專(zhuān)利名稱(chēng)：糖類(lèi)結(jié)合模塊及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物，其特異結(jié)合至HIV糖蛋白的抗原表位。本發(fā)明也涉及抑制HIV活性的方法。
背景技術(shù)：
已知人免疫缺陷病毒(HIV)引起獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，且因?yàn)镠IV表現(xiàn)快速遺傳漂移，出現(xiàn)了廣泛分歧的株。因此，檢測(cè)和治療變異株已證明為有挑戰(zhàn)的且是困難的。也有緊急的需要開(kāi)發(fā)有效的防病的疫苗和其他治療策略以在該流行病持續(xù)不衰退時(shí)限制HIV傳播。最成功的疫苗由可活性衰減的或滅活的病毒顆粒組成。然而，HIV相關(guān)的猿免疫缺陷病毒的活性衰減，引起沒(méi)有所得病原性的保護(hù)性的反應(yīng)還未被實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)生使人類(lèi)實(shí)驗(yàn)棘手的安全問(wèn)題。同樣，HIV有許多復(fù)雜的機(jī)制來(lái)有效地躲避被膜糖蛋白定向的抗體反應(yīng)，包括通過(guò)構(gòu)象和立體限制的聚糖屏蔽和掩飾脆弱的受體結(jié)合位點(diǎn)所得屏蔽井-保守的結(jié)構(gòu)。因此，研究轉(zhuǎn)向基于 被膜蛋白的免疫原作為引出抗體的方法。糖蛋白120 (gpl20)為HIV-1被膜棘突的重要組分。Gpl20的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域與gp41相互作用，并且外部結(jié)構(gòu)域十分可變且被重糖基化(Kwong, RD.等.Structure of an HIVgpl20 envelope glycoproteinin complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody.Nature 393，648-659 (1998)) o基于比較序列分析，gpl20被分成五個(gè)保守段(Cl至C5)和五個(gè)可變(VI至 V5)區(qū)域(Willey, R.L.等.Identification of conserved and divergent domainswithin the envelope gene of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus.Proc Natl Acad Sci USA 83，5038-5042 (1986)和 Modrow，S.等.Computer-assistedanalysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiencyvirus isolates -prediction of antigenic epitopes in conserved and variableregions.J Virol 61,570-578(1987))。Cl 和 C5 區(qū)域提供 gpl20 與 gp41 接觸的主要區(qū)域(Helseth，E.，Olshevsky, U.，F(xiàn)urman，C.&Sodroski，J.Human immunodeficiencyvirus type I gpl20envelope glycoprotein regions important for associationwith the gp41 transmembrane glycoprotein.J Virol 65，2119-2123 (1991))，其他保守區(qū)域(C2 至 C4)在 gpl20 分子內(nèi)形成疏水核(Moore，J.P.，Sattentau，QJ.，Wyatt,R.&Sodroski, J.Probing the structure of the human immunodeficiency virussurface glycoprotein gp 120 with a panel of monoclonal antibodies.J Virol 68，469-484 (1994) and Moore, J.P.，Willey, R.L.，Lewis, GK.，Robinson，J.&Sodroski，J.1mmunological evidence for interactions between the first，second，and fifthconserved domains of the gpl20 surface glycoprotein of human immunodeficiencyvirus type l.J Virol 68,6836-6847(1994))且可變區(qū)域，Vl 至 V3，暴露在單肢 gpl20 表面，并具有用于抗體識(shí)別和⑶4的結(jié)合位點(diǎn)的主要表位(Chen，L.等.Structural basisof immune evasion at the site of CD4attachment on HIV-1 gpl20.Science 326，1123-1127(2009)，Moore, J.P.&Sodroski, J.Antibody cross-competition analysis ofthe human immunodeficiency virus type I gpl20 exterior envelope glycoprotein.JVirol 70，1863-1872 (1996)，Pollard, S.R.，Rosa，M.D.，Rosa，JJ.&Wiley, D.C.Truneatedvariants of gpl20 bind CD4 with high affinity and suggest a minimum CD4 bindingregion.EMBO J 11，585-591 (1992)and Olshevsky,U.等.Identification of individualhuman immunodeficiency virus type I gpl20 amino acids important for CD4receptor binding.J Virol 64，5701-5707 (1990))。目前，在美國(guó)47例中和的識(shí)別HIV的單克隆抗體OnAbs)已進(jìn)入I期或II期臨床試驗(yàn)。其中，人mAb 2F5、4E10和2G12已經(jīng)以其識(shí)別HIV-1被膜糖蛋白被很好表征(Armbruster， C.等.A phase I trial with two human monoclonal antibodies(hMAb2F5，2G12)against HIV-1.AIDS 16，227-233 (2002)和 Stiegler，G.等.Antiviralactivity of the neutralizing antibodies 2F5 and 2G1 2 in asymptomaticHIV-l-1nfected humans:a phase I evaluation.AIDS 16，2019-2025 (2002)) 大多數(shù)這些抗體主要革G向在病毒表面以其成熟三聚體形式封閉的gpl20區(qū)域(Zwick，M.B.&Burton，D.R.HIV-1 neutralizatio n !mechanisms and relevance to vaccine design.Curr HIVRes 5,608-624(2007)和 Krauss， IJ.等.Fully synthetic carbohydrate HIV antigensdesigned on the logic of the 2G12 antibody.JAm Chem Soc 129，11042-11044 (2007))。Gp120剩余的暴露面被用N連接的甘露糖聚糖Man9-G1CNAC (M9)重糖基化，且很少抗體被分離至成功結(jié)合至此種(免疫沉默的)區(qū)域。然而人mAb2G12被報(bào)道具有對(duì)抗HIV-1的分化體 A 和 B 的中和活性(Trkola，A.等.Human monoclonal antibody 2G1 2 definesa distinctive neutralization epitope on the gpl20 glycoprotein of humanimmunodeficiency virus typel.J Virol 70，1100-1108 (1996))并結(jié)合至HIV-1 gpl20 的“沉默的表面”上的表位。