隨全身效果的問題。將這些物質(zhì)選擇性引入靶細胞并非足夠特異性的。對于僅對靶細胞具有選擇效果的siRNA分子這尤為不利。通過組織或細胞特異性標記的轉(zhuǎn)染試劑(如抗體/抗原-標記的納米顆粒、TAT蛋白側(cè)翼等) 并未實現(xiàn)足夠高的細胞特異性。結(jié)果是錯誤的轉(zhuǎn)染。另一種已知方法是通過偶聯(lián)熒光染料來使siRNA的生物學效果失活，并通過用特定波長的光照射所述分子來將所述分子再轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊幕钚越Y(jié)構(gòu)。(QN Nguyen et al. Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells, Biochim Biophys Acta，2006)。這種激活從外部引發(fā)，并且無論如何都不是細胞特異性的。 因此，所述siRNA分子在激活后不僅在相應(yīng)靶細胞中具有效果，而且意外地在所有其他轉(zhuǎn)染細胞中具有效果。而且，也難以在體內(nèi)應(yīng)用這種機制。還已知通過偶聯(lián)形成的肽來使SiRNA的生物學效果失活，從而這些肽在靶細胞中通過靶細胞特異性活性肽酶而被分離，而它們在非靶細胞中保持無活性 (W0002008098569A2)。以這種方式可以高選擇性地激活靶細胞中基于siRNA的分子而不存在所述分子對其他細胞的細胞功能的不利效果。實踐證實，SiRNA與肽的連接并非不存在問題，而且在分離一個或多個肽后，保留在siRNA上的接頭(linker)或者剩余的肽殘基破壞靶細胞中siRNA的效力。盡管siRNA 在肽偶聯(lián)時有效地失活，但是在肽分離后保留在siRNA上的經(jīng)檢驗的接頭以及可能的所述肽殘基對引入RNA干擾具有不利效果，因而破壞siRNA的生物學效力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是產(chǎn)生siRNA與一個或多個肽之間的連接，其中所述siRNA在肽分離后被激活而剩余的接頭和/或剩余的肽殘基不會顯著地破壞細胞中激活的siRNA的生物學效力。根據(jù)本發(fā)明，提供了特別的氨基Cn接頭(Cn = C1、C2、C3、C4、C5或C6)，例如氨基 C6接頭，由此siRNA在其3’和/或5’端共價偶聯(lián)至至少一個肽。這種共價偶聯(lián)使生物學有效siRNA分子失活。因此，特異性基因表達在轉(zhuǎn)染此類失活分子后未受抑制，只要甚至僅有一個偶聯(lián)的肽保留在siRNA分子上，這是由于不存在特異于靶細胞特的相應(yīng)酶。為了激活生物學有效分子，將一個或多個肽從siRNA分離，并且氨基Cn接頭以及可能的肽殘基保留在siRNA上。即使本發(fā)明的特別的接頭在所述一個或多個肽的分離后仍保留在siRNA上(以及可能的肽殘基在分離后也保留在siRNA上)，還是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)保留的接頭以及可能的所述保留的肽殘基對所分離分子的經(jīng)激活siRNA的效力幾乎沒有不利影響(或者如果有不利影響也是不明顯的)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會預(yù)期到保留在siRNA上的該分子的任何部分會降低siRNA的生物學效力。接頭，即提供給siRNA分子的氨基Cn接頭本身是已知的， 但是尚未用于可分離肽的偶聯(lián)。甚至本領(lǐng)域技術(shù)人員也不了解此類應(yīng)用。在本發(fā)明中，不被靶細胞的細胞特異性酶破壞的基于siRNA的分子(見W0002008098569A》在轉(zhuǎn)染入或轉(zhuǎn)染至靶細胞后，可靠地保持無活性，并且在分子斷裂時被激活而具有SiRNA的生物學效力。