一種具有側根特異性表達特性的dna片段的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發(fā)明涉及能夠在水 稻轉基因調控體系中特異性的驅動目標基因的表達的一段DNA片段。
【背景技術】
[0002] 啟動子是參與特定基因轉錄及其調控的DNA序列。它決定了一個基因是否表達、 何時表達以及何處表達。按作用方式和功能，啟動子可分成組成型啟動子、特異型啟動子和 誘導型啟動子三類。在植物基因工程中，人們利用具有不同表達調控水平的啟動子來啟動 目標基因的表達。例如來源于玉米的Ubiqutin和水稻的Actin啟動子，能夠調控目的基因 在根、葉中強烈表達，是植物轉基因中被廣泛使用的啟動子。雖然組成型啟動子能驅動目標 基因在植物中非特異性地高效表達，但往往造成植株大量積累異源蛋白，打破原有代謝平 衡，過分消耗植株能量，因而得不到所預期的表型。因此，選擇一些能在組織、器官以及發(fā)育 各階段特異的啟動子，使目標基因只在特定組織或特定時期表達，對于基因功能研究、作物 性狀改良有重要的意義。
[0003] 作為植物的地下部，根直接與土壤接觸，從土壤中吸取水分和養(yǎng)分、運輸物質和儲 存營養(yǎng)等，是植物極其重要的生理器官，因此研究根特異性啟動子具有實在的應用價值。如 利用根特異性啟動子可以改善植物根的生長，提高植物的抗旱鹽能力，增加根的分泌物，對 土壤污染進行生物修復等。同時利用根特異性啟動子研究植物根的發(fā)育、根系的形態(tài)建成 和根構型的重建并進行作物的遺傳改良培育高產穩(wěn)產的作物新品種具有重要的意義。
[0004] 目前使用中的根特異性啟動子并不多。在植物內源的根特異性啟動子開發(fā)應用之 前，使用的農桿菌Ri質粒中的一個根特異的基序rolD(Elmayan T，Tepfer M. Evaluation in tobacco of the organ specificity and strength of the rolD promoter doman A of the 35S promoter and the35S promoter. Transgenic Res，1995, 4:388-396)。最近幾 年人們也找到一些根特異性啟動子，如利用擬南芥的黑芥子酶（myrosinase)PYKlO啟動子 調控CKX3基因，使該基因在根中表達，促進根的加快生長，提高了作物抗旱和吸收礦物質 白勺會泛力（Werner T, Nehnevajova E, Kollmer I, Novak 0, Strnad M, Kramer U, Schmulling T.Root-specific feduction of cytokinin causes enhanced root growth, drought tolerance, and leaf mineral enrichment in Arabidopsis and tobacco. Plant Cell. 2010, 22(12) :3905-3920);用根特異性引物Rcc3驅動OsNACIO,發(fā)現(xiàn)特異性表達 該基因后，也使根變大，并能在干旱脅迫下增加植物產量（Jin Seo Jeong，Youn Shic Kim, Kwang Hun Baek, Harin Jung, Sun-Hwa Ha, Yang Do Choi,Minkyun Kim,Christophe Reuzeau, and Ju-kon Kim. Root-Specific Expression of OsNACIO Improves Drought Tolerance and Grain Yield in Rice under Field Drought Conditions. Plant Physiol. 2010153:185-197)。
[0005] 綜上所述，在植物中，合理使用根特異性啟動子能明顯改善植物性狀，但應用于水 稻等禾谷類作物基因工程遺傳載體構建中能夠選用的植物內源根特異性啟動子依然較少， 因此，發(fā)展更多的水稻等禾谷類作物的根特異性啟動子對基礎研究和生產應用都具有重要 的意義。

【發(fā)明內容】

[0006] 因此，針對上述問題，本發(fā)明針對水稻根中相關基因的表達，獲得一個DNA片段， 其具有根表達特異性，可以用于驅動在根中特異性表達的一些功能基因或結構基因。
[0007] 本發(fā)明的還獲得了獲得含有上述DNA片段的表達盒和重組載體，并且本發(fā)明還利 用該DNA片段獲得了相應的轉基因植物。其中，本文中所涉及的"植物"是指單子葉植物， 例如水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種DNA片段，所述DNA片段包含：
[0009] 1)序列表中SEQ ID N0 :1所不的DNA序列；或者
[0010] 2)在嚴格條件下與1)中所述的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；或 者
[0011] 3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有啟動子功能的DNA 分子。
[0012] 2)和3)中的序列與SEQ ID No: 1所示的DNA序列具有相同的功能，即驅動目標基 因在植物中表達，其中，
[0013] SEQ ID N0 :1中所示序列為：
[0014]
[0015]
[0016]
