一種檢測(cè)hdr鹽單胞菌的特異性引物對(duì)及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種檢測(cè)皿R鹽單胞菌的特異性引 物對(duì)及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油井在生產(chǎn)過(guò)程中，隨著溫度、壓力的降低和氣體的析出，達(dá)到一定條件時(shí)，原油 中溶解的蠟就會(huì)結(jié)晶、析出。隨著溫度、壓力的進(jìn)一步降低，石蠟將不斷地析出，其結(jié)晶體便 聚集和沉淀在油管、套管、抽油桿、抽油累等管材和設(shè)備上，該種現(xiàn)象稱(chēng)為結(jié)蠟。油井結(jié)蠟會(huì) 嚴(yán)重影響油田的正常生產(chǎn)，油管壁結(jié)蠟會(huì)增加對(duì)地層的回壓，降低油井產(chǎn)量，嚴(yán)重甚至將井 筒通道堵死，造成油井停產(chǎn)；油管和抽油桿間的結(jié)蠟會(huì)增大抽油機(jī)載荷，甚至造成抽油累蠟 卡；地層射孔炮眼累入口處結(jié)蠟，會(huì)增大油流阻力，降低累效；油層內(nèi)部結(jié)蠟會(huì)大幅度降低 其液相滲透率，使油井大幅度減產(chǎn)甚至不出油。
[0003] 近年來(lái)微生物防蠟技術(shù)克服了傳統(tǒng)防蠟技術(shù)的缺點(diǎn)，不會(huì)造成地層傷害，不會(huì)產(chǎn) 生油井怠產(chǎn)，不會(huì)污染環(huán)境，可廣泛應(yīng)用于各種含蠟油井，是一種新型、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的油井防 蠟技術(shù)，因此越來(lái)越受到石油工業(yè)的重視。該技術(shù)針對(duì)原油含蠟的特點(diǎn)W及結(jié)蠟機(jī)理，篩選 合適的細(xì)菌組合注入井筒，利用微生物及其代謝產(chǎn)物的作用，阻止石蠟結(jié)晶，防止或緩解井 筒結(jié)蠟，達(dá)到代替或逐漸替代傳統(tǒng)防蠟措施的目的。
[0004] 在江漢油田、克拉瑪依油田、江蘇油田近年來(lái)油井微生物防蠟技術(shù)進(jìn)行了大規(guī)模 的推廣應(yīng)用，取得了較好的效果。該技術(shù)應(yīng)用最主要的菌種為鹽單胞菌（盛皿W35)，簡(jiǎn)稱(chēng) 皿R，是微生物防蠟的重要菌種，目前對(duì)于該一重要功能菌的檢測(cè)存在一定的難度。在定量 分析方面，目前只能根據(jù)不同微生物克隆數(shù)通過(guò)分子生物學(xué)方法確定石油姪降解菌在樣品 中的相對(duì)含量，并結(jié)合樣品總菌濃巧日生物顯微鏡計(jì)數(shù)等）進(jìn)行計(jì)算獲得，由于油井產(chǎn)出液 等環(huán)境的待測(cè)樣品一般包含種類(lèi)繁多、組成復(fù)雜的微生物，而且不同微生物的豐度相差巨 大。在采用傳統(tǒng)方法分析時(shí)，一方面，生物顯微鏡計(jì)數(shù)誤差較大，且不能做低濃度檢測(cè)；另一 方面，對(duì)于豐度低的微生物，在DNA提取分析過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)漏檢；對(duì)于不同生理特性的 微生物，往往因?yàn)榕囵B(yǎng)條件不適也會(huì)造成漏檢，同時(shí)，傳統(tǒng)方法存在著耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)程繁雜等 一系列缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)鹽單胞菌方法存在的問(wèn)題，提供一種檢測(cè)皿R鹽單 胞菌的特異性引物對(duì)，W便于精確檢測(cè)油田產(chǎn)出液中皿R鹽單胞菌的濃度。
[0006] 本發(fā)明的目的該樣實(shí)現(xiàn)的，一種檢測(cè)皿R鹽單胞菌的特異性引物對(duì)，其特征在 于，包括如下正向引物和反向引物： HaloF:ACGGCATCCGGAACTGTCA化loR:TCCGATCCGGACTGAGACC。
[0007] 本發(fā)明還提供一種采用上述特異性引物對(duì)檢測(cè)皿R鹽單胞菌濃度的檢測(cè)方法，包 括如下步驟： (1) 提取待測(cè)樣品中微生物的DM; (2) 采用上述檢測(cè)皿R鹽單胞菌的特異性引物對(duì)，對(duì)步驟（1)獲得的樣品DM進(jìn)行巧光 定量PCR擴(kuò)增，讀取巧光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值； (3) 根據(jù)公式；CT= -3.4301gN+ 48.28 求得步驟l)中待測(cè)樣品中的石油姪降解菌 濃度N。
[0008] 進(jìn)一步的，上述巧光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括如下組分：9.5UL無(wú)菌水、 12.5uL化iversalSYBRGreenMasterMix、12.5uM的正向和反向引物各 0.5uL、2 yL待測(cè)樣品DM。
