專利名稱：免疫系統(tǒng)疾病的治療和診斷的制作方法
免疫系統(tǒng)疾病的治療和診斷相關(guān)申請(qǐng)案本申請(qǐng)要求于2009年7月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/225，852的優(yōu)先權(quán)。在先申請(qǐng)作為參考文獻(xiàn)全文引入。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)保護(hù)人體不受病原體感染，細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以及物理/化學(xué)損傷。它的功能異常，無(wú)論是過(guò)度活化還是活化不足，都會(huì)導(dǎo)致不同的疾病。免疫系統(tǒng)功能異?？赡苡赡挲g老化、發(fā)育缺陷，疾病和醫(yī)學(xué)治療(例如化療或免疫抑制)所導(dǎo)致。這需要治療和診斷免疫系統(tǒng)疾病的藥物和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
和方法。
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vsikeaaassnlpapertmaalskepntlraprvrtaftm_eqvrtleavf_qhhaylsple
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lstgprglca mpqtgdaf (下劃線aa.91-151/同源異型域)Hom-I 核酸序列(SEQ ID NO 9)
acctggccgccatgcqcctctcctcctccccacctcgtggcccgcagcagctctccagctttagctccgtggactggctctcccagagcagctgctcagggccgacccacacccccaggcctgccgacttctccctqaqgagcctccctggcccaggccagacatccggcgcccgggagccccctcaaqccgtcagcatcaaggaggccgccgggtcctcaaatctgcctgcgccggagaggaccatggccagattgaqtaaggagccaaataccttgcgggccccccgtgtccgcacagccttcaccatgaaacaqatccgcaccttggagggcgtcttccagcaccaccagtacctgagccctctggagcggaagaggctggccagggagatgcagctctcagaggtccagataaaaacctggtttcagaatcgccgcatgaaacacaaacggcaaatgcaggacccccagctgcacagccccttctcggggtctctccatgcgcccccagctttctactcaacgtcttctggccttgccaatggcctgcagctgctgtgcccttgggcacccctgtccgggccccaggctctgatgctgccccctggctccttctggggtctctgccaagtggcacaagaggccctggcatctgcgggagcttcctgctgcgggcagcctctggcgtcccacccccctaccccaggccggccttcgctgaqaccagccctgtccacgqqqccccqqqgcctgtgtgctatgccacagacgggggatg
本發(fā)明涉及利用Hom-I或其抑制劑或其激活劑治療和診斷免疫系統(tǒng)疾病的材料下面所示的是Hom-I的多肽和核酸序列 Hom-I 多肽(SEQ ID NO 1)cattttgagg tacctggagg caaaqgttct aatacacata tttttttttt aataacacaa tcagcctccc atttttagta gtgatccgcc gaccctaaaa ttaggaagga tagagctttc gttttccagt tacaggtgtq aagcagaaaq taggctgtgc agggaaagca cccaccctcc tgactcaagg agcccctccc catacatgaa cagacaatac aaacccaccc aatttcactt ttttaaacat gacagaagcc cctagacaac
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caaaaaaaaa aaaaaaaa
(下劃線編碼區(qū)(ntl2 to 788，SEQ ID NO: 2)相應(yīng)地，在ー個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于ー種RNAi制劑，所述RNAi制劑含有第一鏈，所述第一鏈具有與編碼Hom-I蛋白的基因ー個(gè)區(qū)域同源的第一核酸序列。RNAi制劑靶向所述基因或其5’ -非翻譯區(qū)轉(zhuǎn)錄得到的mRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一序列包括UUCAG AAUCGCCGCAUGMACACAAACGG (SEQ ID NO :6) ,UCUACUCMC ⑶ CUUCUGGCCUUGCCAAU(SEQ ID NO: 7)，以及相應(yīng)的 DNA 形式TTCAGAATCGCCGCATGAAAC ACAAACGG (SEQ ID NO :4)，TCTACTCAACG TCTTCTGGCCTTGCCAAT (SEQ ID NO :8)，RNAi制劑還可以包括第二鏈，所述第二鏈具有與第一序列互補(bǔ)的第二核酸序列。本發(fā)明的特征還在于ー種藥物組合物，所述組合物包括剛剛提及的RNAi制劑。該組合物可以是ー種鼻腔噴霧劑或吸入組合物。上述制劑和組合物能夠用于治療患有免疫系統(tǒng)疾病或者處于免疫系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)中的患者的用途，例如炎癥疾病，包括由病毒感染或化學(xué)試劑引起的急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)。