專利名稱:具有減少的金屬肽酶表達(dá)、適于重組多肽產(chǎn)生的突變細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及產(chǎn)生至少一種目標(biāo)異源多肽的突變的細(xì)菌細(xì)胞,其中所述細(xì)胞與其他為同基因的但非突變的細(xì)胞相比,具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平;用于產(chǎn)生所述突變細(xì)胞的方法;和用于使用所述突變細(xì)胞產(chǎn)生目標(biāo)多肽的方法。
背景技術(shù):
多肽,具體而言,酶的重組工業(yè)生產(chǎn),是競(jìng)爭(zhēng)激烈的領(lǐng)域,其中技術(shù)水平非常之高。 芽孢桿菌屬(Bacillus)中多肽的工業(yè)產(chǎn)生尤其受到完善的研究,且目前而言,在該領(lǐng)域甚至穩(wěn)步改善多肽產(chǎn)率或生產(chǎn)力也是需要的。長(zhǎng)年以來(lái)已知在芽孢桿菌屬中胞外和細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶的失活在許多情況下導(dǎo)致改善的產(chǎn)物穩(wěn)定性并因此導(dǎo)致更佳的產(chǎn)率(W0 1992/01664幻。在枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)WB600 株中失活了多至六種的蛋白酶(Wu 等 1991. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases. J Bacteriol 173(16) :4952-4958)。SEQ ID NO :1中所示的開(kāi)讀框(ORF)編碼表示為BL00^9的推定的金屬蛋白酶,其氨基酸序列示于 SEQ ID NO 2 (NCBI "Entrez Protein” 或“Entrez Gene” 登錄號(hào) YP_080660),其為最初從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580的基因組測(cè)序中由 Rey 等在 2004 :Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species, Genome Biol. (10) :R77所預(yù)測(cè)的。據(jù)我們所知,在此之后尚未公開(kāi)任何關(guān)于該預(yù)測(cè)的ORF 或推定的編碼的金屬蛋白酶活性的研究。
發(fā)明內(nèi)容
在幾種地衣芽孢桿菌酶產(chǎn)生株中SEQ ID NO 1中所示的推定開(kāi)讀框的失活導(dǎo)致顯著改善的酶產(chǎn)率,如實(shí)施例中所示。宿主株已經(jīng)失活了兩個(gè)主要的胞外蛋白酶,即堿性和中性蛋白酶(apr,npr),以及C-組分(BLC)。這些失活目前(by far)消除了胞外細(xì)胞膜活性的主要部分(>90%)。預(yù)期失活仍舊另一個(gè)蛋白酶會(huì)至多(at best)提供僅為非常次要的改善。鑒于此, 如實(shí)施例中所見(jiàn),失活本發(fā)明的推定的金屬蛋白酶導(dǎo)致如此顯著改善的產(chǎn)物產(chǎn)率是非常令人驚訝的。相應(yīng)地,在第一個(gè)方面,本發(fā)明涉及突變的細(xì)菌細(xì)胞,其產(chǎn)生至少一種目標(biāo)異源多肽,其中所述細(xì)胞與其他為同基因但非突變的細(xì)胞(otherwise isogenic but non-mutatedcell)相比,具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同,或優(yōu)選與SEQ ID NO 2至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于構(gòu)建突變的細(xì)菌細(xì)胞的方法,所述方法包括下述步驟a)使細(xì)菌細(xì)胞突變;和b)選擇突變細(xì)胞,其與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,具有減少的包含與SEQ ID NO 2中所示序列至少70%相同,或優(yōu)選與SEQ ID NO 2至少75%、 80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平。本發(fā)明的最后一個(gè)方面涉及用于產(chǎn)生目標(biāo)異源多肽的方法,所述方法包括下述步驟a)培養(yǎng)產(chǎn)生至少一種目標(biāo)異源多肽的突變細(xì)菌細(xì)胞,其中所述突變細(xì)胞與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同,或優(yōu)選與 SEQ ID NO :2 至少 75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平,和b)分離目標(biāo)多肽。
圖1顯示質(zhì)粒pMDT081的概略圖。圖2顯示質(zhì)粒pAN^9的概略圖。圖3顯示質(zhì)粒pM0L2598的概略圖。圖4顯示質(zhì)粒pM0L2606的概略圖。圖5顯示質(zhì)粒pAN369的概略圖。圖6顯示質(zhì)粒pAN405的概略圖。定義分離的多肽術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”用于本文中指從來(lái)源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面,多肽如通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的,為至少純,優(yōu)選至少5%純,更優(yōu)選至少10%純,更優(yōu)選至少20%純,更優(yōu)選至少40%純,更優(yōu)選至少60%純,甚至更優(yōu)選至少80%純,并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多肽術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物,所述多肽制備物含有按重量計(jì)至多10 %,優(yōu)選至多8 %,更優(yōu)選至多6 %,更優(yōu)選至多5 %,更優(yōu)選至多 4%,更優(yōu)選至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至多1 %,并且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此,優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純,優(yōu)選至少94%純,更優(yōu)選至少 95 %純,更優(yōu)選至少96 %純,更優(yōu)選至少96 %純,更優(yōu)選至少97 %純,更優(yōu)選至少98 %純, 甚至更優(yōu)選至少99%純,最優(yōu)選至少99. 5%純,并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言,優(yōu)選所述多肽是“基本上(substantially)純的形式”, 即,所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如,這能夠通過(guò)以下實(shí)現(xiàn)通過(guò)公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言,兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice 等,2000,Trendsin Genetics 16:276-277)的Needle程序(優(yōu)選3· 0· 0版或更高版本)中所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch,1970,J. Mol. Biol. 48 :443-453)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gap penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extension penalty)0. 5 和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性(longest identity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性,并計(jì)算如下(同樣的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言,兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等,2000,見(jiàn)上文)的Needle程序(優(yōu)選3· 0· 0版或更高版本)中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch,1970,見(jiàn)上文)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10,缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性,并計(jì)算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))分離的多核苷酸術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”用于本文中指從來(lái)源分離的多核苷酸。 在一個(gè)優(yōu)選的方面,多核苷酸如通過(guò)瓊脂糖電泳測(cè)定的,為至少純,優(yōu)選至少5%純,更優(yōu)選至少10 %純,更優(yōu)選至少20 %純,更優(yōu)選至少40 %純,更優(yōu)選至少60 %純,甚至更優(yōu)選至少80%純,并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多核苷酸術(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來(lái)的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物,并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此,基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)優(yōu)選至多10%,更優(yōu)選至多8 %,更優(yōu)選至多6 %,更優(yōu)選至多5 %,更優(yōu)選至多4 %,更優(yōu)選至多3 %,甚至更優(yōu)選至多2 %,最優(yōu)選至多1%,并且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而,基本上純的多核苷酸可以包含天然存在的5’和3’非翻譯區(qū),如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)優(yōu)選至少90%純,更優(yōu)選至少92%純,更優(yōu)選至少94%純,更優(yōu)選至少95%純,更優(yōu)選至少96%純,更優(yōu)選至少97%純,甚至更優(yōu)選至少98%純,最優(yōu)選至少99%,并且甚至最優(yōu)選至少99. 