[0009] 進(jìn)一步的，所述巧光定量PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?；a)95。C保溫5min;b)94。C保 溫30s;c)64。C保溫30s;d)72。C保溫45S;e)重復(fù)執(zhí)行b)~d)50次；f)從65 。C開(kāi)始每5S增加0. 5°C至達(dá)到95。C為止。
[0010] 為準(zhǔn)確檢測(cè)皿R鹽單胞菌濃度，所述步驟3)中的公式Ct=-3. 4301gN+48. 28 通過(guò)如下方法擬合： A)取濃度為3. 23X109cells/血的石油姪降解菌液lOOmL，提取菌液中的DNA，溶于 無(wú)菌水中制得100yL的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀釋?zhuān)謩e得到濃度為3. 23X109、 3. 23X108、3. 23X107、3. 23X106、3. 23X105、3. 23X104、3. 23X1〇3的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液樣品； B) 將上步所得的各濃度的DM溶液分別采用化loF/化loR特異性引物對(duì)進(jìn)行巧光定 量PCR擴(kuò)增，并讀取巧光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，再根據(jù)IgN和CT值，擬合標(biāo)準(zhǔn)DNA溶 液樣品對(duì)應(yīng)的菌濃與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為： Ct= -3. 4301gN+ 48. 28,式中N為1yLDM標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。
[0011] 本發(fā)明中，設(shè)計(jì)了特異性引物對(duì)，再采用該特異性引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品中的DNA進(jìn) 行巧光定量PCR擴(kuò)增并讀取其CT值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌液定量擴(kuò)增后的CT值與菌液濃度N的 IgN值按擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線W精確檢測(cè)待測(cè)樣品中皿R鹽單胞菌濃度，具有檢測(cè)快速、特異 性強(qiáng)、操作便捷、檢測(cè)準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)皿R檢測(cè)技術(shù)的精度低，低濃度檢測(cè)時(shí)易出 現(xiàn)漏檢的問(wèn)題，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)油井微生物防蠟技術(shù)的推廣應(yīng)用更具有指導(dǎo)意義。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1為發(fā)明的皿R的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的濃度與CT值的擬合曲線。
【具體實(shí)施方式】[001引實(shí)施例1 皿R的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的濃度與Ct值的曲線的擬合。
[0014]A)取濃度為3. 23X109cells/mL的石油姪降解菌液100血，采用A巧gen?細(xì)菌基 因組DNA提取試劑盒（Axygen生物科技有限公司，美國(guó)）提取菌液中的DNA，溶于無(wú)菌水中 制得100化的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀釋?zhuān)謩e得到濃度為3. 23EX10\3. 23X108、 3. 23X107、3. 23Xl〇e、3. 23Xl〇s、3. 23X1〇\3. 23X103的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液樣品； B)將上步所得的各濃度的DNA溶液分別采用化loF/化loR特異性引物對(duì)進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增，其中巧光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的組分為；9. 5uL無(wú)菌水、12. 5uL化iversal SYBRGreenMasterMix、12.5uM的正向和反向引物各0.5uL、2uL樣品DM。巧光定 量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序；a)95。C保溫5min;b)94。C保溫30s;一64。C保溫30s; d)72。C保溫45s;e)重復(fù)執(zhí)行b)~d)50次；f)從65。C開(kāi)始每5S增加0. 5。C 至達(dá)到95 °C為止；g)讀取巧光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值。記錄各標(biāo)準(zhǔn)菌液的濃度N與 Ct值關(guān)系如表1。