特別地，可以向所需要的個(gè)體施用有效量的RAM制劑或組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNAi制劑具有SEQ ID NO :6或7的核酸序列。所述個(gè)體可以是患有或疑似患有流行性感冒的個(gè)體，例如，SARS。在第二個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于具有上述SEQ ID N0:4，6，7，或8的分離的核酸序列或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明的特征還在于具有下面列出的分離的核酸序列(SEQ ID NO 3) 或其互補(bǔ)序列。5 ‘ cgaatgcagaggctcctgcgatggccccggagtgagtcccccagaggagccggattagggctgga ggcggccgagtcccccgagaggcccctcccgacattcccgcccccgcgcgccgctccccgggtcctccgcgtctctt tcccgggaaagcctccctcggttcctgcgcggccgcacagcctggacgcagcgcacgcgggcaccggcctgactctc ccaccccgaagcctgctcccaacctaagtccgccctgactctcccagcctgaagcctgctcgccctcgggtgtccgg gctgggcacaggcgccagcgtccccctggagaggagaggtcgcccggcacctcccaggacaggcccaagtgggagtgggaccctccxaccttcctgcagcctcggcccgcggggxggggggxtgggagagatgaaaggaggtgaccgatcccga accatcgcctctccattaaccagggcccgcagccccgcccctcccccagacatcgaggagccggggaggtgtgaacg gcctcctttgtgcctctgaatcgaaggcaattaggcgctgcttatctgggcattagccgtgtatgcaaaccgggctc ccgccccctcctcctgggcttataaacgccgccgcctggcgaggcccgaggtggatcctgcgcctggccagccccgc ctggccttccctccggcccacctggccgccじ‘在第三個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于ー種降低個(gè)體炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)水平或活性的方法。所述方法包括向需要的個(gè)體施用有效量的多肽的抑制劑，所述多肽包含序列 SEQ ID NO :1。在第四個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于ー種通過(guò)向需要的個(gè)體施用有效量的多肽的抑制劑來(lái)降低個(gè)體體內(nèi)前炎性細(xì)胞因子水平的方法，所述多肽包含序列SEQ ID NO :1。細(xì)胞因子的例子包括TNF-α，IL-I β，和IL6。在第五個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于ー種治療患有免疫系統(tǒng)疾病或者處于免疫系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)中的患者的方法。所述方法包括向需要的個(gè)體施用有效量的多肽的抑制劑，所述多肽包含序列SEQ ID NO :1。免疫系統(tǒng)疾病可以是炎癥或自身免疫性疾病，例如ARDS。在一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體患有或者疑似患有流行性感冒。在上述的方法中，抑制劑的例子包括抗體(如導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體，包括 anti-CD3)，反義核酸，RNAi制劑，以及其他的大分子或小分子化合物和自然發(fā)生的化合物， 它們都靶向于Hom-1。RNAi制劑可以具有核酸序列SEQ ID N0:4，6，7，或8。小分子化合物的例子包括潑尼松，依木蘭，甲氨喋呤，驍悉，和離子霉素。大分子的例子包括PHA。在一個(gè)實(shí)施方式中，每種方法進(jìn)ー步包括在施用之前或之后，確定從該個(gè)體獲得的樣品中Hom-I 的表達(dá)水平或活性，以確認(rèn)Hom-I被抑制。在第六個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于ー種提高個(gè)體體內(nèi)炎癥細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞) 水平或活性的方法。該方法包括向需要的個(gè)體施用有效量的包含序列SEQ ID N0:1或5的多肽，或其功能等同物，或編碼多肽的核酸，或Hom-I的激活劑。激活劑的例子包括5-FU， D0X，放射，視黃酸，GM-CSF-IL4，白藜蘆醇，鞣花酸，阿司匹林，水楊酸，大黃素和黃酮類化合物以及能夠誘導(dǎo)Hom-I表達(dá)的這些物質(zhì)的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)ー步包括在施用之前或之后，確定從該個(gè)體獲得的樣品中Hom-I的表達(dá)水平或活性，以確認(rèn)Hom-I被催生。功能等同物是指與ー個(gè)常見多肽相似或者就是常見多肽衍生物的多肽，例如，具有ー個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，插入，缺失，切斷，融合蛋白或其組合的蛋白，大體上保留了常見多肽的能力，例如與LEF1/TCF的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，該多肽缺失ー個(gè)LEF1/TCF反式激活結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞增生癥可以是ー個(gè)以LEF1/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的異常激活為特征的病癥。