本發(fā)明的創(chuàng)造性效果已經(jīng)通過氨基C6接頭得到證實，而測試表明，所述接頭類型的更小或更大的結(jié)構(gòu)(如氨基02丄3、(4丄5接頭)也可以被使用而具有類似的效果。如已知的，合適的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)例如納米顆?；虬环肿尤缰|(zhì)體可以用于將失活的活性成分分子轉(zhuǎn)染入靶細胞中。在靶細胞中，所述失活的共價鍵可以通過細胞特異性方式由一種或多種細胞特異性酶所斷裂，所述細胞特異性酶與一個或多個偶聯(lián)肽的鍵合序列是相關(guān)的，因此目前在靶細胞中并與肽分離的分子的生物學效力被激活。然后，所述分子偶聯(lián)至靶細胞的特異的mRNA，并因此以也是已知的方式抑制該特異性細胞中的基因表達。在所述分子構(gòu)建體也可以進入的生物體不同于預(yù)定靶細胞的所有其他細胞中，活性分成分子可靠地保持無活性，這是由于不存在一種或多種靶細胞特異性酶而使得生物學有效分子特別是siRNA與一個或多個肽之間的共價鍵被完全(沒有肽鍵被破壞)或部分 (并非所有的肽鍵均被破壞)保留。由于仍然存在共價肽鍵，生物學活性分子不與該細胞的 mRNA連接。盡管，例如在腫瘤治療中，要轉(zhuǎn)染的本發(fā)明的分子構(gòu)建體不僅以它們的失活(偶聯(lián))形式進入或到達腫瘤疾病靶細胞，而且可以到達健康細胞(這在實際治療中幾乎不可避免)，所述分子的生物學效力僅選擇性地在腫瘤疾病靶細胞中或靶細胞處通過該處存在的細胞特異性酶而被激活，而受到活性成分影響的靶基因的表達則有效地被抑制。用于健康細胞繼續(xù)存在的這種基因表達和由此的蛋白形成則不受該活性成分的影響，盡管該分子構(gòu)建體存在于這些非疾病細胞(或?qū)τ陬A(yù)期的生物學效果并非期望的細胞)中，因為它們在那里是永久性無活性的。由于通過靶細胞酶特異性失活/激活而實現(xiàn)的所述分子的高選擇性效力，要轉(zhuǎn)染的具有合適肽偶聯(lián)的生物學失活分子構(gòu)建體可以全身施用。所述分子構(gòu)建體可以偶聯(lián)至其他物質(zhì)(例如作為載體系統(tǒng)的納米顆粒)以保證它們更好的轉(zhuǎn)運和穩(wěn)定。在本發(fā)明中，錯誤的轉(zhuǎn)染是不可避免的，但是錯誤轉(zhuǎn)染的分子，即使它們?nèi)匀皇遣黄谕?，在并非靶細胞的細胞中是生物學失活的。即使靶細胞中或靶細胞處的分子激活，這種狀態(tài)也不會改變，從而生物學效力僅選擇性地在靶細胞中形成，與已知的機制相反，實現(xiàn)了基因表達的高細胞選擇性調(diào)控。而且，還可以考慮使用更小的雙鏈RNA分子代替18_23bp的siRNA分子。具有siRNA與一個或多個肽的共價鍵的此類分子的應(yīng)用可能性還描述于 W0002008098569A2o有利的是使用應(yīng)用試劑盒，其中提供了生物學有效分子，該生物學有效分子要被引入并經(jīng)由可選擇性接頭與選擇性肽偶聯(lián)(見W0002008098569A》。以安瓿形式的所述應(yīng)用試劑盒應(yīng)當含有所有要求的成分，實際上還含有如下的選擇合適的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(如納米顆?；蛑|(zhì))、其他添加劑(如抗體、配體和聚乙二醇)以及一種或多種探針或者具有套管的注射器用于將混合物從安瓿內(nèi)容物中注射入含有靶細胞的介質(zhì)。根據(jù)用于應(yīng)用和施用所述分子的附加說明書，用戶可以制備用于預(yù)期用途的合適應(yīng)用混合物并進行應(yīng)用。此外，能夠用于制備所述生物學有效分子的應(yīng)用試劑盒也是可行的。合適的措施使提供此類應(yīng)用試劑盒，其特異性地用于所選擇的靶細胞和靶基因以