使用位點(diǎn)定向突變的丙氨酸掃描研究顯示該表位主要覆蓋高-甘露糖或gpl20上殘基N295，N332，N386，N392，N397和N448的雜合聚糖結(jié)構(gòu)(Sanders,R.W.等.The mannose-dependent epitope for neutralizing antibody 2G1 2 on humanimmunodeficiency virus type I glycoprotein gpl20.J Virol 76，7293-7305 (2002)和 ScanIan， CN.等.The broadly neutralizing ant1-human immunodeficiency virustype lantibody 2G1 2 recognizes a cluster of alphal- > 2mannose residues on theouter face of gpl20.J Virol 76，7306-7321 (2002))，不像多數(shù)抗體識(shí)別氨基酸側(cè)鏈的特異構(gòu)型。因此存在以下可能:2G12可被轉(zhuǎn)變成基于糖類(lèi)表位識(shí)別的寬范圍的HIV中和抗體。2G12(PDB ID:1ZLS)的晶體結(jié)構(gòu)及其與寡糖M9的復(fù)合物(PDB ID:10P5)顯示兩個(gè)Fab組裝成Vh結(jié)構(gòu)域交換二聚體，且該Vh結(jié)構(gòu)域位于直接與N-連接的M9相互作用的2G12 重鏈上，尤其是在 gpl20 上包含四甘露糖 Mana (I, 2)Mana (1,2)Mana (1,3)Mana (Man4)部分的Dl臂。此外，在gpl20上的2G12識(shí)別位點(diǎn)的分子模型已顯示在N332，N339和N392上的 N-連接聚糖對(duì)于 2G12 結(jié)合是關(guān)鍵的(Calarese，D.A.等.Antibody domain exchangeis an immunological solution to carbohydrate cluster recognition.Science 300，2065-2071 (2003))。合成的寡糖Man4和Man9可抑制gpl20和2G12之間的結(jié)合，因此這些寡甘露糖dendrion被鑒定為HIVl中和劑。而且，幾種HIV mAb的IC5。中和曲線顯示2G12的中和能力是中等的(Binley，J.M.等.Comprehensive cross-clade neutralizationanalysis of a panel of ant1-human immunodeficiency virus type I monoclonalantibodies.J Virol78,13232-13252(2004))。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)分類(lèi)數(shù)據(jù)(ProteinStructure Classification Database) (CATH)(Orengo, CA.等.CATH-a hierarchic classification of protein domain structures.Structure 5，1093-1108 (1997))，2G12的Vh結(jié)構(gòu)域被分類(lèi)為具有特特異性特征β -夾心折疊，免疫球蛋白類(lèi)(Ig-類(lèi))結(jié)構(gòu)的超家族2.60.40.10。有趣的是，黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶的粒狀淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)，AnSBD，(PDB ID:IAC0)也已被鑒定于相同的同源超家方矣中(Christiansen, C.等.The carbohydrate-binding module family20-diversity, structure, and function.FEBS J 276，5006-5029 (2009))。2G12 和此糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)之間的結(jié)構(gòu)相似性可暗示可被闡明的作為有效的檢測(cè)和預(yù)防疾病疫苗的共同功能。發(fā)明概述本發(fā)明提供 預(yù)防性地或治療性地抑制受試者的HIV感染的方法，其中所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類(lèi)結(jié)合模塊的抗體模擬物和藥學(xué)可接受載體。附圖簡(jiǎn)述

圖1.淀粉結(jié)合CBM和2G12的結(jié)構(gòu)、序列和功能的比較。RoSBD與以下的結(jié)構(gòu)重疊(深灰):(a) AnSBD (淺灰)；(b) 2G12VH結(jié)構(gòu)域(淺灰)和(c) 2G12VL結(jié)構(gòu)域(淺灰)。(b)中的Man4以黏代表顯示，(d)基于Dali重疊結(jié)果的RoSBD，AnSBD，2G12VH和2G12Vl的多重序列比對(duì)。下劃線的殘基表示β -鏈區(qū)域，且黑體字形式的氨基酸表示在SBD中的配體結(jié)合殘基和在2G12Vh結(jié)構(gòu)域中的Man4-結(jié)合位點(diǎn)，(e)將一百微升的HIV-PC溶液加載至96孔ELISA 板，所述 ELISA 板分別包被有 IOOnM 人 IgG1 第二抗體(2C11),HIV-1 p24 mAb (N29)、HIV-1 gp41mAb (AG10H9) ,HIV-1 gpl20 mAb (ED8.D4)，2G12, RoSBO 和 AnSBD。HRP 結(jié)合的重組gpl20抗原用于信號(hào)檢測(cè)。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖2.RoSBD-HIV結(jié)合的特異性。一百微升HIV-PC，RoSBD mAb和HCV-PC在一起混合，加載至RoSBD包被的ELISA板，使其在37°C反應(yīng)Ih0通過(guò)加入100 μ L的:(a) HRP-結(jié)合的重組gpl20抗原；(b)HRP-結(jié)合的HCV重組抗原；(c)HRp-結(jié)合的HTLV重組抗原或(d)抗小鼠IgG HRP結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。在此甄別值(COV)被定義為ELISA分析中來(lái)自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過(guò)OD值除以COV計(jì)算。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.05)。圖3.AnSBD-HIV結(jié)合的特異性。一百微升HIV-PC，RoSBD mAb和HCV-PC在一起混合，加載至AnSBD包被的ELISA板，使其在37°C反應(yīng)lh。通過(guò)加入100 μ L的:(a) HRP-結(jié)合的重組gpl20抗原；(b)HRP-結(jié)合的HCV重組抗原；(c)HRP-結(jié)合的HLV抗原或(d)HRP-結(jié)合的抗小鼠IgG來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。在此甄別值(COV)被定義為在ELISA分析中來(lái)自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過(guò)OD值除以COV計(jì)算。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖4.HIV至SBD的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。HIV-PC分別與相同體積的500nM gpl40、2G12mAb，gpl20 mAb (ED8.D4), gp41 mAb (AG10H9), p24mAb (N29)或人 IgG1 第二抗體(2C11)在 37°C混合lh。該混合物唄轉(zhuǎn)移至包被有(a) RoSBD或(b) AnSBD的板并用HRP結(jié)合的重組gp120抗原檢測(cè)。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖5.聚糖的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。HIV-PC與500 μ M的大豆凝集素(SBA)、G7、β CD或甘露糖的每一種在37°C混合lh。