5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言,優(yōu)選在本文公開(kāi)的多核苷酸是“基本上(essentially)純的形式”,即,所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的,或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語(yǔ)“編碼序列,,或“開(kāi)讀框”意指直接指定其蛋白產(chǎn)物氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開(kāi)讀框決定,所述開(kāi)讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開(kāi)始,并且以終止密碼子例如TAA、TAG 和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子,其分離自天然存在的基因,或受修飾以本來(lái)不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段,或其為合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí),術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(control sequence)術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的所有成分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的,或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度,調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供,所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型,其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置,使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟,其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子,其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸,并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型,所述細(xì)胞類型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的 (susceptible)0修飾術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文的意思是,對(duì)由SEQ ID NO 2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學(xué)修飾,以及對(duì)編碼此種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入,以及一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換。雜交就本發(fā)明而言,雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交,所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1的多肽編碼序列;SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列;其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈;或它們的亞序列??墒褂美鏧射線片(X-ray film)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)優(yōu)選方面,核酸探針是SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選方面,核酸探針是編碼SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸序列,或其至少IOObp的亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選方面,核酸探針是SEQ ID NO :1。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針,將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在 42°C,在5X SSPE、0. 3% SDS、200y g/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中,并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅8邍?yán)格性為50%的甲酰胺,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至M小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針,使用2X SSC、0.2% SDS優(yōu)選至少在 450C (非常低嚴(yán)格性),更優(yōu)選至少在50°C (低嚴(yán)格性),更優(yōu)選至少在55°C (中嚴(yán)格性), 更優(yōu)選至少在60°C (中-高嚴(yán)格性),甚至更優(yōu)選至少在65°C (高嚴(yán)格性),并且最優(yōu)選至少在70°C (非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次,每次15分鐘。突變能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法,然后進(jìn)行相應(yīng)的篩選方法,例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer,1988,Science 241 :53-57 ;Bowie 和 Sauer, 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ;WO 95/17413 ;或 WO 95/22625 公開(kāi)的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如,Lowman等,1991,Biochem. 30 :10832-10837 ;美國(guó)專利 5,223,409 ;WO 92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等,1986,Gene 46 :145 ;Ner等,1988,DNA 7:127)。亦可采用通過(guò)移碼或部分甚至完全缺失進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)基因破壞(gene disruption)。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸,所述突變多核苷酸在SEQ ID NO 1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變,或由在SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變的核苷酸組成,其中所述突變核苷酸序列編碼SEQ ID NO :2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的,包括從基因組DNA分離,從cDNA制備,或其組合??赏ㄟ^(guò)例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段,從而實(shí)現(xiàn)從此種基因組 DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見(jiàn),例如,Innis等,1990,PCR :A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York??梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法,如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligated activated transcription ;LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增 (NASBA)??梢詮难挎邨U菌屬菌株,或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸,并且因此可為例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(species variant)。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法,其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列或其部分,所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時(shí),與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽??梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法(例如,插入、破壞、替代或缺失)通過(guò)減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面,所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是,例如,編碼區(qū)或其對(duì)活性關(guān)鍵的部分,或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。此種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分, 即,足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子??梢酝ㄟ^(guò)向親本細(xì)胞施以誘變,并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行核苷酸序列的修飾或失活。誘變(其可為特異性的或隨機(jī)的)可以通過(guò)例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行,通過(guò)使用合適的寡核苷酸進(jìn)行,或通過(guò)對(duì)所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變來(lái)進(jìn)行。此外,可以通過(guò)使用這些誘變劑的任何組合來(lái)進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate) (EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí),通常通過(guò)如下方法來(lái)進(jìn)行所述誘變?cè)诤线m條件下存在優(yōu)選的誘變劑時(shí)溫育待誘變的親本細(xì)胞,并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無(wú)基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。通過(guò)導(dǎo)入、取代或去除基因中的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件可以實(shí)現(xiàn)所述核苷酸序列的修飾或失活。例如,可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子,去除起始密碼子,或改變開(kāi)讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以完成此種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行,即, 直接在表達(dá)待修飾核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行,但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。