LEFl/ TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的異常激活是指這樣ー種細(xì)胞狀態(tài)，即以下面的實(shí)施例描述的方法或其它類似的方法檢測(cè)吋，LEF1/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄異常地高。SEQ ID NO :5的功能等同物的例子包括非洲爪蟾(如Xom)、黒猩猩和獼猴的同源異型域。這些同源異型域序列列舉在圖1中。一般地，它們與 SEQ ID NO :5 至少有 30% (例如 40，50，60，65，70，75，80，85，90，or 95% )的同一性。例如，Hom-I的同源異型域與Xom的氨基酸序列有68%的同一性和85%陽(yáng)性(類似)。在第七個(gè)方面，上述的核酸可以用于診斷免疫系統(tǒng)疾病的方法中，包括(1)細(xì)胞増殖性病癥/癌癥和( 炎癥或自身免疫疾病。細(xì)胞増殖性病癥的例子包括急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，和急性粒細(xì)胞白血病(AML)。炎性或自身免疫疾病的例子包括骨髄增生異常綜合征(MDS)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，炎癥性腸病(IBD)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，和移植排斥反應(yīng)。該方法包括從個(gè)體中獲得生物樣本；確定樣本中編碼含有SEQ ID NO :1的多肽的基因表達(dá)水平。如果表達(dá)水平低于第一個(gè)預(yù)定的水平，或沒有表達(dá)，則可確定個(gè)體患有或者易于患上細(xì)胞増殖性病癥/癌癥(ALL，CLL，和AML)。如果表達(dá)水平高于第二個(gè)預(yù)定的水平，則可確定個(gè)體患有或者易于患上炎癥或自身免疫疾病。 這樣的預(yù)定水平能夠從正常對(duì)照個(gè)體中獲得。在第八個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于控制患者治療的方法。該方法包括確認(rèn)患者處于或者需要ー個(gè)病癥治療，從該患者獲取生物樣本，確定樣本中編碼含有SEQ ID N0:1的多肽的基因表達(dá)水平。如果表達(dá)水平達(dá)到或超過(guò)預(yù)定值，則可確定患者適合于治療。相反，如果表達(dá)水平低于預(yù)定值，該患者則不應(yīng)接受治療。該方法可以進(jìn)一歩包括將表達(dá)水平與患者或醫(yī)生或患者的照看者進(jìn)行溝通。在一個(gè)實(shí)施方式中，該病癥是細(xì)胞増殖性病癥，或免疫系統(tǒng)疾病，例如上面提到的ALL，CLL, AML,和MDS。對(duì)于ALL，CLL, AML, MDS,它們中Hom-I的表達(dá)水平是低于預(yù)定值的，Hom-I可以作為指導(dǎo)選擇有效治療策略的標(biāo)志；對(duì)于移植患者，Hom-I可以用于確保免疫抑制劑的足量使用；對(duì)于自身免疫疾病，例如SLE，Hom-I可以用于監(jiān)測(cè)免疫抑制劑的使用。舉個(gè)例子，如果使用免疫抑制劑使Hom-I的表達(dá)水平降低到了所述的值，則表明需要停止使用免疫抑制劑以避免淋巴組織增生性疾病，如淋巴瘤。在第九個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于用于診斷上面所述的病癥或控制患者的治療的試劑盒。該試劑盒包括ー個(gè)或多個(gè)選自于以下組的試劑，所述組包括具有序列SEQ ID NO 1的多肽的特異性抗體，具有序列SEQ ID NO 1的多肽，擴(kuò)增SEQ ID NO :2或3片段的PCR 引物對(duì)，以及在在嚴(yán)格的條件能與參考核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸，所述參考核酸包含SEQ ID NO :2，3，或 5。嚴(yán)格雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡x擇，例如，低嚴(yán)格條件可以被給定。低嚴(yán)格條件是，例如，42°C，2x SSC，和0. SDS，優(yōu)選地，50°C，2x SSC，和0. 1 % SDS。高嚴(yán)格條件更優(yōu)選和包括，例如，65°C，2x SSC，和0. 1% SDS0然而，除了溫度外，其它的多個(gè)因素， 例如鹽濃度也會(huì)影響雜交的嚴(yán)格性，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合適地選擇這些因素來(lái)達(dá)到類似的嚴(yán)格性。本發(fā)明的ー個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方式
的詳情列在附圖和下面的描述中。根據(jù)描述、 圖片和權(quán)利要求，本發(fā)明的其它的特征，目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。


圖IA和圖IB是Xom與Hom-I同源異型區(qū)域的氨基酸序列比對(duì)(圖1A)和Hom-I， 預(yù)測(cè)的黒猩猩和猴的Hom-I的同源物的氨基酸序列比對(duì)，這表明Hom-I序列在靈長(zhǎng)目動(dòng)物中是保守的(圖1B)。圖2A和2B是Hom-I和它的缺失突變以及它們?cè)隗w內(nèi)與TCF4的相互作用的示意圖，該相互作用通過(guò)免疫共沉淀western印記分析(圖2A)利顯示Hom-I與TCF4在HCTl 16 細(xì)胞中共定位的照片(圖2B)確定。