該混合物被轉(zhuǎn)移至用IOOnM: (a) RoSBD和(b) AnSBD預(yù)包被的ELISA板。該反應(yīng)用HRP結(jié)合重組gpl20抗原檢測(cè)。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.01)。圖6.使用mAb和SBD100 μ L的HIV-1發(fā)生率/患病率性能組(PRB601)成員的HIV結(jié)合曲線被分別加載到用 IOOnM:(a)HIV-l-p24mAb(N29) ； (b)HIV-l-gp41mAb (AG10H9)；(c)gpl20mAb (ED8.D4) ； (d) HIV-l_2G12mAb ； (e) RoSBO 或(f) AnSBD 預(yù)包被的 ELISA 板且用HRP-結(jié)合重組的gp 120抗原檢測(cè)。在此甄別值(COV)被定義為在ELISA分析中來(lái)自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過(guò)OD值除以COV計(jì)算。圖7.HIV-2G12和HIV-SBD結(jié)合曲線。一百微升HIV-1性能組(PRB601)成員被分別加載至用100nM(a)2G12，(b)RoSBD和(c) AnSBD預(yù)包被的96孔ELISA板。該反應(yīng)用HRP結(jié)合重組的gpl20抗原檢測(cè)。含5% BSA的PBS(PH7.4)被用作NC陰性對(duì)照(NC)。甄別值(COV)被定義為在ELISA分析中來(lái)自正常人血清得到的吸收值加0.1，最大甄別指數(shù)(COI)值通過(guò)OD值除以COV計(jì)算。差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P < 0.0001)。圖8.RoSBD的聚糖結(jié)合活性。(a)聚糖微陣列分析通過(guò)對(duì)功能的Glycomics,核心H設(shè)備的聯(lián)合進(jìn)行。用于分析的第一抗體為抗RoSBD單克隆抗體，且第二抗體為Alexa Fluor488-結(jié)合的山羊抗小鼠 IgG。 (b)六十微升 0.7pM IgGl (2C11)、HIV_lgpl40、Man4_0R 或Manl-Asn/PBS(pH7.4)置于玻璃管中，并將60 μ L磁性試劑加入該玻璃管并在4°C混合15秒然后進(jìn)行磁性減少測(cè)量。該混合物的磁性感受性使用XacPro-SlOl閱讀器在25°C測(cè)量。圖9.合成的Man4的結(jié)構(gòu)(為6_氨基己基糖苷Man4_0R)和M9_Asn (來(lái)自SBA)。圖10.RoSBD上的Man4結(jié)合位點(diǎn)。(a)使用PyMOL計(jì)算和顯示的表面能力，顯示陰性(紅色)和陽(yáng)性(藍(lán)色)能力。左邊組:具有標(biāo)記的殘基Thr33，Tyr56和AsplOO的VH-Man4, Man4以褐色顯示。右邊組:顯示位點(diǎn)I的關(guān)鍵結(jié)合殘基(Trp47，Tyr83和Tyr94)和位點(diǎn)II的關(guān)鍵結(jié)合殘基(Tyr32和Phe58)的標(biāo)記RoSBD_G7復(fù)合物。G7分子以青色(cyan)顯示，(b)預(yù)測(cè)的RoSBD上Man4結(jié)合位點(diǎn)的帶狀圖。Man4分子以褐色顯示。左邊組:顯示Tyr32, Ser33和Lys34殘基。右邊組:顯示Tyr32, Ser33和Lys34殘基，(c)野生型和突變的RoSBD的HIV結(jié)合。將100 μ L HIV-PC溶液加載至用IOOnM野生型RoSBD或突變的 RoSBD Ν29Α, Υ32Α, S33A, Κ34Α, W47A, F58A, Υ83Α, Υ93Α 和 Υ94Α 預(yù)包被的 96 孔 ELISA板中。HRP結(jié)合重組的gpl20抗原用于信號(hào)檢測(cè)。顯示的結(jié)果表示一式三份樣品的土SD?！?, P < 0.05 ；★★, P < 0.01 ;★★★, P < 0.0001。圖11.RoSBD氨基酸對(duì)于HIV-1復(fù)制和細(xì)胞存活力的影響。HIV-1RTMF (AZT-抗性病毒)，用增加濃度的RoSBD處理。8天后通過(guò)使用HIV-lp24抗原ELISA測(cè)量病毒復(fù)制，且根據(jù)劑量響應(yīng)曲線計(jì)算對(duì)于抑制的IC5tl值。不同濃度的RoSBD對(duì)H9細(xì)胞存活力的影響和MTT分析被用于檢測(cè)H9細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性。圖12.對(duì)于抑制HIV-1進(jìn)入的可能策略，(a) HIV-1進(jìn)入靶細(xì)胞需要gpl20與細(xì)胞表面受體⑶4和共受體CCR-5的結(jié)合。(b)中和mAb2G12通過(guò)識(shí)別HIV gpl20的⑶4結(jié)合結(jié)構(gòu)域阻礙HIV-1感染。(c) SBD/CBM可識(shí)別HIV-1并作為2G12mAb的模擬物來(lái)阻礙HIV-1感染。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供預(yù)防性地或治療性地抑制受試者的HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。此處使用的術(shù)語(yǔ)“CBM”指在糖類(lèi)-活性酶中與具有糖類(lèi)結(jié)合活性的謹(jǐn)慎折疊鄰近的(contiguous)氨基酸序列。在糖苷水解酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)分類(lèi)中，按基于氨基酸序列相似性SBM被分類(lèi)至59家族且它們表現(xiàn)出不同的配體特異性，依照糖類(lèi)活性酶(Carbohydrate-Active EnZyme) (CAZy)數(shù)據(jù)庫(kù)(Cantarel, B.L.等.TheCarbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert re source forGlycogenomics.Nucleic Acids Res 37，D233-238 (2009))，其包括幾種特異性例如纖維素、木聚糖和淀粉結(jié)合。本發(fā)明中，SBM特異性地結(jié)合至存在于HIV糖蛋白表位中的聚糖結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HIV糖蛋白為gpl20，且所述聚糖結(jié)構(gòu)為N連接的高甘露糖聚糖 Man9-GlcNAc(M9)。

此處使用的術(shù)語(yǔ)“抗體模擬物”指與抗體在對(duì)抗靶結(jié)構(gòu)結(jié)合方面具有相似功能的物體，但其結(jié)構(gòu)比抗體簡(jiǎn)單。為生產(chǎn)大量抗體需要如下步驟:(a)將單抗體形成細(xì)胞融合至培養(yǎng)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞。所得的細(xì)胞被稱(chēng)為雜交瘤，(b)每種雜交瘤產(chǎn)生相對(duì)大量的相同的抗體分子，和(C)使得該雜交瘤在培養(yǎng)中增加，有可能產(chǎn)生細(xì)胞群，該細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相同的抗體分子。制造真正的抗體是消耗勞動(dòng)和消耗費(fèi)用的；然而，本發(fā)明中，廣泛的包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的宿主可被用于產(chǎn)生CBM的抗體模擬物而不使用動(dòng)物，這更簡(jiǎn)單且更經(jīng)濟(jì)。此處使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，且更優(yōu)選人。本發(fā)明中，優(yōu)選的CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。此處使用的術(shù)語(yǔ)“SBD”指可結(jié)合粒狀或可溶淀粉的功能性結(jié)構(gòu)域，以增加酶的活性位點(diǎn)的底物的局部濃度，且這也可以分裂淀粉表面的結(jié)構(gòu)，由此增強(qiáng)淀粉分解率。目前，有九種淀粉結(jié)合CBM家族:CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM45、CBM48和CBM53。