消除或減少核苷酸序列通過(guò)細(xì)胞的表達(dá)的便利方式的例子是基于基因取代,基因缺失,或基因破壞的技術(shù)。例如,在基因破壞方法中,將相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列,然后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。 通過(guò)同源重組,所述缺陷性核酸序列替代內(nèi)源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標(biāo)記,其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面,用選擇性標(biāo)記(如本文所述的那些)來(lái)破壞所述核苷酸序列。或者,可以使用與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列通過(guò)確定的反義或RNAi技術(shù)來(lái)進(jìn)行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地,通過(guò)導(dǎo)入與所述基因的核苷酸序列互補(bǔ)的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過(guò)細(xì)胞的表達(dá),所述序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。由此在允許所述互補(bǔ)反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下, 減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞,其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的破壞或缺失,這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和/或異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以,本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)天然或異源多肽的方法,其包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)所述突變細(xì)胞;和(b)回收所述多肽。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”在本文中定義為對(duì)宿主細(xì)胞不是天然的多肽,進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然蛋白,或作為通過(guò)重組DNA 技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞操作的結(jié)果其表達(dá)在量上改變的天然蛋白。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體,所述重組表達(dá)載體包含編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體,所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?;蛘?,可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在構(gòu)建表達(dá)載體的過(guò)程中,將編碼序列置于載體中,從而使得該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如,質(zhì)?;虿《?,其能夠方便地進(jìn)行重組DNA 步驟,并且能夠?qū)崿F(xiàn)核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇通常取決于載體與待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體,即,作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體,其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制,例如,質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?;蛘撸d體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí),整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外, 可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒,或者兩個(gè)或更多個(gè)共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整 DNA (total DNA)的載體或質(zhì)粒,或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記,其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因,其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophy to auxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因,或賦予抗生素抗性的標(biāo)記,所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制的元件。為了整合入宿主細(xì)胞基因組,載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或任何其它載體元件以通過(guò)同源或非同源重組整合入基因組?;蛘?,載體可以含有額外的核苷酸序列, 所述序列用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性,整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸,如100至10,000堿基對(duì),優(yōu)選400至10,000堿基對(duì),并且最優(yōu)選800至10,000堿基對(duì),其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的任何序列。此外,整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面,可以將載體通過(guò)非同源重組整合入宿主細(xì)胞的基因組。為了自主復(fù)制,載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn),其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?;蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177 和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn),和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和 ρΑΜβ 1的復(fù)制起點(diǎn)。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn),例如,Sambrook等,1989,見(jiàn)上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞,其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸,其有利地用于所述多肽的重組產(chǎn)生。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞,使載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代,其由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞,例如,原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于,芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus) 0革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于,大腸桿菌(E. coli)、假單胞菌屬(I^seudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬 (Ureaplasma)屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于,嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis)細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面,細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞??赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn),例如,Chang 和 Cohen,1979,Molecular General Genetics 168 :111-115),使用感受態(tài)細(xì)胞 (參見(jiàn),例如,Young 禾口 Spizizen,1961,Journal of Bacteriology 81 :823-829 或 Dubnau 和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology 56 :209-221),電穿孔(參見(jiàn), 例如,Shigekawa 和 Dower,1988,Biotechniques 6 :742-751)或接合(參見(jiàn),例如,Koehler 和 Thorne,1987,Journal of Bacteriology 169 :5771-5278)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將 DNA 引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn),例如,Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166 557-580)或電穿孑L (參見(jiàn),例如,Dower 等,1988,Nucleic Acids Res. 16 :6127-6145)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見(jiàn),例如, Gong 等,2004,F(xiàn)olia Microbiol. (Praha) 49 :399-405),接合(參見(jiàn),例如,Mazodier 等, 1989,J. Bacteriol. 