5及用于應(yīng)用的個別范圍(體外或體內(nèi))。


如附圖所示，提供使用氨基C6接頭的實施方案更詳細地解釋本發(fā)明。圖1 通過經(jīng)氨基C6接頭將SiRNA與肽偶聯(lián)而失活的siRNA分子；氨基C6接頭的化學結(jié)構(gòu)圖2 細胞特異性激活的siRNA分子，其中肽鍵被斷裂而氨基C6接頭以及肽殘基保留在siRNA分子上圖3 靶細胞和非靶細胞中胱天蛋白酶-4的酶活性圖4 通過肽抑制的siRNA而使GFP基因表達細胞特異性減少的圖示圖1示出Cn = Cl、C2、C3、C4、C5或C6的氨基Cn接頭的實例，氨基C6接頭的化學結(jié)構(gòu)本身已知。通過這種氨基C6接頭1，siRNA 2與肽3偶聯(lián)以用于其生物學失活(在細胞中siRNA效果的失活)。氨基C6接頭1與siRNA 2通過所述siRNA的反義鏈的5’端而偶聯(lián)。只要所述肽偶聯(lián)至該siRNA分子，siRNA分子保持生物學失活。如圖2所示，如果肽鍵被失活siRNA分子所轉(zhuǎn)染入的靶細胞中的細胞特異性酶所破壞(全部肽3的完全分離)，則剩余的siRNA分子會通過激活分子轉(zhuǎn)染所意圖的siRNA的已知細胞特異性效果而生物學激活(還參見W0002008098569A2)。令人驚訝地，在所述肽鍵的鍛煉后(見圖幻，盡管氨基C6接頭1以及可能的肽3 的殘基保留在siRNA分子的殘基上，仍然發(fā)生這種激活，即所述siRNA 2的生物學效果未被保留在該分子上的氨基C6接頭1和肽4的殘基損害或顯著損害。圖3示出切割酶胱天蛋白酶-4的細胞特異性活性。其中，胱天蛋白酶-4在靶細胞(Jeg-3絨毛膜癌細胞；黑條塊)中是有活性的，但是在非靶細胞(人胚腎，HEK ；亮條塊) 中是無活性的。因此，通過圖1的接頭結(jié)構(gòu)與胱天蛋白酶-4的靶肽偶聯(lián)而被抑制的siRNA 在含有胱天蛋白酶-4的靶細胞中被分離并以這種方式激活。圖4表示當引入無功能的對照siRNA、用于減少GFP基因表達的siRNA以及可以由胱天蛋白酶-4激活的肽抑制siRNA時檢測的熒光強度。熒光的減少與siRNA的生物學活性相關(guān)?？梢杂^察到siRNA在靶細胞(Jeg-3絨毛膜癌細胞；黑條塊)中被激活，因此GFP 基因的表達減少，而在非靶細胞(人胚腎，HEK;亮條塊)中，該基因的表達未減少。即使接頭結(jié)構(gòu)和肽殘基(在這種情況下是與甘氨酸鍵合的氨基C6接頭)仍保留在激活的siRNA 上，該siRNA的效果仍然可以與正常siRNA的效果相當。標示列表1-氨基C6接頭2-siRNA3-用于失活siRNA的肽4-肽殘基
權(quán)利要求
1.基于SiRNA的細胞特異性有效分子，其用于生物學無活性地轉(zhuǎn)染入靶細胞以在其通過結(jié)合至mRNA并形成RISC復(fù)合物而生物學激活之后抑制靶細胞中的基因表達，所述siRNA 通過接頭偶聯(lián)至至少一個肽以用于其生物學失活，并且所述接頭在所述分子的生物學激活后保留在所述siRNA上，其中所述siRNAQ)通過Cn = Cl、C2、C3、C4、C5或C6的氨基Cn 接頭(1)偶聯(lián)至所述至少一個肽(3)。
2.如權(quán)利要求1所述的細胞特異性有效分子，其中氨基C6接頭被提供為氨基Cn接頭。
3.如權(quán)利要求1所述的細胞特異性有效分子，其中氨基C5接頭被用作氨基Cn接頭。
4.如權(quán)利要求1所述的細胞特異性有效分子，其中氨基C4接頭被提供為氨基Cn接頭。
5.如權(quán)利要求1所述的細胞特異性有效分子，其中氨基C3接頭被用作氨基Cn接頭。
6.如權(quán)利要求1所述的細胞特異性有效分子，其中將氨基C2接頭提供為氨基Cn接頭。