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，SBD為SBM家族20和21的成員，它分別得自黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖淀粉酶(AnSBD)和稻根霉(Rhizopusoryzae)葡萄糖淀粉酶(RoSBD)。使用分子模型的稻根霉(Rhizopus oryzae)葡萄糖淀粉酶(RoSBD)的 SBD 的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系(Chou,ff.1.,Pai,T.ff.,Liu, S.Η., Hsiung, Β.K.&Chang,Μ.D.The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase from Rhizopusoryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding.BiochemJ 396，469-477 (2006))和核磁共振(NMR)光譜已被驗(yàn)證(Liu, Y.N.，Lai, Υ.Τ.，Chou,W.1.，Chang, Μ.D.&Lyu, RC.Solution structure of family 21 carbohydrate-bindingmodule from Rhizopus oryzae glucoamylase.Biochem J 403，21-30 (2007))。此夕卜，RoSBD上的maltoheptaose(G7)和β-環(huán)糊精(β-CD)結(jié)合位點(diǎn)已通過(guò)X-射線結(jié)晶照相法(crystallography)檢測(cè)(Tung，J.Y.等.Crystal structures of the starch-bindingdomain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polys accharide-binding path.Biochem J 416，27-36 (2008)) 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類(lèi)結(jié)合模塊的抗體模擬物和藥學(xué)可接受載體。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受載體”、“藥學(xué)可接受賦形劑”、“生理學(xué)可接受載體”或“生理學(xué)可接受賦形劑”指藥學(xué)可接受材料、組合物或載體，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料。每種組分應(yīng)為在與藥物制劑的其他成分可相容的意義上是“藥學(xué)可接受的”。它還應(yīng)該適合用于與人和動(dòng)物的組織或器官而沒(méi)有過(guò)多的毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)、免疫發(fā)生或其他問(wèn)題或并發(fā)癥，與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)。此處公開(kāi)的藥物組合物可以單位劑型或多劑型公開(kāi)。此處使用的單位劑型指物理學(xué)上離散的適合給予至人和動(dòng)物受試者的單位且被本領(lǐng)域已知的獨(dú)立包裝。每個(gè)單位劑量包含預(yù)測(cè)定量的足以產(chǎn)生所需的治療效果的活性成分，結(jié)合所需的藥物載體或賦形劑。單位劑型的實(shí)例包括注射劑(ampoule)、注射管(syringe)和獨(dú)立包裝的片劑和膠囊。單位劑型可以其部分或其多數(shù)給予。多劑型為包裝在單容器中以被以分開(kāi)的單位劑型給予的復(fù)數(shù)的相同單位劑型。多劑量的實(shí)例包括小瓶的、瓶的片劑或膠囊或瓶的品脫或加侖(Pintsor gallons)。此處公開(kāi)的組合物可被單獨(dú)給予，或與一種或多種其他此處公開(kāi)的化合物、一種或多種其他活性成分組合。包含此處公開(kāi)的化合物的藥物組合物可被配制成多種用于經(jīng)口的、腸胃外的和局部給予的劑型。該藥物組合物還可被配制為改性釋放的劑型，包括延遲_、增強(qiáng)的_、延長(zhǎng)的_、持續(xù)的_、脈動(dòng)的_、控制的_、加速的-和快速的_、靶向的_、程序化的-釋放、和胃的保留劑型。這些劑型可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法和技術(shù)制備。此處公開(kāi)的藥物組合物可一次給予，或者在時(shí)間間隔多次給予。應(yīng)理解治療的精確劑量和持續(xù)時(shí)間可隨著年齡、重量和待治療的患者的狀態(tài)變化，且可被經(jīng)驗(yàn)地使用已知的測(cè)試方案測(cè)定或通過(guò)插補(bǔ)法從體內(nèi)或體外試驗(yàn)或診斷數(shù)據(jù)測(cè)定。還應(yīng)理解對(duì)于任何特定的個(gè)體，特定的劑量方案應(yīng)隨 時(shí)間根據(jù)個(gè)體需要和管理或監(jiān)督該配方的給予的人的職業(yè)判斷來(lái)調(diào)整。此處公開(kāi)的藥物組合物可以用于經(jīng)口給予的固體、半固體或液體劑型公開(kāi)。此處使用的，經(jīng)口給予也包括頰的、舌的和舌下給予。合適的經(jīng)口劑型包括，但不限于，片劑、膠囊、丸、糖錠(troches)、錠劑(lozenges)、軟錠劑(pastilles)、扁囊(cachets)、丸(pellets)、含藥口香糖、整裝粉劑、泡騰的(effervescent)或非冒泡的粉末或顆粒、溶液、乳液、懸液、溶液、薄脆餅(wafes)、噴灑(sprinkles)、酏和糖楽；。除了活性成分,該藥物組合物還包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑，包括但不限于，結(jié)合劑、填充劑、稀釋劑、崩解齊IJ、濕潤(rùn)齊U、潤(rùn)滑劑、助流齊U、著色齊U、染料遷移抑制劑、增舔劑和調(diào)味齊U。本發(fā)明還提供檢測(cè)樣品的HIV的方法，所述方法包括將特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物加入至樣品；和檢測(cè)所述抗體和樣品之間的結(jié)合反應(yīng)。在檢測(cè)HIV的方法中，SBM特異性地結(jié)合至存在于糖蛋白表位中的聚糖結(jié)構(gòu)。如下實(shí)施例為非限制性的且僅代表本發(fā)明的各方面和特征。
實(shí)施例實(shí)施例1SBD和2G12之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系基于結(jié)構(gòu)的多重序列比對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用 Jpred 服務(wù)器(server) (Cuff, J.A., Clamp, M.E., Siddiqui,A.S.，F(xiàn)inlay, M.&Barton，GJ.JPred:a consensus secondary structure predictionserver.Bioinformatics 14,892-893 (1998))和網(wǎng)絡(luò)蛋白序列分析(Network ProteinSequence Analysis) (NPSA)服務(wù)器。Jpred和NPSA服務(wù)器提供一致的結(jié)果,分別來(lái)自六種(NNSSP, DSC, PREDATOR, MULPRED, ZPRED 和 PHD)和十二種(SOPM，SOPMA, HNN, MLRC, DPM,DSC, GORI, GORII, GORIV, PHD, PREDATOR 和 SMPA96)不同的方法。結(jié)果RoSBD或AnSBD和其他蛋白結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系檢測(cè)通過(guò)使用DALI 數(shù)據(jù)庫(kù) in silico 進(jìn)行(Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P.&Schenkel,A.Searching protein structure databases with DaliLite v.3.Bioinformatics 24,2780-2781 (2008))?？傆?jì)對(duì)于RoSBD和AnSBD分別有555和535種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白被檢索到，并按照它們功能分類(lèi)。