171 :3583-3585),或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn),例如,Burke 等,2001,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :6289-6294)??赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見(jiàn),例如,Choi 等,2006,J.Microbiol. Methods 64:391-397)或接合(參見(jiàn),例如,Pinedo 禾口 Smets,2005,Appl. Environ. Microbiol. 71 :51-57)。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生重組多肽的方法,其包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)突變的細(xì)菌細(xì)胞,所述細(xì)胞產(chǎn)生所述多肽;和(b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面,所述細(xì)胞是芽孢桿菌屬的細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面,所述細(xì)胞是地衣芽孢桿菌。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中,使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如,可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng),和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?;虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成制備(例如,在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中,其能夠從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收??梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來(lái)檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如,酶測(cè)定法(enzyme assay) 可用于確定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如,多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收,所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽,所述方法包括但不限于層析(例如,離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如,制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如,硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取 (參見(jiàn),例如,Protein Purification,J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 編,VCH Publishers,New York,1989)。發(fā)明的具體描述微牛物本發(fā)明的微生物(微生物菌株或細(xì)胞)可獲得自任何屬的微生物,如那些下述列舉的細(xì)菌來(lái)源。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明第一個(gè)方面的細(xì)胞是原核細(xì)胞,優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞,更優(yōu)選枯草桿菌屬細(xì)胞,且最優(yōu)選嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、 環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。突變細(xì)胞在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述包含與SEQ ID NO 2中所示序列至少70% 相同,或優(yōu)選與 SEQ ID NO :2 至少 75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或 99%相
同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的突變細(xì)胞在編碼多肽的基因中突變,所述多肽包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同,優(yōu)選與SEQ ID NO :2至少75%、80%、 85^^90^^92%,94^^96^^98%或99%相同的氨基酸序列;優(yōu)選本發(fā)明的突變細(xì)胞在具有與SEQ ID NO 1中所示序列至少70%相同,優(yōu)選與SEQ ID NO 1至少75%、80%、85%、 90%,92^^94%,96^^98%或99%相同的核苷酸序列的多核苷酸中突變。優(yōu)選地,本發(fā)明的細(xì)胞在至少一個(gè)多核苷酸中突變,其中所述至少一個(gè)多核苷酸具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴(yán)格雜交條件下,優(yōu)選在中-高嚴(yán)格條件下,或更優(yōu)選在高嚴(yán)格條件與具有SEQ ID NO 1中所示的序列的多核苷酸或其相應(yīng)互補(bǔ)序列雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的突變細(xì)胞是其中編碼多肽的基因部分或完全從染色體缺失,或包含至少一個(gè)移碼突變或無(wú)義突變的突變細(xì)胞,所述多肽包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同,優(yōu)選與SEQ ID NO :2至少75%、80%、85%、90%、92%、 94%、96%、98%或99%相同的氨基酸序列。這些突變的一個(gè)優(yōu)選結(jié)果是,與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,本發(fā)明的細(xì)胞具有至少兩倍減少的多肽表達(dá)水平,所述多肽包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70% 相同,優(yōu)選與 SEQ ID NO :2 至少 75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或 99%相同的氨基酸序列;或所述細(xì)胞與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,不具有可測(cè)量的該多肽表達(dá)。目標(biāo)多肽在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,目標(biāo)多肽可獲得自細(xì)菌或真菌來(lái)源。例如,目標(biāo)多肽可獲得自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如芽孢桿菌屬菌株,例如嗜堿芽孢桿菌、 解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株;或鏈霉菌屬菌株,例如淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyces livickns)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)菌株;或來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌,例如大腸桿菌或假單胞菌屬菌種。目標(biāo)多肽可獲得自真菌來(lái)源,例如,來(lái)自酵母菌株如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)菌株,例如,卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces ovifoirmis)菌株。目標(biāo)多肽可獲得自絲狀真菌菌株,如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬 (Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、 鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)J^ 絲毒屬(Myceliophthora)、新考瑪月旨毒屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、 擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬 (Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)菌株,具體而言目標(biāo)多 Ι Pj^til §Ml^(Aspergillus aculeatus) Λ^^^β (Aspergillus awamori) λ^^ 霉(Aspergillus foetidus)、曰本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漂曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、桿抱狀,廉抱(Fusarium bactridioides)、禾谷德抱(Fusarium cerealis)、庫(kù)威德抱(Fusarium crookwellense)、大刀德抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、 禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱 (Fusarium negundi)、尖德抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、 粉紅德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圓,廉抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱(Fusarium trichothecioides)、 鑲片鐮孢(Fusarium venenatum)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、疏棉狀腐質(zhì) M (Humicola lanuginosa) Λ τ|<: M ^β (Mucor miehei) Λ ^1 ^ (Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木毒(Trichoderma harzianum)、康寧木毒(Trichoderma koningii)、 長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉 (Trichoderma viride)菌株。