[0015]
表中N示1 y LDNA樣品對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。由于檢測(cè)時(shí)，該DNA溶液來(lái)源于100血樣品 的菌液提取的DNA溶于適量無(wú)菌水中制備得到的100 y LDNA溶液，經(jīng)RT-PCR巧光定量擴(kuò) 增得到表1及標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct=-3.430IgN+ 48. 28,標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度R2=0.9952如圖 1所示。那么，樣品中的菌液濃度為：N(Cll/yL) X 100 yl/100血=N(Cell/mL) 因此，N即代表樣品菌濃，按照本標(biāo)準(zhǔn)曲線可W檢測(cè)lO4~1〇9Cell/mL菌液濃度的現(xiàn)場(chǎng)樣品， 另外，如果菌濃較低可W進(jìn)行離屯、濃縮測(cè)定。
[001引 實(shí)施例2 比較例 針對(duì)某微生物防蠟措施的油井采出液，使用現(xiàn)有技術(shù)中的一種皿R的選擇性培養(yǎng)基 逐級(jí)稀釋平板培養(yǎng)測(cè)定和本方法同時(shí)測(cè)定采出液水體中皿R純菌濃度，采用本發(fā)明的特 異性引物對(duì)檢測(cè)皿R鹽單胞菌濃度的檢測(cè)方法下簡(jiǎn)稱(chēng)RT-PCR)檢測(cè)其菌濃為1. 18X105cells/mU平板方法為110000個(gè)/mU說(shuō)明本方法和傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果吻合。記錄 結(jié)果如表2所示。
[0017]
實(shí)施例3 油田產(chǎn)出液樣品中石油姪降解菌濃度的檢測(cè) 分別取江蘇油田不同地質(zhì)條件下的五口油井的采出液lOOmU分別記為油井1、油井 2、油井3、油井4、油井5 ;將上采出液樣品分別采用Axygen?細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 (Axygen生物科技有限公司，美國(guó)）提取菌液中的DNA，溶于無(wú)菌水中制得100yL的DNA溶 液。將上述DNA溶液分別采用本發(fā)明的RT-PCR方法進(jìn)行巧光定量擴(kuò)增，其中擴(kuò)增反應(yīng)的 體系為；9. 5uL無(wú)菌水、12. 5uLUniversalSYBRGreenMasterMix、12. 5uM的正向 和反向引物各0.5uL、2uL產(chǎn)出液樣品DM。具體的巧光定量擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?；a)95 。C保溫 5min;b)94。C保溫 30s;c)64。C保溫 30s;d)72。C保溫 45s;e)重 復(fù)執(zhí)行b)~d)50次；f)從65。C開(kāi)始每5S增加0.5。C至達(dá)到95。C為止；g)讀 取巧光定量RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，并分別記錄上述各油井采出液樣品的DNA溶液經(jīng) RT-PCR擴(kuò)增后的Ct值如表3,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct= -3.430IgN+ 48. 28查出對(duì)應(yīng)的Ig N值，最終求得各產(chǎn)出液樣品中皿R菌液的濃度，如表3所示。
[001引表3產(chǎn)出液樣品中石油姪降解菌濃度
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)HDR鹽單胞菌的特異性引物對(duì)，其特征在于，包括如下正向引物和反向引 物： HaloF: ACGGCATCCGGAACTGTCA HaloR: TCCGATCCGGACTGAGACC。2. -種HDR鹽單胞菌濃度的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 提取待測(cè)樣品中微生物的DNA ; (2) 采用權(quán)利要求1所述的特異性引物對(duì)，對(duì)步驟（1)獲得的樣品DNA進(jìn)行熒光定量 PCR擴(kuò)增，讀取熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值； (3) 根據(jù)公式：CT = -3.4301gN + 48.28 求得步驟l)中待測(cè)樣品中的石油烴降解菌 濃度N。