如預(yù)期的，兩種情況下最相似的蛋白(即，在前200)主要為淀粉處理酶或CBM，然后是抗體家族。特別是，RoSBD和AnSBD分別與158和57種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)。其中，RoSBD類(lèi)似于三種糖結(jié)合mAb:2G12、2H1和F22-4，它們分別識(shí)別致病的微生物 HIV,新型串酵 母(Cryptococcus neoformans)和弗氏志賀菌(Shigella flexneri)。此外，RoSBD ;類(lèi)似于13HIV中和mAb包括2F5和FAB 1583。類(lèi)似地，AnSBD類(lèi)似于兩種糖結(jié)合抗體:2H1和SEl 55-4mAb的單鏈抗體可變結(jié)構(gòu)域(ScFv);和兩種HIV結(jié)合mAb、2F5和G3-519。2G12,RoSBD和AnSBD之間的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)使得容易推導(dǎo)出這些SBD可具有識(shí)別HIV的糖蛋白的能力。圖1顯示對(duì)于RoSBD、AnSBD，和2G12人mAb的VH和VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)比較結(jié)果。雖然RoSBD和AnSBD、VH和VL之間的序列同一性低至分別為8.3%、9.5%和10.9%，但重疊的影響表明在結(jié)構(gòu)配對(duì)之間總體三維結(jié)構(gòu)是非常相似，平均根均值方差(root mean squaredeviation) (RMSD)值分別為 1.4Ao (圖 la)、2.9Αο (圖 lb)和 3.0Ao (圖 lc)。雖然圖1d中RoSBD、AnSBD、VH和VL的多重序列比對(duì)顯示出低的同源性，但兩種SBD和VH中關(guān)鍵的配體結(jié)合位點(diǎn)是很保守的(Tung, J.Y.等.Crystal structures of the starch-bindingdomain from Rhizopus oryzae glucoamylase reveal a polys accharide-binding path.Biochem J 416，27-36 (2008))。RoSBD, AnSBD 和 2G12 的 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)相似性可表明對(duì)于SBD和2G12的相似的結(jié)合特異性。實(shí)施例2SBD和2G12之間的功能關(guān)系微生物和質(zhì)粒大腸桿菌(Escherichiacoli) ToplOF ' (Invitrogen)被用于質(zhì)粒處理，而大腸桿菌(E.coli)BL21-Gold(DE3) (Invitrogen)用于蛋白表達(dá)。載體 pET_23a(+)和pET-15b (Novagen),都包含T7引物(promoter),都分別用于在大腸桿菌細(xì)胞中重組的RoSBD 和 AnSBD 表達(dá)。用于 pET23a(+)-RoSBD 的正向(forward)引物 5'-CATATGGCAAGTATTCCTAGCAGT-3' (SEQ ID 號(hào) I)和反向引物 5' -CTCGAGTCATGTAGATACTTGGT-3/ (SEQ ID 號(hào) 2)分別包含 NdeI 和 XhoI 限制(restriction)位點(diǎn)，以及用于pET15b-AnSBD 的正向引物 5' -CATATGAGCAAGACCAGCACCAGT-3 ' (SEQ ID 號(hào) 3)和反向引物 5' -CTCGAGCTACCGCCAGGTGT-3' (SEQ ID 號(hào) 4)分別包含 NdeI 和 XhoI 限制位點(diǎn)，這些引物用于克隆和序列分析。
SBD的轉(zhuǎn)化和表達(dá)使用熱激方法將pET表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)表達(dá)細(xì)胞(Chou，W.1.，Pai, Tff., Liu, S.H., Hsiung, B.K.&Chang, Μ.D.The family 21 carbohydrate-bindingmodule of glucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playingdistinct roles in ligand binding.Biochem J 396,469-477 (2006))。100 微升感受態(tài)細(xì)胞核IOOng DNA或20 μ L連接混合物被混合，然后冰上孵育30min。將細(xì)胞在42°C水浴中加熱30至60秒,然后置于冰上超過(guò)2min。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪展至含100 μ g/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani (LB)瓊脂板上并在37°C孵育過(guò)夜以測(cè)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量。蛋白表達(dá)通過(guò)將0.5mM異丙基β _D_硫代半乳糖苷(IPTG) (Promega)加入至培養(yǎng)基誘導(dǎo)，并在20°C以250x g震蕩下孵育16h。通過(guò)在4°C以3，700X g離心15min收獲細(xì)胞。SBD的純化包含重組蛋白的大腸桿菌(E.coli)的細(xì)胞沉淀物(pellet)重懸于IOOmL結(jié)合緩沖液(50mM NaOAc,pH 5.5)中，通過(guò)勻衆(zhòng)裂解(EmulsiFlex_C5 homogenizer,AVESTIN)，且細(xì)胞碎片通過(guò)在4°C 16，OOOx g離心30min除去。將所得細(xì)胞裂解液加載至5mL直鏈淀粉樹(shù)脂柱(New England Biolabs)上。然后將該柱用50mL結(jié)合緩沖液(50mMNa0Ac,pH 5.5)洗滌，且所吸附的蛋白用洗脫緩沖液(IOmM甘氨酸-Na0H，pH 11洗脫。純化的SBD通過(guò)在超濾單兀(Centricon-10,Millipore)中離心濃縮并且緩沖液換成50mM NaOAc, pH 5.5 (Lin,S.C.等.CBM21 starch-binding domain:a new purification tag for recombinantprotein engineering.Protein Expr Purif 65，261-266 (2009))。質(zhì)譜分析 重組蛋白的分子量檢測(cè)通過(guò)液相色譜/質(zhì)譜儀(LC/MS) (Waters)進(jìn)行。完整的SBD(IOOpmol)用在50% (v/v)乙腈中的0.1 %甲酸酸化，且數(shù)據(jù)在正常掃描分辨率(scanresolution)下800_1800m/z范圍獲得。對(duì)最初的具有多重的荷電的離子系列的電噴射質(zhì)譜去卷積(deconvoluted)以得到質(zhì)譜。夾心ELISA首先將純化的SBD (100 μ L的IOOnM溶液)稀釋至SBD包被緩沖液(50mM Tris-HCl緩沖液，pH 8)，然后用移液管加入(pipeted)至96孔ELISA板(Greiner-Bio One),然后在 4°C 孵育 16h。相似地，首先將 100μ L 的 IOOnM 2G12 mAb (Polymum Scientific)稀釋至2G12包被緩沖液(50mM甘氨酸-HCl緩沖液，pH 3)，然后用移液管加入至第二 ELISA板，40C 16h。分別將以下四種試劑的每一種(IOOyL)加入至SBD-包被的或2G12-包被的ELISA板，并使其在37°C反應(yīng)Ih:(i)HIV-PC(HIV抗原和抗體陽(yáng)性血清，ID#9144532 ；SeraCareLife Sciences), (ii) 1.0 μ g/mL Ant1-RoSBD mAb (由作者生產(chǎn)，可通過(guò)索取獲得)，(iii)HCV-PC(抗-HCV Mixed Titer Performance Panel ;成員(member) 10, ID#PHV205 ；SeraCareLife Sciences)和(iv)HTLV-PC(Ant1-HTLV I/II Mixed Titer Performance Panel ;成員 10，ID#PRP206 ； SeraCare Life Sciences)。分別使用 HIV p24ELISA 試劑盒(PerkinElmer)和抗HIV抗體1+2ELISA試劑盒(Abbott Diagnostics),根據(jù)說(shuō)明書(shū)，將HIV-PC確認(rèn)為HIV抗原陽(yáng)性和抗-HIV抗體陽(yáng)性。之后，將該板用PBST (0.0lM磷酸鹽緩沖液加0.05%tween-20, pH 7.1)洗滌三次。