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得,所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、 德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)(NRRL)。就本發(fā)明而言,用于本文與給定的來(lái)源相連的術(shù)語(yǔ)“獲得自”,意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生,或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。目標(biāo)多肽可為肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明優(yōu)選的肽包含2至100個(gè)氨基酸;優(yōu)選10至80 個(gè)氨基酸;更優(yōu)選15至60個(gè)氨基酸;甚至更優(yōu)選15至40個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述蛋白質(zhì)是酶,特別是水解酶(根據(jù)Enzyme Nomenclature ;Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry為分類EC 3)。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中,優(yōu)選下述的水解酶蛋白酶合適的蛋白酶包括那些動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的。優(yōu)選微生物來(lái)源。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。所述蛋白酶可為酸性蛋白酶,絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶, 優(yōu)選為堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例為枯草桿菌蛋白酶,特別是那些來(lái)源于芽孢桿菌屬的,例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、 枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。 胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例為胰蛋白酶(例如豬或牛來(lái)源的)和描述于WO 89/06270和WO 94/25583的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實(shí)例為描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中的變體,特別是在一個(gè)或多個(gè)下述位置具有取代的變體27、36、57、76、87、97、 101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235 和 274。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASE 、PRIMASE 、 DURALASE 、 ESPERASE 、 RELASE 禾口 KANNASETM(Novozymes A/S)、 MAXATASE 、 MAXACAL 、MAXAPEM 、PROPERASE 、PURAFECT 、PURAFECT 0ΧΡ 、FN2 和 FN3 (Genencor International Inc.)。脂肪酶合適的脂肪酶包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬(Humicola)(同義詞嗜熱霉屬(Thermomyces)) 的脂肪酶,例如描述于EP 258 068和EP 305 216的來(lái)自疏棉狀腐質(zhì)霉(H. lanuginosa) (Μ 毛嗜熱霉(T. Ianuginosus))或如描述于WO 96/13580的來(lái)自特異腐質(zhì)霉(H. insolens)的脂肪酶,或假單胞菌屬脂肪酶,例如來(lái)自如產(chǎn)堿假單胞菌(P. alcaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(P. pseudoalcaligenes) (EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(P. cepacia) (EP 331 376)、施氏假單胞菌(P. stutzeri) (GB 1,372,034)、熒光假單胞菌(P. fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株 SD 705 (W0 95/06720 和 WO 96/27002)、威斯康星假單胞菌(P. wisconsinensis) (TO 96/12012)的脂肪酶,芽孢桿菌屬脂肪酶,例如來(lái)自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993), Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(W0 91/16422)的脂肪酶。其他的實(shí)例為脂肪酶變體,如WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的脂肪酶包括LIPOLASE 、LIPOLASE ULTRA 和 LIPEX (Novozymes A/S)。淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β )包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶,例如來(lái)自特定地衣芽孢桿菌菌株的淀粉酶,更加詳細(xì)地描述于GB 1,296, 839。有用的淀粉酶的實(shí)例為WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、WO 97/43424 和WO 01/66712中描述的變體,特別是在一個(gè)或多個(gè)下述位置有取代的變體15、23、105、 106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408 和
444。商業(yè)上可獲得的淀粉酶為DURAMYL 、TERMAMYL 、FUNGAMYL 、NATALASE 、 TERMAMYL LC 、TERMAMYL SC 、LIQUIZYME-X 禾口 BAN (Novozymes A/S)、RAPIDASE 和 PURASTAR (來(lái)自 Genencor International Inc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的。包括化學(xué)修飾的和蛋白質(zhì)工程的突變體。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶,例如 US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757 和 WO 89/09259中公開(kāi)的產(chǎn)自特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶為具有護(hù)色益處(colour care benefit)的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實(shí)例為 EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、 WO 98/08940中描述的纖維素酶。其他實(shí)例為纖維素酶變體,如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307 和 PCT/ DK98/00299中描述的那些。商業(yè)上可獲得的纖維素酶包括CELLUZYME 、CAREZYME 和CAREZYME CORE (Novozymes A/S)、CLAZINASE 禾口 PURADAX HA (Genencor International Inc.)和 KAC-500(B) (Kao Corporation)。氧化還原酶根據(jù)本發(fā)明可處理的氧化還原酶包括過(guò)氧化物酶和氧化酶如漆酶和過(guò)氧化氫酶。其他優(yōu)選的水解酶為糖水解酶(carbohydrolase)包括MANNAWAY 。其他優(yōu)選的酶為轉(zhuǎn)移酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶。用于目標(biāo)多肽的表達(dá)構(gòu)建體在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)編碼所述至少一個(gè)異源多肽的多核苷酸的染色體整合的拷貝。優(yōu)選本發(fā)明所述至少一個(gè)異源多肽由從至少一個(gè)異源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼;優(yōu)選所述至少一個(gè)啟動(dòng)子包含人工啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子構(gòu)建體描述于WO 93/10249, 其通過(guò)提述以其整體并入本文。此外,優(yōu)選的人工啟動(dòng)子包含一個(gè)或多個(gè)mRNA穩(wěn)定序列,優(yōu)選來(lái)源于cryllla啟動(dòng)子。合適的構(gòu)建體描述于WO 99/43835,其通過(guò)提述以其整體并入本文。