圖3A-3D是顯示下述結(jié)果的示意圖㈧由臺(tái)盼藍(lán)染色(圖3A，左欄)，MTS分析 (圖3A，中間欄)，和3H-胸腺嘧啶摻入法(圖3A，右欄)確定的細(xì)胞活力；(B)用Hom-I shRNA使Hom-I的表達(dá)下調(diào)(圖3B) ； (C) Hom-I的下調(diào)對(duì)于Nalml6增殖的影響，通過(guò)MTT分折(圖3C，上欄)和細(xì)胞活力計(jì)數(shù)(圖3C，下欄)進(jìn)行測(cè)定；(D) Hom-I的下調(diào)導(dǎo)致cyclin Dl表達(dá)的升高，用tubulin的表達(dá)水平作為內(nèi)參(圖3D)。圖4A-4D是照片或圖表(圖4C，右欄)，顯示了下述結(jié)果㈧成體組織中的Hom-I 組織表達(dá)圖譜，使用RT-PCR，GAPDH作為內(nèi)參；(B)線性分析顯示Hom-I主要在骨髄和淋巴系來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá)，包括單核細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；(C)B細(xì)胞發(fā)育中Hom-I 的表達(dá)增高；(D)Hom-I表達(dá)研究顯示，除了 Nalml6，Hom-I在大多數(shù)來(lái)源于B細(xì)胞惡性腫瘤的腫瘤細(xì)胞中并不表達(dá)。圖5A和5B是㈧照片顯示了在新診斷的十個(gè)CLL患者中獲得的外周血樣本中， Hom-I的表達(dá)顯著降低(圖5A)和(B)圖表顯示在淋巴細(xì)胞白血病中，Hom-I的下調(diào)與相應(yīng)的cyclin Dl的表達(dá)上升相關(guān)，使用GAPDH作為內(nèi)參(圖5A)。圖6A-6B的圖表(圖6A和6C)以及照片(圖6B和6D)顯示(A)用編碼GFP或 GFP-Hom-I的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染野生型和p53敲除型HCTl 16細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率(圖6A) ； (B)Hom-I對(duì)于荷瘤裸鼠(圖6B)和腫瘤體積(圖6C)的影響，其中在Hom-I轉(zhuǎn)染的p53野生型和KO型細(xì)胞系中，腫瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制。(數(shù)值是均值士SD，每組中η = 5,*P < 0.01，v. s載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(C)使用TUNEL染色來(lái)測(cè)定異種移植物腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡(圖6D)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基干，至少部分基干，一個(gè)預(yù)料之外的發(fā)現(xiàn)，即Hom-I或它的抑制劑能夠用于治療或診斷各種各樣的免疫系統(tǒng)疾病。如這里所描述的，Hom-I是ー個(gè)LET/TCF相關(guān)的因子，其通過(guò)破壞beta-連環(huán)蛋白 /LEF/TCF復(fù)合物的形成來(lái)抑制典型Wnt/beta-連環(huán)蛋白信號(hào)。功能獲得和功能喪失的方法將Hom-I定義為ー種細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)調(diào)節(jié)因子。Hom-I在正常造血細(xì)胞中是高表達(dá)的(并且在造血細(xì)胞成熟的過(guò)程中Hom-I的表達(dá)是被上調(diào)的)，但是在人類淋巴細(xì)胞白血病和在被 EBV感染的外周B淋巴細(xì)胞的永生化中，它的表達(dá)量顯著降低。Hom-I表達(dá)的改變與相應(yīng)的 Wnt/beta-連環(huán)蛋白/LEF/TCF靶向癌基因的改變有關(guān)，例如cyclin D1，這表明Hom-I在各種免疫疾病和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起作用。相應(yīng)地，本發(fā)明的特征在于治療或診斷這些疾病的材料和方法。舉個(gè)例子，包含編碼Hom-I抑制劑的核酸序列的多聚核酸能夠用于治療炎癥相關(guān)的疾病，例如ARDS。該抑制劑可以用作免疫抑制劑。核酸序列可以編碼一個(gè)靶向Hom-I并抑制其表達(dá)或活性的小干擾RNA (例如RNAi制劑)。核酸是指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)，RNA分子(例如mRNA)，或DNA或 RNA類似物。DNA或RNA類似物可以由核苷酸類似物合成得到。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA?！胺蛛x的核酸”是指結(jié)構(gòu)與天然發(fā)生的核酸或天然發(fā)生的基因組核酸片段不同的這樣ー種核酸。因此，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了，例如，(a)具有天然發(fā)生的基因組DNA分子的部分序列，但是其兩側(cè)并不是編碼序列，而該編碼序列在天然發(fā)生的有機(jī)體的基因組中是位于所述分子部分的兩側(cè)的；(b)整合進(jìn)載體或原核或真核細(xì)胞基因組中的核酸，以至于得到的分子與天然發(fā)生的載體或基因組DNA不同；(c) 一個(gè)單獨(dú)的分子，如cDNA，基因組片段，由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段，或限制性片段；以及(d) —個(gè)重組核苷酸序列，該序列是混合基因的一部分，例如，編碼融合蛋白的基因。術(shù)語(yǔ)“RNAi制劑”是指ー個(gè)具有與靶標(biāo)RNA有足夠互補(bǔ)序列或能夠引導(dǎo)RNA干擾的RNA (或其類似物)。例子包括能夠用于制備RNA的DNA。RNA干擾(RNAi)是指下調(diào)靶標(biāo)分子(例如目的基因，蛋白或RNA)的序列特異性或選擇性過(guò)程。