以下四種結(jié)合試劑的每一種被分別稀釋成0.05 μ g/mL并以100 μ L/孔加入，37 °C 30min:⑴HRP-結(jié)合重組 gpl20 抗原(General Biologicals), (ii)HRP-結(jié)合的抗小鼠 IgG(Jackson ImmunoResearch)， (iii)HRP-結(jié)合的 HCV 重組抗原(GeneralBiologicals)和(iv) HRP-結(jié)合的 HTLV 重組抗原(General Biologicals),然后用 PBST 洗三次。3,3' ,5,51 -四甲基聯(lián)苯胺(General Biologicals)底物以100 μ L/孔加入,并使其在37°C進(jìn)行30min顏色顯現(xiàn)。通過(guò)加入100 μ L/孔的2Ν硫酸終止顏色反應(yīng)，使用Emax精確微量培養(yǎng)板閱讀器(Molecular Devices)在450nm測(cè)量吸光度。甄別值(COV)被定義為陰性對(duì)照的0D，(正常人血清)+0.1。顯示出甄別指數(shù)(COI)大于I的樣品被認(rèn)為陽(yáng)性，其中COI =(測(cè)試樣品的0D)/C0V。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)雙向(two-way)ANOVA進(jìn)行,然后進(jìn)行不成對(duì)的(unpaired)雙尾 t 檢驗(yàn) GraphPad Prism Version 4 ；GraphPad Software)。P < 0.05 被認(rèn)為顯著的。結(jié)果 直接夾心酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)使用HIV-特異的mAb或SBD-包被的微量滴定板和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)連接的重組gpl20進(jìn)行；顯示甄別指數(shù)(COI) > I的樣品被視為陽(yáng)性。圖1e顯示在HIV抗原和抗體陽(yáng)性對(duì)照(HIV-PC)中存在的HIV抗原通過(guò)抗-p24mAb (N29)，抗-gp41 mAb (AG10H9)，抗-gpl20 mAb (ED8.D4)和 2G12 如預(yù)期的被清楚滴檢測(cè)至IJ。在包被有任一 SBD的板中觀察到信號(hào)，這明顯顯示RoSBD和AnSBD具有相似的HIV檢測(cè)能力。圖2a顯示RoSBD結(jié)合僅在HIV-PC被測(cè)試時(shí)發(fā)生。觀察到與抗-丙型肝炎病毒(HCV)混合的滴定度性能陽(yáng)性對(duì)照(HCV-PC)或抗-人T-淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)混合的滴定度性能陽(yáng)性對(duì)照(HTLV-PC)的可忽略的交叉反應(yīng)。此外，HRP-結(jié)合的HCV重組抗原、HRP-結(jié)合的HTLV重組抗原和HRP-結(jié)合的抗-小鼠IgG沒(méi)有得到明顯的表示RoSBD具有對(duì)HIV-PC特異識(shí)別的信號(hào)(圖2)，這可能由于結(jié)合至HIVgpl20抗原。圖3a顯示AnSBD結(jié)合至HIV-PC的最大COI與RoSBD的那種相似，且對(duì)于AnSBD結(jié)合至HIV-PC或HTLV-PC沒(méi)有觀察到交叉反應(yīng)。圖3b和3c顯示在HRP-結(jié)合的重組gp120存在時(shí)AnSBD表現(xiàn)對(duì)HIV-PC的結(jié)合特異性。此外，在小鼠抗-RoSBD mAb和AnSBD之間沒(méi)有結(jié)合(圖3d)。實(shí)施例3RoSBD和AnSBD和HIV-1糖蛋白之間的特異性HIV mAb和聚糖的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA以下肽和mAb用于競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn):(i)人IgG1第二抗體([2C11];對(duì)于人IgGi的亞類(lèi)特異的且沒(méi)有同型限制；Fe-區(qū)特異的)第二抗體，(ii)HIV-l p24肽([N29]，根據(jù)HIV-1 p24的N-末端殘基1-104的合成肽)，(iii)HIV-1 gpl20肽([ED8.D4];按照人HIV-1 BH8 隔離 gpl60 的殘基 427-448 的合成肽)，(iv)HIV-1 gp41 肽([AG10H9]，按照HIV-1 gpl60 的殘基 721-744 的合成肽)，(v) 2G12 mAb (對(duì)抗 HIV-1 gpl20 的重組人 mAb)，卜1)8 140 011￥分化體4，株92/呢/037)。所有得自Abeam，除了 2G12和gpl40，它們購(gòu)自Polymun Scientific。對(duì)于ELISA實(shí)驗(yàn)，50 μ L HIV-PC與等體積的500ηΜ的以上⑴至(vi)的每種混合。將該混合物轉(zhuǎn)移至RoSBD或AnSBD包被的板并在37°C孵育lh，然后用PBST洗滌三次。通過(guò)加入100 μ L的0.05 μ g/mLHIVl重組gpl20 HRP-結(jié)合抗原檢測(cè)反應(yīng)。對(duì)于檢測(cè)聚糖效果的實(shí)驗(yàn)，50 μ L的500 μ M的四種樣品，大豆凝集素(SBA)、maltoheptaose (G7)、β-環(huán)糊精(PCD)和甘露糖(Sigma-Aldrich)的每一種與等體積的HIV-PC混合。將該混合物轉(zhuǎn)移至RoSBD或AnSBD包被的板并在37°C孵育lh，然后用PBST洗滌三次。該反應(yīng)通過(guò)加入100 μ L的0.05 μ g/mL重組gpl20抗原檢測(cè)。通過(guò)加入100 μ L的0.05 μ g/mL HRP-結(jié)合的HIV I重組gpl20抗原檢測(cè)反應(yīng)。結(jié)果兩種SBD和HIV-1之間的分子相互作用的特異性在包括mAb、糖蛋白和聚糖的競(jìng)爭(zhēng)者存在時(shí)被評(píng)估。圖4a和4b中，人IgG1QCll)第二抗體的存在未顯示出抑制效果，表明沒(méi)有非特異性競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生。然而，對(duì)于HIV-PC結(jié)合至RoSBO和AnSBD的COI值分別顯著減少至72%和60%，在重組HIV-1 gpl40存在時(shí)，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)-表達(dá)的包裝糖蛋白包含與gpl20相同的高甘露糖型聚糖。這表明SBD和HIV糖蛋白之間的分子相互作用。此外，mAb 2G12，抗-gpl20 mAb，抗-gp41 mAb 和抗-p24 mAb 競(jìng)爭(zhēng)劑對(duì)于 RoSBD-HIV PC 結(jié)合的抑制率分別為55%,42%,22%^P 13%，其中AnSBD的該值分別為33%,18%,6%^Ρ 10%。在與mAb (對(duì)于gpl20)的競(jìng)爭(zhēng)時(shí)SBD和HIV-PC結(jié)合的明顯減少導(dǎo)致對(duì)SBD識(shí)別HIV的結(jié)論的進(jìn)一步支持。該數(shù)據(jù)明顯顯示每種SBD和HIV gpl20之間的特異性相互作用，假定在gpl20上包含聚糖部分。此外，發(fā)現(xiàn)500μΜ四 聚糖蛋白大豆凝集素(SBA)具有Μ9部分、maltoheptaose (G7)和β-環(huán)糊精(β⑶)部分，對(duì)于RoSBD-HIV和AnSBD-HIV分別抑制結(jié)合達(dá)38%，20%和23%，以及16%，13%和11%，但甘露糖單糖未顯示出抑制效果(圖5)。這些數(shù)據(jù)暗示SBA和SBD的多糖配體對(duì)HIV結(jié)合弱競(jìng)爭(zhēng)。