鍾本發(fā)明可用于任何工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵,例如用于任何具有至少50升,優(yōu)選至少100 升,更優(yōu)選至少500升,甚至更優(yōu)選至少1000升,特別是至少5000升的培養(yǎng)基的發(fā)酵。所述細(xì)菌菌株或細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知方法發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基可為包含復(fù)合氮源和/或碳源的復(fù)合培養(yǎng)基,如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米漿、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、馬鈴薯蛋白、馬鈴薯蛋白水解物、糖蜜等。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可為化學(xué)限定的培養(yǎng)基,例如如WO 98/37179中所限定的。所述發(fā)酵可作為分批、補(bǔ)料分批、重復(fù)補(bǔ)料分批(i^peated fed-batch)或連續(xù)發(fā)酵工藝進(jìn)行。在分批補(bǔ)料工藝中,在發(fā)酵起始之前,將包含一種或多種結(jié)構(gòu)和/或催化元件的化合物的部分添加至培養(yǎng)基,或不添加任何化合物,相應(yīng)地,該包含一種或多種結(jié)構(gòu)和/或催化元件的化合物剩余部分或全部在發(fā)酵工藝過(guò)程中補(bǔ)料。選用于補(bǔ)料的化合物可一同補(bǔ)料或彼此分開(kāi)補(bǔ)料至發(fā)酵工藝。在重復(fù)分批補(bǔ)料或連續(xù)發(fā)酵工藝中,在發(fā)酵過(guò)程中額外補(bǔ)料完全的起始培養(yǎng)基。 所述起始培養(yǎng)基可以與所述結(jié)構(gòu)元件補(bǔ)料一同或分開(kāi)補(bǔ)料。在重復(fù)分批補(bǔ)料工藝中,按間隔去除包含生物質(zhì)的發(fā)酵液部分,而在連續(xù)工藝中,發(fā)酵液的部分的去除連續(xù)進(jìn)行。因此, 發(fā)酵工藝是根據(jù)取出的發(fā)酵液的量補(bǔ)充部分新鮮培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,優(yōu)選補(bǔ)料分批、重復(fù)補(bǔ)料分批工藝或連續(xù)發(fā)酵工藝。目標(biāo)多肽的回收本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及發(fā)酵液的下游加工。在發(fā)酵工藝結(jié)束之后,可使用針對(duì)目標(biāo)多肽開(kāi)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù),從發(fā)酵液回收目標(biāo)多肽。待施用的相關(guān)下游加工技術(shù)取決于目標(biāo)多肽的特性。用于從發(fā)酵液回收目標(biāo)多肽的方法通常會(huì)涉及(但不限于)下述步驟中的一些或全部1)預(yù)處理發(fā)酵液(例如絮凝)2)從發(fā)酵液去除細(xì)胞和其他固體材料(初次分離)3)過(guò)濾4)濃縮5)過(guò)濾6)穩(wěn)定和標(biāo)準(zhǔn)化除了上述列舉的單元操作,可施用多種其他回收方法和步驟,例如pH調(diào)整,溫度變化,結(jié)晶,用活性炭處理包含目標(biāo)多肽的溶液,和使用多種吸附劑。通過(guò)使用本發(fā)明的方法,當(dāng)通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加例如MPG使晶體形成減少或消除時(shí),目標(biāo)多肽在回收中的產(chǎn)率更高。本發(fā)明進(jìn)一步在下述實(shí)施例中進(jìn)行說(shuō)明,其并不旨在以任何方式限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
培養(yǎng)基LB瓊脂,TY bullion培養(yǎng)基和BPX搖瓶培養(yǎng)基均描述于WO 94/14968。PS-I搖瓶培養(yǎng)基(10%蔗糖,4%大豆粉,Na2SO4 ·12Η20,0· 5% I CaCO3 和 0. 01% Pluronic Acid) 描述于美國(guó)專利6,255,076號(hào)的實(shí)施例28。菌株和供體生物枯草芽孢桿菌PL1801該菌株為具有破壞的apr和npr基因的枯草芽孢桿菌DN1885 (Diderichsen,B., Wedsted, U. , Hedegaard, L. , Jensen, B. R. , Sjoholm, C. (1990)Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from i Bacillus brevis. J. Bacteriol.,172,4315-4321)。地衣芽孢桿菌PP1962該菌株是WO 2005/123915 (Novozymes)中公開(kāi)的菌株MDT223的衍生物,具有下述其他修飾,描述于三個(gè)步驟步驟1 插入地衣芽孢桿菌L-氨肽酶基因以替代MDT223中amyL基因座處存在的蛋白酶基因。如WO 1996/029418 (Novozymes)中所述,通過(guò)接合導(dǎo)入整合載體,其攜帶來(lái)自地衣芽孢桿菌的L-氨肽酶基因,其側(cè)翼為異源串聯(lián)物(tandem)/蛋白酶基因上游的 cryIIIa啟動(dòng)子5’區(qū)和3’ amyL區(qū),將其整合入并從染色體切出。步驟2 將串聯(lián)物/cryll IA 啟動(dòng)子,其公開(kāi)于 WO 1999/043835 (Novozymes), 其后為大腸桿菌rrnB轉(zhuǎn)錄終止子,插入gntP基因座,從而構(gòu)建了 gntP缺失。使用質(zhì)粒 pMDT081(SEQ ID而3;圖1)以供整合入地衣芽孢桿菌的染色體上的gntP基因座。步驟3 修飾L12基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)以提供L12蛋白表達(dá)的強(qiáng)減少。如 WO 1996/029418 (Novozymes)中所述,導(dǎo)入具有變體核糖體結(jié)合位點(diǎn)的整合載體質(zhì)粒,并通過(guò)整合和切出將變體基因插入染色體,替代天然的L12基因。分離了所得的紅霉素敏感菌株,其包含變體L12基因。L12 RBS的最終變化如下所述(下劃線所示堿基為L(zhǎng)12基因的起始密碼子)(SEQ ID NO 4) Sf^Mi^^J :atgaaagaggaggaatgaaataatg(SEQ ID NO :5)突變的 EF 變體atgaaagacgcgtaatgaaata幽地衣芽孢桿菌PL4198該菌株是描述于WO 2005/123915中的菌株MDT223的衍生物,具有下述逐步添加的修飾步驟1 將串聯(lián)物/cryIIIA 啟動(dòng)子,其公開(kāi)于 WO 1999/043835 (Novozymes), 其后為大腸桿菌rrnB轉(zhuǎn)錄終止子,插入gntP基因座,從而構(gòu)建gntP缺失。使用質(zhì)粒 pMDT081(SEQ ID NO 3)以供整合在地衣芽孢桿菌染色體上的gntP基因座。步驟2 修飾L12基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)以提供L12蛋白表達(dá)的強(qiáng)減少。如上所述,導(dǎo)入具有變體核糖體結(jié)合位點(diǎn)的整合載體質(zhì)粒,并通過(guò)整合和切出將變體基因插入染色體,替代天然的L12基因。分離了所得的紅霉素敏感菌株,其包含變體L12基因。對(duì)于PP1962菌株,L12 RBS的最終變化已示于步驟1)。步驟3 插入地衣芽孢桿菌amyL基因以替代MDT223中amyL基因座處存在的JP170 蛋白酶基因。如WO 1996/029418 (Novozymes)中所述,通過(guò)接合導(dǎo)入整合載體質(zhì)粒,其攜帶來(lái)自地衣芽孢桿菌的amyL基因,其側(cè)翼為異源串聯(lián)物/蛋白酶基因上游的cryllla啟動(dòng)子 5’區(qū)和3’ amyL區(qū),將其整合入并從染色體切出。步驟4 插入修飾的枯草芽孢桿菌aprE蛋白酶基因(SEQ ID NO 6)以替代在步驟 3中插入的amyL基因。如上所述,通過(guò)結(jié)合導(dǎo)入整合載體質(zhì)粒,其攜帶所述蛋白酶基因,該基因側(cè)翼為5’串聯(lián)物/cryIIIA和amyL3’區(qū)段,將其整合入并從染色體切出。步驟5 通過(guò)缺失765bp spoIIAC基因的核苷酸70至436來(lái)使spoIIAC基因 (sigF)失活。缺失是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法使用溫度敏感性質(zhì)粒和同源重組實(shí)施的。步驟6 通過(guò)缺失從基因pgsB中的核苷酸607至pgsAA基因中的核苷酸180(兩個(gè)核苷酸均包含在內(nèi))的染色體區(qū)來(lái)使PgsB-、pgsC-和pgsAA-基因失活。缺失是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法使用溫度敏感性質(zhì)粒和同源重組實(shí)施的。質(zhì)粒 ρΑΝ^9編碼地衣芽孢桿菌推定的金屬肽酶BL00829的基因的缺失型式是使用通過(guò)重疊延伸的剪切(SOE)通過(guò) PCR 來(lái)構(gòu)建的(Horton 等,1989,Gene 77(1) :61-68)。將 BL00^9 基因的5,和3,區(qū)從地衣芽孢桿菌SJ1904DNA通過(guò)對(duì)于5,BLOOS^片段使用引物AN354 (其導(dǎo) Λ 5,sacll限制位點(diǎn))和引物AN355而對(duì)于BL008293'片段使用引物AN356和AN357 (其導(dǎo)入NotI限制位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下所示弓丨物 AN354(SEQ ID NO 7) :ttgcacccgcggatacgagggagtggcgatgtiJ^IjANS55 (SEQ ID NO 8) :gaatgaataaaagtgaagcccaagagaaggctttttcacaagatta弓丨物AN356(SEQ ID NO :9) :taatcttgtgaaaaagccttctcttgggcttcacttttattcattc弓丨物 AN357(SEQ ID NO :10) :aagcatgcggccgcgatctttctgcatcatatgcPCR擴(kuò)增是在標(biāo)準(zhǔn)條件下運(yùn)行,并使用瓊脂糖-0. 5X TBE凝膠顯影具有預(yù)期大小639bp(5,片段)和648bp(3,片段)的產(chǎn)物。最終SOE片段命名為8 Δ 14 (SEQ ID NO: 11),并根據(jù)Horton等,1989使用引物對(duì)AN354和AN357生成。存在于SOE產(chǎn)物829 Δ 14上的BL00^9基因的截短型式編碼14aa的多肽,其缺失了天然BL00^9蛋白中間的138aa。質(zhì) U pAN829 (SEQ ID N0:12;圖2)是通過(guò)將用限制酶sacll和NotI切割的PCR產(chǎn)物8 Δ 14 連接至包含ΡΕ194的溫度敏感性起點(diǎn)的載體質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建的。該質(zhì)粒用于通過(guò)雙交換事件從地衣芽孢桿菌染色體缺失BLOOS^基因。對(duì)于合適宿主菌株和整合步驟的進(jìn)一步描述可見(jiàn)于 TO 2005/123915。實(shí)施例1.突變的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶宿主的構(gòu)建該實(shí)施例描述了包含兩個(gè)拷貝的編碼分泌的α-淀粉酶的基因的地衣芽孢桿菌菌株的構(gòu)建。然后通過(guò)在編碼推定的金屬蛋白酶見(jiàn)00擬9的基因中導(dǎo)入缺失來(lái)構(gòu)建該菌株的突變體。用于該實(shí)施例的α-淀粉酶為最初由嗜堿的芽孢桿菌菌種JP170產(chǎn)生的 JEl α-淀粉酶多肽。這是包含于質(zhì)粒pTVB115,描述于W099/23211的基因。該特定基因在下文中會(huì)稱作“jel”。M0L2650 二拷貝iel α -淀粉酶菌株如W02005/123915的實(shí)施例6中所述,將jel基因轉(zhuǎn)移至設(shè)計(jì)以允許α -淀粉酶表達(dá)盒整合入地衣芽孢桿菌菌株染色體的整合載體,所述整合載體已經(jīng)含有整合在amyL 基因座和xylA基因座的人工串聯(lián)物/cryIIIA啟動(dòng)子。