通常，干擾RNA( “iRNA”) 是ー個(gè)雙鏈短干擾RNA(siRNA)，短發(fā)夾RNA(shRNA)，或單鏈小RNA(miRNA)，它們能夠?qū)е绿禺恗RNA催化降解，也能用于降低或抑制基因表達(dá)。因此，使用RNAi降解RNA分子(例如在細(xì)胞內(nèi))同樣也落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 降解過(guò)程由具有酶活的RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)進(jìn)行催化。具有“與靶標(biāo)RNA有足夠互補(bǔ)序列，例如Hom-I，來(lái)誘導(dǎo)RNAi”的RNA制劑的意思是RNA制劑具有能夠足夠誘發(fā)靶 RNA損壞的序列，該破壞是通過(guò)RNAi機(jī)制(例如RISC復(fù)合物)或過(guò)程實(shí)現(xiàn)。具有“與靶標(biāo) RNA有足夠互補(bǔ)序列來(lái)誘導(dǎo)RNAi ”的RNA制劑的意思還有RNA制劑具有能夠足夠誘發(fā)靶RNA 翻譯抑制的序列，該抑制是通過(guò)RNAi機(jī)制或過(guò)程實(shí)現(xiàn)。RNA制劑還具有與靶DNA序列編碼的RNA充分互補(bǔ)的序列，以致靶DNA序列在染色體上被沉默。換言之，RNA制劑具有能夠足夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因沉默的序列，例如，下調(diào)靶DNA序列或其附近的基因表達(dá)，例如，通過(guò)誘導(dǎo)靶DNA序列或其附近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。術(shù)語(yǔ)“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子” 是指核糖核苷酸的聚合物。術(shù)語(yǔ)“DNA”或“DNA分子”或“脫氧核糖核酸分子”是指脫氧核糖核苷酸聚合物。DNA和RNA可以通過(guò)天然合成(例如，分別通過(guò)DNA復(fù)制或DNA轉(zhuǎn)錄)。 RNA可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾。DNA和RNA也可以通過(guò)化學(xué)合成。DNA和RNA可以是單鏈(例如，分別是ssRNA和ssDNA)或多鏈(例如，雙鏈，比如說(shuō)分別是dsRNA和dsDNA)。上面所提及的多聚核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的聚合物，生物可降解的微?；蛭⒛疫f送系統(tǒng)進(jìn)行遞送。另外的可以實(shí)施吸收多聚核苷酸的方法是使用脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體可由常規(guī)方法制備。多聚核苷酸可以單獨(dú)整合進(jìn)這些遞送載體中或者與組織特異性抗體一起整合。此外，可以制備由質(zhì)?；蚱渌d體組成的分子偶聯(lián)物，所述質(zhì)?；蜉d體通過(guò)靜電或共價(jià)カ與多聚L-賴氨酸相連。多聚L-賴氨酸與能夠結(jié)合靶細(xì)胞受體的配體相結(jié)合 (Cristiano，et al.，1995，J. Mol. Med. 73 :479)。另外，組織特異性靶向可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來(lái)實(shí)現(xiàn)。向肌肉，皮內(nèi)，或皮下部位遞送裸DNA(就是，沒有遞送載體)是來(lái)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)表達(dá)所使用的其它方法。在上面所提及的多聚核苷酸中，例如，表達(dá)載體，編碼Hom-I抑制劑的核酸序列可操作地和一個(gè)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子-啟動(dòng)子組合相連接。合適的表達(dá)載體包括質(zhì)粒和病毒載體例如皰疹病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，牛痘病毒，減毒痘苗病毒，金絲雀痘病毒，腺病毒和腺相關(guān)病 SiRNA,miRNA和asRNA(反義RNA)分子可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。具有足夠同源性，以便于為特異性降解任何RNA提供序列特異性的SiRNA，miRNA和asRNA分子可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的程序進(jìn)行設(shè)計(jì)，包括保留在Ambion，Inc.和Dharmacon，Inc網(wǎng)站上的那些程序。為優(yōu)化siRNA，miRNA和asRNA序列的一些設(shè)計(jì)物種的系統(tǒng)測(cè)試可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)手段進(jìn)行。當(dāng)設(shè)計(jì)短干擾核酸分子吋，所需要考慮的因素包括生物物理，熱力學(xué)，和結(jié)構(gòu)因素，正義鏈中特定位置的堿基偏好以及同源性。這些考慮因素是本領(lǐng)域中眾所周知的，能為設(shè)計(jì)本申請(qǐng)所描述的，例如用于鼻腔內(nèi)遞送至肺部的上述RNA分子提供指導(dǎo)。在ー個(gè)方面，上述的制劑或包含該制劑的組合物能夠用于治療個(gè)體的炎癥-相關(guān)的疾病。炎性或炎癥相關(guān)疾病以局部或全身性，急性或慢性炎癥為特征。