實(shí)施例4SBD和2G12的競(jìng)爭(zhēng)性HIV-1檢測(cè)為評(píng)估用于HIV ELISA的SBD的實(shí)際應(yīng)用，一組HIV-1發(fā)生率/患病率性能組樣品(PRB601 ;SeraCare Life Sciences),包含7個(gè)一致的發(fā)生和8個(gè)一致的患病樣品,表征為HIV-1陽(yáng)性的，被用于比較抗_p24，抗_gp41，抗-gpl20和2G12 mAb，以及RoSBD和AnSBD之間的HIV檢測(cè)性能。結(jié)果圖6顯示所有包被材料為活性的且此兩種SBD顯示明顯的檢測(cè)信號(hào)。雖然對(duì)于15個(gè)樣品的類(lèi)似的檢測(cè)曲線在SBD或HIV-特異性的mAb包被的分析被觀察到，2G12和RoSBD顯示相對(duì)較高的檢測(cè)靈敏度；顯然，樣品號(hào)5，6，8，10，11和13比其他包含更多的HIV-1抗原。這些數(shù)據(jù)明顯支持我們的SBD的HIV-1抗原識(shí)別能力。此外，不僅信號(hào)的檢測(cè)模式而且信號(hào)的相對(duì)范圍在2G12(圖7a) ,RoSBD (圖7b)和AnSBD (圖7c)之間非常相似。2G12-，RoSBD-和AnSBD-包被的ELISA的檢測(cè)率分別高至93%，93%和87%。應(yīng)注意的是樣品號(hào)I和號(hào)2分別未被RoSBD和2G12檢測(cè)，但據(jù)發(fā)現(xiàn)它們的HIV-1RNA含量分別為3 X IO4和2 X IO3副本/mL。HIV抗原ELISA和HIV-1-RNA試驗(yàn)之間的偏差可來(lái)自于不同的檢測(cè)目標(biāo)或表面糖蛋白的不同表達(dá)水平。實(shí)施例5
的特異甘露聚糖結(jié)合活性RoSBD的聚糖陣列篩選聚糖微陣列分析通過(guò)對(duì)功能的Glycomics的聯(lián)合(CFG),核心H設(shè)備進(jìn)行(Raman,R.等.Advancing glycomics:implementation strategies at the consortium forfunctional glycomics.Glycobiology 16,82R_90R(2006))。哺乳動(dòng)物印刷陣列包含總計(jì)377不同的天然和合成的聚糖。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將七十微升的RoSBD (200 μ g/mL)施用至陣列的印刷的表面，覆有蓋玻片，并在黑暗潮濕的小室中37°C孵育lh。孵育之后，移走蓋玻片并用TSM 緩沖液(50mM Tris-HCl,pH 7.5，10mMMgC12 和 0.5M sucrose)沖洗四次。將七十微升的抗-RoSBD mAb施用至微陣列的印刷表面，并在潮濕的小室中于37°C孵育lh。為檢測(cè)結(jié)合，將該微陣列與5 μ g/mL濃度，在PBS緩沖液中的第二抗體，Alexa Fluor 488-結(jié)合的山羊抗-小鼠IgG(Invitrogen)在37°C在潮濕的小室中孵育Ih,然后進(jìn)行洗漆步驟。結(jié)合程度使用Perkin-Elmer MicroarrayXL4000掃描儀測(cè)定,并使用Imagene (V.6)圖像分析軟件分析。完全的聚糖陣列數(shù)據(jù)組可在依據(jù)cfg_rRequest_l 340的CFG數(shù)據(jù)檔案中發(fā)現(xiàn)。磁性減少結(jié)合分析對(duì)于磁性還原(MR)測(cè)量(MagQu)，含均勻分散的涂有親水表面活性劑(例如葡聚糖)的63.2nm磁性納米顆粒(MagQu)溶液被使用。在外部多重ac磁性領(lǐng)域,該磁性納米顆粒通過(guò)磁性相互作用震蕩并顯示出混合頻率磁性感受性(X ac)，對(duì)存在與顆粒表面相互作用的分子敏感的磁性特性。在測(cè)試樣品中X ac值因此響應(yīng)磁性納米顆粒和結(jié)合分子之間的聯(lián)合而減少以產(chǎn)生MR信號(hào)。

在包含理論空燃比(stoichiometric ratio)為1: 2的七水合硫酸亞鐵(FeS04.7H20)和六水合氯化亞鐵(FeCl3.H2O)的亞鐵鹽溶液與等體積的水性葡聚糖(Sigma-Aldrich)混合并在室溫分散于水中。將該混合物加熱至70-90 °C并用IONNaOH(Showa chemical)滴定以形成Fe3O4顆粒。通過(guò)在25°C以3，700X g離心15min和凝膠過(guò)濾層析(Sigma-Aldrich)去除凝聚物和過(guò)度的非結(jié)合葡聚糖。含F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒的磁性液體被用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)稀釋至
0.3emu/g (或 8.3mg Fe/mL),然后與純化的 RoSBD (200 μ L, 1.0mg/mL)結(jié)合至葡聚糖上氧化的醛基以產(chǎn)生CH = N-連接。六十微升的0.7pM IgGl (2C11), HIV-1-gp 140，Man4 (為 6-氨基己基糖苷(Man4_0R)), M9_Asn(0da, Y.等.Crocus sativus lectinrecognizesMan3GlcNAc in the N-glycan core structure.J Biol Chem 275，26772-26779(2000))，或SBA與PBS(pH 7.4)溶液分離地加入至玻璃管并置于25°C。然后將另一 60 μ L包含RoSBD-包被的納米顆粒的磁性試劑加入至該玻璃管并在25°C混合15秒。最終，在25°C使用XacPro-SlOl閱讀器(MagQu)用于測(cè)量MR信號(hào)，檢測(cè)該混合物。隨著該結(jié)合使得磁性納米顆粒能變得較大或簇生的，試劑的減少的X ac被記錄。結(jié)果圖8a清楚滴證實(shí)兩個(gè)主要信號(hào)通過(guò)RoSBD檢測(cè):聚糖54Fuca (1,2)GalMl,3)GalNAc0 (lj3)Gala 和聚糖 187Mana (1,2)Mana (1,2)Mana (U)Mantl (Man4)。前者與人血型 0 抗原糖基化聯(lián)合(Korchagina, E.Y.等.Design of the blood group AB glycotope.GlycoconjJ 22,127-133(2005))，而后者為HIV gpl20以及SBA中M9的合成的聚糖組分(Wang，J.，Li，H.，Zou, G.&Wang, L.X.Novel template-assembled oligosaccharide clustersas epitope mimics for HIV-neutralizing antibody 2G12.Design, synthesis, andantibody binding study.0rg Biomol Chem 5,1529-1540(2007))。此種數(shù)據(jù)對(duì)于 RoSBD和HIV gpl20之間的相互作用提供了額外的和獨(dú)立的證據(jù)路線，因?yàn)樽R(shí)別宿主上的⑶4受體的Man4作為HIV-1進(jìn)入的關(guān)鍵組分。有趣的是，2G12也已知結(jié)合至HIV-1 gpl20的該Man4結(jié)構(gòu),使用聚糖陣列分析和其他方法(Ji, X., Gewurz, H.&Spear, GT Mannose bindinglectin (MBL) and HIV MoI Tmmunol 42,145-152 (2005)和Liu,WT等.Identification andcharacterization of a novel fibril forming peptide in fungal starch bindingdomain.Biochem Biophys Res Commun 311,966-970(2008))。RoSBD的實(shí)時(shí)聚糖結(jié)合信號(hào)被使用磁性減少(MR)分析檢測(cè)(Hong C.Y，WCC，ChiuY.C, Yang S.Y, Horng H.E 和 Yang H.CMagnetic susceptibility reduction method formagnetically labeled immunoassay.Applied Physics Letters 88,21252(2006))。含RoSBD-包被的磁珠和磷酸鹽緩沖液(PBS)或人IgG1的典型的實(shí)時(shí)磁性響應(yīng)，xac，顯示于圖8b中(實(shí)心點(diǎn)和實(shí)心三角)，表明RoSBD和人IgG1，第二抗體之間的非特異性相互作用不存在，也證實(shí)于圖4。