這是通過(guò)在該啟動(dòng)子的cryIIIA穩(wěn)定子區(qū)(stabilizer region)和在amyL和xylA的下游區(qū)段分別使用雙重同源重組來(lái)完成的。對(duì)于合適宿主菌株和整合步驟的進(jìn)一步描述可見(jiàn)于WO 2005/123915。分別用于amyL和xylA基因座的整合載體pM0L2598(SEQ ID N0:13;圖3)和 PM0L2606 (SEQ ID NO 14 ;圖4)是通過(guò)將編碼JEl淀粉酶的DNA片段插入pE194衍生載體來(lái)構(gòu)建的。這些質(zhì)粒亦可通過(guò)從已知的標(biāo)準(zhǔn)載體如PE194克隆PCR片段或連接合成的DNA 片段來(lái)制備。將載體pM0L2598轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態(tài)細(xì)胞,在30°C就紅霉素抗性 O微克/ml)進(jìn)行選擇。所得的轉(zhuǎn)化體為M0L2598(PL1801/pM0L2598)。然后通過(guò)感受態(tài) (competence)、電穿孔或接合將該質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化入上述的地衣芽孢桿菌PP1962,并通過(guò)雙重同源重組用jel淀粉酶基因替代L-氨肽酶基因。所得的菌株分離為M0L2614。將載體pM0L2606亦轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態(tài)細(xì)胞,在30°C就紅霉素抗性O(shè)微克/ml)進(jìn)行選擇。所得的質(zhì)粒為M0L2608(PL1801/pM0L2606)。然后通過(guò)感受態(tài)、 電穿孔或接合將該質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化入上述的地衣芽孢桿菌M0L2614,并通過(guò)雙重同源重組將 jel基因整合入xyl基因座。所得的菌株分離為M0L2650。最終的M0L2650菌株具有從描述于W02005/123915實(shí)施例6的強(qiáng)啟動(dòng)子P17表達(dá)的二拷貝的jel淀粉酶基因。該整合載體亦在下述位置含有來(lái)自地衣芽孢桿菌的prsA基因,所述位置將克隆的bmyl基因置于雙順?lè)醋硬倏v子中的prsA的上游??截愔晃挥赼myL 基因座,而第二拷貝位于xyl基因座。如專利W02005/123915中所述,該菌株進(jìn)一步在編碼蛋白酶AprE和C-組分的基因中有缺失。此外,L12基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)修飾,從而導(dǎo)致L12蛋白表達(dá)的強(qiáng)減少(見(jiàn)上)。AN407 突變的 M0L2650 菌株通過(guò)接合將質(zhì)粒pAN^9轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌M0L2650(如上所述),并通過(guò)雙重同源重組用截短的BL00^9基因偽四替代BL00^9基因。所得的菌株分離為AN407。除了編碼推定的金屬蛋白酶BL00829的基因通過(guò)缺失突變之外,AN407菌株與 M0L2650菌株同基因。實(shí)施例2突變的地衣芽孢桿菌β -淀粉酶宿主的構(gòu)建該實(shí)施例描述了兩個(gè)包含編碼分泌的淀粉酶的基因的地衣芽孢桿菌菌株; 除了其一通過(guò)在編碼推定的金屬蛋白酶BL00829的基因中缺失而突變之外,這兩個(gè)菌株是同基因的。用于該實(shí)施例的β-淀粉酶是最初由嗜熱細(xì)菌熱產(chǎn)硫磺梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)產(chǎn)生的β -淀粉酶,其用源自地衣芽孢桿菌amyL的異源分泌信號(hào)序列替代天然信號(hào)序列。該特定雜合基因在下文中會(huì)稱作“bmyl”,且其核苷酸序列示于SEQ ID NO :15。AN411 二拷貝bmyl β -淀粉酶菌株如W02005/123915的實(shí)施例6中所述,將bmyl基因(SEQ ID NO 15)轉(zhuǎn)移至設(shè)計(jì)以允許β -淀粉酶表達(dá)盒整合入地衣芽孢桿菌菌株染色體的整合載體,所述染色體已經(jīng)含有整合在amyL基因座和xyIA基因座的人工串聯(lián)物/cryIIIA啟動(dòng)子。這是通過(guò)在cryIIIA 穩(wěn)定子區(qū)和在amyL和xylA的下游區(qū)段分別使用雙重同源重組來(lái)完成的。對(duì)于合適宿主菌株和整合步驟的進(jìn)一步描述可見(jiàn)于WO 2005/123915。分別用于amyL和xylA基因座的整合載體pAN369 (SEQ ID NO 16 ;圖5)和PAN405 (SEQ ID NO :17 ;圖6)是通過(guò)將編碼bmyl β -淀粉酶的DNA片段插入ρΕ194衍生載體來(lái)構(gòu)建的。這些質(zhì)粒亦可通過(guò)從已知的標(biāo)準(zhǔn)載體如ΡΕ194克隆PCR片段或連接合成DNA 片段來(lái)制備。將載體ρΑΝ369轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態(tài)細(xì)胞,在30°C就紅霉素抗性 (2微克/ml)進(jìn)行選擇。所得的轉(zhuǎn)化體為AN369 (PL1801/pAN369)。然后通過(guò)感受態(tài)、電穿孔或接合將該質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化入上述的地衣芽孢桿菌PL4198菌株,并通過(guò)雙重同源重組用 bmyl β -淀粉酶基因替代蛋白酶基因。所得的菌株分離為ΑΝ374。將載體ρΑΝ405亦轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌PL1801感受態(tài)細(xì)胞,在30°C就紅霉素抗性 (2微克/ml)進(jìn)行選擇。所得的轉(zhuǎn)化體為AN405 (PL1801/pAN405)。然后通過(guò)感受態(tài)、電穿孔或接合將該質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化入上述的地衣芽孢桿菌AN374,并通過(guò)雙重同源重組將bmyl基因整合入xyl基因座。所得的菌株分離為AN411。最終的AN411菌株具有從描述于W02005/123915實(shí)施例6的強(qiáng)啟動(dòng)子P17表達(dá)的二拷貝的bmyl β -淀粉酶基因??截愔晃挥赼myL基因座,而第二拷貝位于xyl基因座。 此外,該菌株在編碼蛋白酶AprE和C組分的基因中有缺失,如專利W02005/123915中所述。 此外,L12基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)修飾,從而導(dǎo)致L12蛋白表達(dá)的強(qiáng)減少(見(jiàn)上)。AN420 突變的 AN411 菌株通過(guò)接合將質(zhì)粒pAN^9轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌AN411 (如上所述),并通過(guò)雙重同源重組用截短型式偽四替代SEQ ID NO :1的推定的金屬蛋白酶編碼基因。所得的菌株分離為 AN420。除了編碼推定的金屬蛋白酶BL00829的基因通過(guò)缺失突變之外,AN420菌株與 AN411菌株同基因。實(shí)施例3.在來(lái)自實(shí)施例2的地衣芽孢桿菌菌株中的β -淀粉酶產(chǎn)生如下所述進(jìn)行來(lái)自實(shí)施例2的地衣芽孢桿菌菌株的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝。所有的培養(yǎng)基通過(guò)本領(lǐng)域已知方法滅菌。除非另行描述,使用自來(lái)水。在下述配方中提及的成分濃度是進(jìn)行任何接種之前的濃度。培養(yǎng)基LB瓊脂10g/l來(lái)自酪蛋白的蛋白胨;5g/l酵母提取物;10g/l氯化鈉;12g/l細(xì)菌瓊脂,調(diào)整至PH 7. 0+/-0. 2。使用來(lái)自Merck的預(yù)混物(LB-瓊脂(Miller) 110283)。M-9緩沖液磷酸氫二鈉,2H20 8. 8g/l ;磷酸二氫鉀3g/l ;氯化鈉4g/l ;硫酸鎂, 7H20 0. 2g/l (在該緩沖液中使用去離子水)。PRK-50 :110g/l 大豆粗粒(soy grits);磷酸氫二鈉,2H20 5g/l ;消泡劑 (Struktol SB2121 ;Schill & SeiIacher,Hamburg,Germany) lml/1。在滅菌之前用 NaOH/ H3PO4將pH調(diào)整至8.0。組成培養(yǎng)基(Make-up medium)胰蛋白胨(來(lái)自Difco (Bacto 胰蛋白胨胰消化酪蛋白211699的酪蛋白水解物)30g/l ;硫酸鎂,7H20 4g/l ;磷酸氫二鉀7g/l ;磷酸氫二鈉,2H20 7g/l ;硫酸銨4g/l ;檸檬酸(鹽)0.78g/l ;維生素(硫胺素二氯化物34. 2mg/ 1 ;核黃素2. 9mg/l ;煙酸23mg/l ;D-泛酸鈣28. 5mg/l ;吡哆醛-HCl 5. 7mg/l ;D-生物素 1. lmg/1 ;葉酸 2. 9mg/l);微量金屬(MnSO4, H2O 39. 2mg/l ;FeSO4, 7H20 157mg/l ;CuS04,5H20 15. 6mg/l ;ZnCl2 15. 6mg/l);消泡劑(Struktol SB2121 ;Schill & SeiIacher,Hamburg,Germany) 1. 25ml/l ;在滅菌之前用 Na0H/H3P04 將 pH 調(diào)整至 6. 0。給料培養(yǎng)基;葡萄糖,IH2O 820g/l發(fā)酵步驟將地衣芽孢桿菌菌株在37°C在LB瓊脂斜面上生長(zhǎng)一日。然后用M-9緩沖液洗滌瓊脂,并測(cè)量所得的細(xì)胞懸液在650nm處的光密度(OD)。將接種搖瓶(含100ml PRK-50培養(yǎng)基)用0D(650nm)xml細(xì)胞懸液=0. 1的接種物來(lái)接種。將搖瓶在37°C以300rpm溫育 20小時(shí)。使用的發(fā)酵器為配備有溫度控制系統(tǒng)、使用氨水和磷酸的pH控制和在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中測(cè)量> 20%的氧飽和度的溶解氧電極的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵器。在主發(fā)酵器(發(fā)酵罐)中的發(fā)酵是通過(guò)用來(lái)自燒瓶的生長(zhǎng)培養(yǎng)物接種主發(fā)酵器來(lái)起始的。接種體積為10% (對(duì)于720ml組成培養(yǎng)基為80ml,在接種之后得到800ml起始液)。發(fā)酵參數(shù)為溫度38°C;pH 6. 8至7.2(使用氨水和磷酸,控制6.8(氨水),7. 2磷酸)。通氣1.5升/分鐘,攪拌1500印111。如下所述添加補(bǔ)料培養(yǎng)基在發(fā)酵起始時(shí)起始補(bǔ)料速率為0. 05g/分鐘/kg,在8 小時(shí)之后線性增加至0. 16g/分鐘/kg,并維持在0. 16g/分鐘/kg直至發(fā)酵結(jié)束,這些都是相對(duì)于發(fā)酵液恰在接種之后的起始重量。發(fā)酵在3日之后終止(大約70小時(shí))。β -淀粉酶泖丨定β-淀粉酶作用于麥芽六糖(G6)的非還原端以形成麥芽糖(G2)和麥芽四糖 (G4)。