例子包括炎癥性皮膚病(例如，皮炎，濕疹，過(guò)敏性皮炎，過(guò)敏性接觸性皮炎，蕁麻疹，皮膚壞死性血管炎，血管炎，過(guò)敏性血管炎，嗜酸性肌炎，皮肌炎，多發(fā)性肌炎，和嗜酸性筋膜炎)，炎癥性腸病(例如，克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)，急性呼吸窘迫綜合征，重型肝炎，胰腺炎，過(guò)敏肺疾病(例如，過(guò)敏性肺炎，嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎，遲發(fā)型超敏反應(yīng)，間質(zhì)性肺疾病或ILD，特發(fā)性肺纖維化，和ILD相關(guān)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)，哮喘，過(guò)敏性鼻炎。例子還包括自身免疫性疾病(例如，銀屑病性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，重癥肌無(wú)力，幼年型糖尿病，腎小球腎炎，自身免疫甲狀腺炎，強(qiáng)直性脊柱炎，系統(tǒng)性硬化癥，多發(fā)性硬化癥)，急性和慢性炎癥性疾病(例如，全身過(guò)敏或超敏反應(yīng)，藥物過(guò)敏，昆蟲叮咬過(guò)敏，移植排斥反應(yīng)，移植物抗宿主疾病)，干燥綜合征，人類免疫缺陷和癇毒感染。在另ー個(gè)方面，Hom-I的超表達(dá)和它的激活劑能夠用于增強(qiáng)免疫力，以治療細(xì)胞增殖類疾病，例如癌癥(如腦，乳腺，前列腺，結(jié)腸，腎，卵巣，甲狀腺，肺，和造血細(xì)胞癌癥)，和腫瘤轉(zhuǎn)移?！皞€(gè)體”指的是人類或非人類的動(dòng)物。非人類動(dòng)物的例子包括所有的脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類(特別是高等靈長(zhǎng)類)，狗，老鼠(例如，小鼠或大鼠)，豚鼠， 貓，和非哺乳動(dòng)物，如鳥類，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物等。在一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施例中，個(gè)體是人類。 在另外ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，個(gè)體是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或適合作疾病模型的動(dòng)物。“治療”或“治愈” 是指向一個(gè)患有疾病的個(gè)體(例如ARDS或類似的呼吸道和肺部疾病)施用化合物或制劑， 旨在治愈，緩解，緩和，治療，推遲，或減輕疾病，疾病癥狀，疾病繼發(fā)病癥，或?qū)膊〉囊赘行??！爸委熡行Я俊笔侵改軌蛟谥委煹膫€(gè)體中，例如前面所描述的，可以產(chǎn)生想要的醫(yī)療效果的化合物的量。該治療方法可以在體內(nèi)或體外實(shí)施，単獨(dú)或者與其它的藥物或治療方法聯(lián)合使用。本發(fā)明的組合物可以通過(guò)腸胃外，口腔，鼻腔，直腸給藥，局部，或向頰進(jìn)行施用。 這里所使用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”指的是皮下，皮內(nèi)，靜脈，肌肉，關(guān)節(jié)，動(dòng)脈，滑膜，胸骨內(nèi)，鞘內(nèi)， 損傷區(qū)，或顱內(nèi)注射，以及任何合適的輸液技木。在ー個(gè)具體實(shí)施方式
中，上述的組合物可以用于治療ARDS，以及類似或相關(guān)的呼吸道/肺部疾病。例子包括呼吸道或肺部感染，所述感染指的是任何細(xì)菌，病毒，真菌或寄生蟲感染呼吸系統(tǒng)的任何部位。核酸分子可以以任何的水性載體、顆粒或溶液進(jìn)行制備，以便于提供藥學(xué)上適合于體內(nèi)施用的組合物。制備液體溶液的方法對(duì)于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。優(yōu)選地，液體溶液是水，生理學(xué)可接受液體溶液包含鹽和/或緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)， 或其它任何可接受的施用于動(dòng)物或人類的液體溶液/表面活性剤。此類溶液對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，包括，但不限于蒸餾水，去離子水，純水或超純水，鹽水，PBS,以及包含常用緩沖液的溶液，該緩沖液與核酸是相容的。該組合物還可以包含氯化鈉和葡萄糖或甘露醇，以使溶液等滲化。該組合物可以包含合適的輔助組分例如PH，滲透壓和張カ調(diào)節(jié)劑。
對(duì)于通過(guò)上呼吸道的施用來(lái)說(shuō)，該組合物被制備成ー種溶液，例如，水或等滲鹽水，緩沖或無(wú)緩沖，或作為懸浮液，在鼻腔施用時(shí)以合適的濃度作為滴液或作為噴霧。優(yōu)選地，該溶液或懸浮液相對(duì)于鼻腔分泌物是等滲的，具有差不多相同的PH，其范圍，例如從 pH4. 0至7. 4，或者從pH6. 0至7. 0。緩沖液應(yīng)該是生理學(xué)上相容的，包括，簡(jiǎn)單舉例，磷酸緩沖液。例如，ー個(gè)代表性的鼻解充血?jiǎng)┍幻枋鰹榫彌_到PH值約為6. 2 (Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Ed. Arthur 0sol,page 1445 (1980))。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠很容易為用于鼻腔和/或上呼吸施用的無(wú)害水溶液確定ー個(gè)合適的鹽含量和 PH值。其它的合適的水性載體包括，但不限于Ringer' s溶液和等滲氯化鈉。水性懸浮液可以包括懸浮劑例如纖維素衍生物，海藻酸鈉，聚乙烯吡咯烷酮和黃蓍膠，和潤(rùn)濕劑，如卵磷脂。合適的防腐劑包括乙基和N-羥基苯水懸浮液。該組合物可以包括微量的本領(lǐng)域已知的聚合物，表面活性剤，或其它輔料。在該內(nèi)容中，“微量”指的是沒有可能影響或調(diào)節(jié)肺部細(xì)胞吸收核酸的輔助制劑或物質(zhì)存在?？梢詾椹`個(gè)特定的治療應(yīng)用選擇氣霧劑劑量，配方和運(yùn)載系統(tǒng)，如例如在Gonda， 治療藥物運(yùn)載系統(tǒng)中的關(guān)鍵評(píng)論，6 :273-313,1990中的描述。