然而，在存在痕量的HIV-gpl40(0.7pM)時(shí)，明顯的減少的MR信號(hào)(開(kāi)口正方形)被檢測(cè)(Λ Xa。為3.5%)。有趣的是，相同摩爾濃度的Man4(為6-氨基己基糖苷，Man4-0R)，M9_Asn (來(lái)自SBA)和SBA (圖9)的存在導(dǎo)致相似的MR信號(hào)(十字和開(kāi)口三角形;A Xac分 別為3.6%，3.6%和4.0)。在MR實(shí)驗(yàn)中對(duì)于HIV-gpl40，Man4-0R，M9-Asn和整個(gè)SBA清楚地觀察到特征信號(hào)減少，對(duì)RoSBD和高甘露糖型聚糖之間的直接分子相互作用提供了強(qiáng)力證據(jù)。如根據(jù)其四價(jià)的特征預(yù)期的，SBA比其他反應(yīng)快得多?？傊@些結(jié)果證明RoSBD和AnSBD通過(guò)新的蛋白-聚糖相互作用結(jié)合至HIV-PC中的天然HIV抗原，特異靶向HIV-1 gpl20上的Man4部分。實(shí)施例6SBD和Man4_結(jié)合蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性和在RoSBD上定位(Mapping)Man4結(jié)合位點(diǎn)推定的Man4結(jié)合位點(diǎn)的分子模型RoSBD的推定的Man4結(jié)合位點(diǎn)的模型建立通過(guò)使用Dali服務(wù)器將RoSBD復(fù)合物(PDB ID:2V8M)和2G12_Man4復(fù)合物(PDB ID:1ZLS)的三維結(jié)構(gòu)疊加進(jìn)行。單糖Man4為
了發(fā)現(xiàn)推定的RoSBD上5A半徑內(nèi)的結(jié)合殘基。此外，使用來(lái)自2G12-Man4復(fù)合物的Man4
相配之物，Man4適合于RoSBD-G7結(jié)構(gòu)的G7結(jié)合位點(diǎn)，以此最保守的己糖環(huán)與結(jié)合位點(diǎn)I和
II相互作用。在預(yù)計(jì)的RoSBD-Man4復(fù)合物中Man4的5 A半徑內(nèi)的殘基被標(biāo)記。RoSBD的定點(diǎn)突變RoSBD及其突變體使用基于PCR的QuikChange 定點(diǎn)突變方法(Stratagene)以pET23a-RoSBD作為模板產(chǎn)生。用于擴(kuò)增SBD衍生物的引物對(duì)被設(shè)計(jì)并列于表I中。PCR混合物包含IOng模板、0.625μ L的每種引物(10 μ Μ)，2.5 μ L反應(yīng)緩沖液(IOx), 3.125 μ LdNTP (2.5mM)，0.25 μ L Pfu Turbo DNA 聚合酶(20U/ μ L) (Stratagene)，用 ddH20 加至終體積為25 μ L。用于本研究的熱循環(huán)條件為I周期的95°C 5min和20周期的:95°C Imin (變性)，45°C至65°C 30秒(退火)和68°C 8min (延伸)，和最終的I周期的68°C IOmin0 PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀(9700, Applied Biosystems)中進(jìn)行。每個(gè)突變質(zhì)粒的序列通過(guò)DNA序列
分析驗(yàn)證。表1.用于定點(diǎn)突變的寡核苷酸引物。產(chǎn)生丙氨酸密碼子的突變被加下劃線。指
示-F'和-R'的引物分別包含正義和反義鏈。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防性地或治療性地抑制受試者HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SBM特異性結(jié)合至存在于HIV糖蛋白表位中的聚糖結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HIV糖蛋白為HIVl-gpl20。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述聚糖結(jié)構(gòu)為N-連接的高甘露糖聚糖Man9GlcNAc2。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述SBD為選自CBM家族20、21、25、26、34、41、45、48和53的成員。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述SBD為CBM家族20。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述SBD為CBM家族21。
9.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者為人。
11.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物(免疫球蛋白類(lèi))和藥學(xué)可接受載體。
12.權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述CBM特異性結(jié)合至存在于HIV糖蛋白表位中的富甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)。
13.權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。
14.權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
15.權(quán)利要求11所述的組合物，所述組合物為片劑、膠囊或懸液的形式。
16.一種檢測(cè)樣品的HIV的方法，所述方法包括將特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物加入至樣品；和檢測(cè)所述抗體和所述樣品之間的結(jié)合反應(yīng)。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述CBM特異性結(jié)合至存在于糖蛋白表位中的富甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)。
18.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述糖蛋白為HIVl-gpl20。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述聚糖結(jié)構(gòu)為N-連接的高甘露糖聚糖Man9GlcNAc2。
20.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述CBM為淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述SBD為選自CBM家族20、21、25、26、34、41、45、48和53的成員。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述SBD為CBM家族20。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述SBD為CBM家族21。
24.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述SBD得自稻根霉葡萄糖淀粉酶(RoSBD)或黑曲霉葡萄糖淀粉酶(AnSBD)。
25.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述樣品分離自人。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抑制受試者HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所屬藥物組合物包含治療或預(yù)防有效量的糖類(lèi)結(jié)合模塊的抗體模擬物和藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明提供預(yù)防性地或治療性地抑制受試者的HIV感染的方法，所述方法包括給予受試者有效量的特異性結(jié)合至HIV糖蛋白表位的糖類(lèi)結(jié)合模塊(CBM)的抗體模擬物。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103097411SQ201080021113
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者張大慈, 李遠(yuǎn)川, 黃榮淵, 林淑娟, 周維宜, 劉錫輝 申請(qǐng)人:張大慈