產(chǎn)生的G4與G6相比在乳糖氧化酶和&存在下形成H2A的反應(yīng)更強(qiáng)。形成的H2A 在過(guò)氧化物酶存在下激活4-氨基安替比林(AA)和N-乙基-N-磺丙基-間甲苯胺(TOPS) 的氧化縮合以形成紫色產(chǎn)物,其可通過(guò)其在540處的吸光度加以量化。該反應(yīng)是由麥芽六糖起始的。當(dāng)除淀粉酶之外所有的組分均過(guò)剩時(shí),吸光度上升速率與存在的淀粉酶活性成比例。該分析由Konelab自動(dòng)進(jìn)行的。一個(gè)β -淀粉酶單元(BAMU)定義為在此文件中描述的條件下每分鐘降解一 μ mol 麥芽六糖的酶量?;钚允窍鄬?duì)于酶標(biāo)樣來(lái)確定的。亞硫酸鹽和Termamyl并不顯著干擾BAMU結(jié)果。其他過(guò)氧化氫產(chǎn)生或消耗劑可顯示假BAMU活性。裝置· Konelab Arena 30 分析儀·分析天平(例如 Mettler AT200, Mettler AE100)·稀釋裝置(例如Hamilton稀釋器)·磁力攪拌器· pH 計(jì)(例如 Radiometer PHM 93)·移液管表1反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種突變的細(xì)菌細(xì)胞,所述細(xì)胞產(chǎn)生至少一種目標(biāo)異源多肽,其中所述細(xì)胞與其他為同基因的但非突變的細(xì)胞相比,具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞,其為原核細(xì)胞,優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞,其為芽孢桿菌屬細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的細(xì)胞,其為嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽 ?包桿菌(Bacillus lichenifprmis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的細(xì)胞,其中所述包含與SEQID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的細(xì)胞,其在編碼包含與SEQID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。
7.權(quán)利要求6的細(xì)胞,其中所述基因包含與SEQID NO :1中所示序列至少70%相同的核苷酸序列的多核苷酸。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的細(xì)胞,其在至少一個(gè)多核苷酸中有突變,其中所述至少一個(gè)多核苷酸的具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴(yán)格雜交條件下與具有SEQ ID N0:1中所示的序列的多核苷酸或其相應(yīng)互補(bǔ)序列雜交。
9.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的細(xì)胞,其中所述基因部分或完全從染色體缺失,或包含至少一個(gè)移碼突變或至少一個(gè)無(wú)義突變。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的細(xì)胞,與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,不具有包含與 SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的可測(cè)量的表達(dá)。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的細(xì)胞,其中所述至少一種異源多肽包含酶。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞,其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的細(xì)胞,其與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,具有目標(biāo)異源多肽的改善的產(chǎn)生。
14.一種用于構(gòu)建突變的細(xì)菌細(xì)胞的方法,所述方法包括下述步驟a)使細(xì)菌細(xì)胞突變;和b)選擇突變細(xì)胞,其與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,具有減少的包含與SEQID NO 2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平。
15.權(quán)利要求14的方法,其中所述細(xì)胞為原核細(xì)胞,優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法,其中所述細(xì)胞為芽孢桿菌屬細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法,其中所述細(xì)胞為嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
18.權(quán)利要求14-17任一項(xiàng)的方法,其中所述包含與SEQID NO :2中所示序列至少70% 相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。
19.權(quán)利要求14-18任一項(xiàng)的方法,其中步驟(a)中的細(xì)胞在編碼包含與SEQID NO 2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞,其中所述基因包含與SEQID NO :1中所示序列至少70%相同的核苷酸序列的多核苷酸。
21.權(quán)利要求14-20任一項(xiàng)的方法,其中步驟(a)中的細(xì)胞在至少一個(gè)多核苷酸中突變,其中所述至少一個(gè)多核苷酸的具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴(yán)格雜交條件下與具有SEQ ID NO 1中所示的序列的多核苷酸或其相應(yīng)互補(bǔ)序列雜交。
22.權(quán)利要求14-21任一項(xiàng)的細(xì)胞,其中步驟(a)中的細(xì)胞通過(guò)下述方法突變使所述基因部分或完全從細(xì)胞的染色體缺失,或?qū)⒅辽僖粋€(gè)移碼突變或至少一個(gè)無(wú)義突變導(dǎo)入所述基因。
23.權(quán)利要求14-22任一項(xiàng)的方法,其中在步驟(b)中選擇的細(xì)胞與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,不具有包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的可測(cè)量的表達(dá)。
24.權(quán)利要求14-23任一項(xiàng)的方法,其中所述至少一種目標(biāo)異源多肽包含酶。
25.權(quán)利要求對(duì)的方法,其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。
26.權(quán)利要求14-25任一項(xiàng)的方法,其中所述細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)染色體整合的多核苷酸拷貝,所述多核苷酸編碼至少一種目標(biāo)異源多肽。
27.一種用于產(chǎn)生目標(biāo)異源多肽的方法,所述方法包括下述步驟a)培養(yǎng)產(chǎn)生至少一種目標(biāo)異源多肽的突變細(xì)菌細(xì)胞,其中所述突變細(xì)胞與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,具有減少的包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平,和b)分離目標(biāo)多肽。
28.權(quán)利要求27的方法,其中所述細(xì)胞為原核細(xì)胞,優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。
29.權(quán)利要求觀的方法,其中所述細(xì)胞為芽孢桿菌屬細(xì)胞。
30.權(quán)利要求四的方法,其中所述細(xì)胞為嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
31.權(quán)利要求27-30任一項(xiàng)的方法,其中所述包含與SEQID NO 2中所示序列至少70% 相同的氨基酸序列的多肽是金屬肽酶。
32.權(quán)利要求27-31任一項(xiàng)的方法,其中步驟(a)中的細(xì)胞在編碼包含與SEQID NO 2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的基因中有突變。
33.權(quán)利要求32的細(xì)胞,其中所述基因包含與SEQID NO :1中所示序列至少70%相同的核苷酸序列的多核苷酸。
34.權(quán)利要求27-33任一項(xiàng)的方法,其中步驟(a)中的細(xì)胞在至少一個(gè)多核苷酸中有突變,其中所述至少一個(gè)多核苷酸的具有至少IOObp大小的亞序列在中等嚴(yán)格雜交條件下與具有SEQ ID NO 1中所示的序列的多核苷酸或其相應(yīng)互補(bǔ)序列雜交。
35.權(quán)利要求27-34任一項(xiàng)的細(xì)胞,其中步驟(a)中的細(xì)胞通過(guò)下述方法突變使所述基因部分或完全從細(xì)胞的染色體缺失,或?qū)⒅辽僖粋€(gè)移碼突變或至少一個(gè)無(wú)義突變導(dǎo)入所述基因。
36.權(quán)利要求27-35任一項(xiàng)的方法,其中在步驟(a)中的細(xì)胞與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,不具有包含與SEQ ID NO :2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的可測(cè)量的表達(dá)。
37.權(quán)利要求27-36任一項(xiàng)的方法,其中所述至少一種目標(biāo)異源多肽包含酶。
38.權(quán)利要求37的方法,其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。
39.權(quán)利要求27-38任一項(xiàng)的方法,其中所述突變的細(xì)胞與其他為同基因但非突變的細(xì)胞相比,具有目標(biāo)異源多肽的改善的產(chǎn)生。
全文摘要
產(chǎn)生至少一種目標(biāo)異源多肽的突變的細(xì)菌細(xì)胞,其中所述細(xì)胞與其他為同基因的但非突變的細(xì)胞相比,具有減少的包含與SEQ ID NO2中所示序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的表達(dá)水平;用于產(chǎn)生所述突變細(xì)胞的方法;和用于使用所述突變細(xì)胞產(chǎn)生目標(biāo)多肽的方法。SEQ ID NO2代表推定的金屬蛋白酶。
文檔編號(hào)C12N15/75GK102414317SQ201080018598
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者A.K.尼爾森, M.D.拉斯馬森, N.班克 申請(qǐng)人:諾維信公司