這里所使用的術(shù)語(yǔ)氣霧劑是指任何ー種細(xì)水霧粒子的制備，可以以溶液或懸浮液形式，無(wú)論它是否使用推進(jìn)劑來(lái)產(chǎn)生。 氣霧劑可以用常規(guī)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，例如超聲或高壓處理。該劑型可以以水性溶液進(jìn)行施用，所述水性溶液用于呼吸系統(tǒng)施用在藥學(xué)上是可接受的。體積大于5μπι的顆粒在鼻腔內(nèi)沉積。2至10 μ m的顆粒保留在肺里面，而小于 1 μ m的顆粒則被呼出。在優(yōu)選實(shí)施方式中，化合物是通過(guò)吸入諸如液體顆粒和/或固體顆粒的形式來(lái)施用。合適的例子包括，但不限于，氣霧劑，噴霧劑，霧，霧化樣本和液滴。能夠用于向人體施用的典型設(shè)備包括計(jì)量劑量吸入器(MDI)，霧化器，和滴注技木。該劑型根據(jù)一個(gè)或多個(gè)肺部疾病的癥狀或表現(xiàn)，以治療，預(yù)防或診斷有效量施用。據(jù)信，核酸分子也可以作為干粉末，通過(guò)使用干粉吸入器進(jìn)行施用，其中顆粒會(huì)溶解在肺的分泌物中。能夠向患者的呼吸道施用顆粒的各種合適的裝置和吸入方法在本領(lǐng)域中是已知的。霧化器能夠從溶液或懸浮液中產(chǎn)生可被病人吸入的細(xì)霧。例如，見美國(guó)專利號(hào)5709202。組合物優(yōu)選以一種能夠遞送有效劑量核酸的藥代動(dòng)力學(xué)類型進(jìn)行遞送。正如常規(guī)使用，本發(fā)明的核酸的“有效量”是這樣的量，與對(duì)應(yīng)的沒有接受化合物或治療制劑的個(gè)體相比，在施用過(guò)化合物或治療劑的個(gè)體中，它能夠治療肺部疾病ー個(gè)或多個(gè)癥狀，扭轉(zhuǎn)肺部疾病ー個(gè)或多個(gè)癥狀的發(fā)展，終止肺部疾病的ー個(gè)或多個(gè)癥狀的發(fā)展，預(yù)防肺部疾病ー個(gè)或多個(gè)癥狀發(fā)生，降低疾病的表現(xiàn)或診斷肺部疾病的ー個(gè)或多個(gè)癥狀。根據(jù)使用的具體藥物或其組合，特定組合物劑型，施用的方式，年齢，體重，患者的情況，以及所治療的癥狀的嚴(yán)重程度，藥物實(shí)際有效量可以不同。ー個(gè)特定患者的劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)方法來(lái)確定，(例如，通過(guò)合適的、常規(guī)的藥理操作指南)。在ー個(gè)具體實(shí)施例中，組合物以每20g體重3至400 μ g的劑量進(jìn)行遞送，上限劑量是每20g體重lg。在ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，組合物以每20g體重50至100 μ g的劑量進(jìn)行遞送。在另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物以每公斤體重150nM的劑量進(jìn)行遞送。上述制劑中的一種或多種可以向動(dòng)物(例如，人類)進(jìn)行施用來(lái)調(diào)節(jié)Hom-I或其同源物的表達(dá)或活性。例如，醫(yī)生可能在剛開始會(huì)規(guī)定ー個(gè)相對(duì)低的劑量，隨后增加劑量直至獲得ー個(gè)合適的響應(yīng)。此外，據(jù)了解，對(duì)于任何ー個(gè)特定個(gè)體，其特別劑量水平取決于許多因素，包括所使用的特定化合物的活性，年齢，體重，總的健康狀況，性別，個(gè)體的飲食，施用的時(shí)間，施用的方式，排泄率，任何藥物的組合，以及將要調(diào)節(jié)的表達(dá)或活性的程度。治療的效果可以通過(guò)測(cè)量靶基因mRNA的量(例如，用實(shí)時(shí)PCR)或由靶基因mRNA 編碼的多肽的量(Western印記分析)來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。正如本領(lǐng)域所公知的，患者的劑量取決于如上所述的許多因素。雖然劑量是不同的，但施用多聚核苷酸的優(yōu)選劑量是約IO6至IO12 個(gè)拷貝屬的多聚核苷酸分子。如果需要，該劑量可被重復(fù)施用。施用的方式可以是上面所列舉的任何ー種。本發(fā)明的特征還是ー種診斷方法。基于來(lái)自于個(gè)體的檢測(cè)樣本中的Hom多肽(例如，抗體)或編碼該多肽的核酸(例如，基因組DNA或mRNA)的缺失，可以檢測(cè)該個(gè)體中的腫瘤細(xì)胞或傾向于腫瘤化的細(xì)胞。換言之，該多肽和核酸可以作為指示腫瘤細(xì)胞存在與否的標(biāo)記。本發(fā)明的診斷和預(yù)后分析包括評(píng)估Hom多肽或核酸的表達(dá)水平的方法，以及確定 Hom多肽或核酸序列中的變異和突變的方法。Hom多肽或核酸在檢測(cè)樣本中的存在與否，其水平，可以通過(guò)從待測(cè)個(gè)體中獲得檢測(cè)樣本，并將該檢測(cè)樣本與能夠檢測(cè)Hon多肽或核酸(例如mRNA或基因組DNA探針)的化合物或制劑相接觸來(lái)進(jìn)行評(píng)估?！皺z測(cè)樣本”包括從個(gè)體中分離出來(lái)的組織，細(xì)胞和生物學(xué)液體，以及存在于個(gè)體體內(nèi)的組織，細(xì)胞和液體。Hom基因的表達(dá)水平可以通過(guò)許多方法進(jìn)行測(cè)定，包括測(cè)量由Hom基因編碼的mRNA ；測(cè)量由Hom基因編碼的多肽的量；或者測(cè)量由 Hom基因編碼的多肽的活性。細(xì)胞中相對(duì)于Hom基因的mRNA的水平可以通過(guò)原位或體外形式進(jìn)行確定。從檢測(cè)樣本中分離的信使RNA能夠用于雜交或擴(kuò)增分析，包括Southern或Northern分析，PCR 分析和探針陣列。一個(gè)優(yōu)選的檢測(cè)mRNA水平的診斷方法涉及將分離的mRNA與核酸探針接觸，該探針能夠與Hom基因編碼的mRNA雜交。