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HDR鹽單胞菌濃度的檢測(cè)方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增的 反應(yīng)體系包括如下組分：9.5 uL無(wú)菌水、12.5 uL Universal SYBR Green Master Mix、 12. 5 yM的正向和反向引物各0. 5 yL、2 yL待測(cè)樣品DNA。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HDR鹽單胞菌濃度的檢測(cè)方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增的程 序?yàn)椋篴) 95 ° C 保溫 5 min ;b) 94 ° C 保溫 30 s ;c) 64° C 保溫 30 s ;d) 72 ° C 保溫 45 s; e)重復(fù)執(zhí)行b)~d)50次；f)從65 ° C開(kāi)始每5 s增加0. 5° C至達(dá)到95 ° C為 止。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HDR鹽單胞菌濃度的檢測(cè)方法，所述步驟3)中的公式C T = -3. 4301g N + 48. 28通過(guò)如下方法擬合： A) 取濃度為3. 23X IO9 cells/mL的石油烴降解菌液100mL，提取菌液中的DNA，溶于 無(wú)菌水中制得100 U L的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀釋?zhuān)謩e得到濃度為3. 23X 109、 3. 23X 108、3. 23X 107、3. 23X 106、3. 23X 105、3. 23X 104、3. 23X IO3的標(biāo)準(zhǔn) DNA 溶液樣品； B) 將上步所得的各濃度的DNA溶液分別采用HaloF/HaloR特異性引物對(duì)進(jìn)行熒光定 量PCR擴(kuò)增，并讀取熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的(^值，再根據(jù)Ig N和C ^直，擬合標(biāo)準(zhǔn)DNA溶 液樣品與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為： Ct = -3. 4301g N + 48. 28,式中N為I y L DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的涉及微生物菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)HDR鹽單胞菌的特異性引物對(duì)及其檢測(cè)方法。其中，一種檢測(cè)HDR鹽單胞菌的特異性引物對(duì)，包括如下正向引物和反向引物：HaloF: ACGGCATCCGGAACTGTCA；HaloR: TCCGATCCGGACTGAGACC。本發(fā)明中的HDR鹽單胞菌濃度的檢測(cè)方法采用該特異性引物對(duì)對(duì)待測(cè)樣品中的DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增并讀取其CT值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌液定量擴(kuò)增后的CT值與菌液濃度N的lg N值按擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線以精確檢測(cè)待測(cè)樣品中HDR鹽單胞菌濃度，具有檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)、操作便捷、檢測(cè)準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)HDR檢測(cè)技術(shù)的精度低，低濃度檢測(cè)時(shí)易出現(xiàn)漏檢的問(wèn)題，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)油井微生物防蠟技術(shù)的推廣應(yīng)用更具有指導(dǎo)意義。
【IPC分類(lèi)】C12R1/01, C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN104988213
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510290357
【發(fā)明人】姚峰, 王彪, 時(shí)維才, 林晶晶, 鄭海男, 雷世華
【申請(qǐng)人】中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司江蘇油田分公司
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年8月19日