7.如權(quán)利要求1所述的細胞特異性有效分子，其中氨基Cl接頭被提供為氨基Cn接頭。
8.如權(quán)利要求1所述的細胞特異性有效分子，其中轉(zhuǎn)染系統(tǒng)共價或非共價地偶聯(lián)至所述生物學有效分子，并且所述至少一個肽通過所述氨基Cn接頭共價偶聯(lián)以用于將所述分子轉(zhuǎn)染入或轉(zhuǎn)染至靶細胞，所述轉(zhuǎn)染系統(tǒng)例如載體系統(tǒng)如納米顆粒、配體/抗體/抗原標記物或分子，如納米顆粒、聚合物或脂質(zhì)，其用于將可選擇性激活的生物學有效分子包被以進行它們的轉(zhuǎn)染，或者基于脂質(zhì)的方法或TAT蛋白側(cè)翼。
9.用于應(yīng)用或施用如權(quán)利要求1-8中一項或多項所述的細胞特異性有效分子的應(yīng)用試劑盒，其由以下部分組成
10.至少一個安瓿(安瓿A)，其含有SiRNA，所述SiRNA偶聯(lián)至用于失活目的經(jīng)選擇的肽，并且氨基Cn接頭偶聯(lián)至所述siRNA ；-至少另一個安瓿(安瓿B)，其含有轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，如納米顆?；蛑|(zhì)； -用于所述安瓿A和安瓿B的內(nèi)容物的稀釋和反應(yīng)緩沖劑；-一種或多種探針或者具有套管的注射器和其他所需材料，其用于將混合物從所述安瓿內(nèi)容物注射入含有所述靶細胞的介質(zhì)，以及 -用于應(yīng)用和施用的說明書。
11.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用試劑盒，其含有至少一種其他物質(zhì)，例如用于所述生物學有效分子半選擇性偶聯(lián)至靶細胞的抗體和/或聚乙二醇鏈，用于錨定所述肽和所述生物學有效分子。
12.用于制備如權(quán)利要求1-8中一項或多項所述的細胞特異性有效分子的應(yīng)用試劑盒，其至少由以下部分組成-一個安瓿(安瓿A)，其含有可以偶聯(lián)至siRNA以用于其失活的一個或多個肽； -一個安瓿(安瓿B)，具有用于將所述一個或多個肽偶聯(lián)至所述siRNA的反應(yīng)緩沖劑； -一個安瓿(安瓿C)，其用于在所述肽偶聯(lián)至所述siRNA后修飾所述肽； -一個安瓿(安瓿D)，具有其他反應(yīng)緩沖劑； -系統(tǒng)，其用于在所述肽偶聯(lián)至所述siRNA后純化亞產(chǎn)物或終產(chǎn)物； -一種或多種注射裝置，如探針或者具有套管的注射器，用于將混合物從所述安瓿內(nèi)容物注射，以及其他所需材料，如滲析膜或反應(yīng)容器；以及 -用于應(yīng)用的說明書。
全文摘要
基于siRNA的細胞特異性有效分子和用于制備其的應(yīng)用試劑盒及其用途。本發(fā)明的目的是產(chǎn)生siRNA與一個或多個肽之間的連接，其中所述siRNA在肽分離后被激活而剩余的接頭和/或剩余的肽殘基不明顯地破壞細胞中激活的siRNA的生物學效力。根據(jù)本發(fā)明，一個或多個肽(3)通過諸如氨基C6接頭(1)的特定氨基Cn接頭偶聯(lián)至siRNA(2)，所述接頭不破壞或僅不明顯地破壞所述siRNA的生物學效力，盡管其保留在siRNA上以及盡管任何肽殘基保留在siRNA上。2.3所述分子用于，例如影響優(yōu)選疾病或感染的器官或細胞的基因表達或者降低細胞混合物中期望基因的表達。
文檔編號C12N15/113GK102348799SQ201080011796
公開日2012年2月8日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者D·伊姆霍夫, S·克恩, T·珀爾曼 申請人:耶拿市弗里德里?！は沾髮W