[0017] 需要說明的是：上述啟動子的DNA序列中，序列開頭的序列"atttcccttg tcactcctct gg"共計22bp為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的 序列"aacgaggac ggcaaggaca aga"共計22bp為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存 序列（該留存序列與反向引物的相應序列互補）；該DNA序列中剩余的部分則為獲自日本 晴水稻中的DNA序列。需要強調的是，本文中所提到的啟動子既可以指上述整個DNA序列， 也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的是，即便本領域技術人員在本 發(fā)明的基礎上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā)明的保護范圍之內。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述DNA序列為SEQIDNo:1所示的序列。
[0019] 優(yōu)選地，序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列用作水稻根特異表達啟動子。
[0020] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以提取自水稻屬植物，優(yōu)選為日本晴水 稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)，本文中稱為P0sRo4或啟動子P0sRo4。具體而言，本 申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括轉錄起始 位點在內的1593bp的DNA序列，具有驅動目標基因在水稻根中特異性表達的功能，并且分 離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述水稻根特異性強表達啟動子的表達盒。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供一組用于擴增所述DNA片段的全長或其任意片段的引物 對，其特征在于，所述引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段： AITTCCCTTGTCACTCCTCTGG ;所述第二引物的 DNA 序列包含片段：AACGAGGACGGCAAGGACAAGA。
[0023] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體為在植物表達載 體PCAMBIA1391的多克隆位點插入所述DNA片段得到的重組質粒，在所述重組表達載體中， 所述水稻根特異表達啟動子P0sR 〇4連接于載體中待表達的基因序列的上游；優(yōu)選的，所述 待表達的基因為對水稻根有改善功能的基因。通過本發(fā)明的啟動子驅動基因在根中特異性 表達，從而達到改良作物性狀的作用。
[0024] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻根特異性強表達啟動子在培育轉基因植物中的應 用。所述應用包括將本發(fā)明提供的上述水稻根特異性強表達啟動子連接于載體的待表達的 基因序列上游（例如，將所述啟動子序列置于目標基因之前），從而構建重組表達載體，將 所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
[0025] 另一方面，本發(fā)明提供一種制備轉基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括： 利用PCR擴增方法對日本晴水稻DNA中權利要求1所述的DNA片段進行擴增；
[0026] 利用T4連接酶將擴增獲得的DNA序列與含有目的基因的預定載體相連接，獲得相 應重組載體；
[0027] 利用凍融法將所獲得的重組載體轉入根癌農桿菌；
[0028] 采用農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法利用所述根癌農桿菌將權利要求1所述的 DNA片段以及目的基因轉入水稻細胞；
[0029] 利用所述水稻細胞培養(yǎng)轉基因水稻。
[0030] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)P0sRo4基因上游包括轉錄起始位點在內的1593bp的DNA序列，并將其命名 為啟動子P〇sRo4。將該序列經酶切后連接到植物雙元表達載體pCAMBIA1391上，獲得相應 的重組質粒（即重組表達載體），利用該重組質粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105,然后用農桿 菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水稻植株。對獲得的轉基因水稻進行Gus組織 化學染色檢測發(fā)現(xiàn)，轉基因植株僅在根部位有Gus表達，從而證明該1593bp的序列具有驅 動基因在根部位特異性表達的活性。
[0031] 本發(fā)明所述的啟動子序列可與植物雙元表達載體連接，用于取代組成型啟動子。 并且，該啟動子序列可以與所需的靶標基因連接，構建重組植物表達載體，經轉化后，在水 稻的根部位特異性的驅動靶標基因的表達，增加轉基因的效果，改良水稻的特性。
[0032] 技術效果
[0033] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子P0sR〇4能夠調控基因在水稻根中特異性集中表達， 在實際應用中具有顯著價值。通過該啟動子對農作物品種進行基因改造，從而培育出理想 的轉基因植物品種。
【附圖說明】
[0034] 以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：