探針可以是全長(zhǎng)的Hom核酸，例如SEQ ID NO :2或3或部分的核酸，例如至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并且足夠在嚴(yán)格條件下與Hom mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡聚核苷酸。在ー個(gè)形式中，mRNA(或由其制備的cDNA)被固定在ー個(gè)表面上，與探針進(jìn)行接觸，例如，通過(guò)使分離的mRNA在瓊脂糖凝膠上跑膠，并將mRNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上，例如硝化纖維膜。在另外ー個(gè)形式中，探針被固定在表面上，mRNA(或cDNA)與探針進(jìn)行接觸，例如，在基因芯片陣列中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適用已知的mRNA檢測(cè)方法去檢測(cè)Hom mRNA 的水平。由Hom基因編碼的mRNA(或由其制備的cDNA)在樣本中的水平可以利用核酸擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行評(píng)估，例如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR(美國(guó)專利號(hào)4，683，202)，RT-PCR (Bustin S. J Mol Endocrinol. 25 169-93，2000)，定量PCR(Ong Y. et al. ,Hematology. 7 :59_67，2002)，實(shí)時(shí) PCR (Ginzinger D.Exp Hematol. 30 :503_12，2002)，以及原位 PCR(Thaker V. Methods Mol Biol. 115 :379-402,1999)，或其它任何的核酸擴(kuò)增方法，之后利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增后的分子。正如在這里使用的，擴(kuò)增引物被定義為能夠與基因的5’或3’區(qū)域(分別是正鏈和負(fù)鏈，或反過(guò)來(lái))退火，并且它們之間包含一小段區(qū)域的核酸分子對(duì)。在合適的條件下，和合適的制劑一起，該引物允許擴(kuò)增具有核酸序列的核酸分子，該核酸序列的兩端是引物序列。對(duì)于原位技木，細(xì)胞或組織樣本將被制備和固定在ー個(gè)支持物上，例如玻璃片，然后與能夠與染色體上的基因組DNA或編碼Hom多肽的mRNA雜交的探針進(jìn)行接觸。在另ー個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法進(jìn)ー步包括將ー個(gè)對(duì)照樣本與能夠檢測(cè) HommRNA,或基因組DNA的化合物或制劑進(jìn)行接觸，然后將檢測(cè)樣本中的HommRNA或基因組 DNA的存在與對(duì)照樣本中的進(jìn)行對(duì)比。上述的基于核酸的診斷方法可以提供定性和定量的信息來(lái)確定ー個(gè)個(gè)體患有或傾向患有與Hom基因異常表達(dá)相關(guān)的疾病，例如，癌癥。有許多方法可以用于確定Hom多肽的水平。一般說(shuō)來(lái)，這些方法包括接觸ー種選擇性結(jié)合該多肽的制劑，例如抗體，來(lái)評(píng)估樣本中的多肽的水平?？贵w可以是多克隆抗體， 或者更優(yōu)選的，單克隆抗體。一個(gè)完整的抗體，或者其片段(例如，F(xiàn)ab or F(ab' )2)也可以使用。在ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該抗體具有ー個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”，對(duì)于探針或抗體來(lái)說(shuō)，是希望包括通過(guò)將可檢測(cè)的物質(zhì)與探針或抗體物理連接來(lái)完成的探針或抗體的直接標(biāo)記，以及通過(guò)與可檢測(cè)物質(zhì)反應(yīng)的探針或抗體的間接標(biāo)記。例如，具有兔Fc區(qū)域的抗體可以使用針對(duì)兔Fc區(qū)域結(jié)合的ニ抗來(lái)進(jìn)行間接標(biāo)記，其中的ニ抗與可檢測(cè)物質(zhì)相偶聯(lián)。這里提供一些可檢測(cè)物質(zhì)的例子。合適的可檢測(cè)物質(zhì)或標(biāo)記包括放射性同位素(例如，125I，131I，35S，3H，or 32P)，酶(例如，堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，熒光素酶，或β-半乳糖苷酶)，熒光基團(tuán)或蛋白質(zhì)(例如，熒光素，羅丹明，藻紅蛋白，GFP或BFP)，或發(fā)光基團(tuán) (例如，Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA 提供的 Qdot 納米粒子)。檢測(cè)方法可以用來(lái)檢測(cè)體外和體內(nèi)生物樣本中的Hom多肽。體外檢測(cè)Hom多肽的技術(shù)包括ELISAs，免疫沉淀，免疫熒光，EIA，RIA，以及Wfestern印記分析。體內(nèi)檢測(cè)Hom多肽的技術(shù)包括向個(gè)體引入ー個(gè)標(biāo)記的抗-Hom抗體。例如，抗體能夠用如上所述的可檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。個(gè)體中可檢測(cè)物質(zhì)的存在和位置可使用標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。這里描述的診斷方法能夠鑒定患有或者有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生與異常Hom表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥的個(gè)體。正如這里所描述的，此類疾病或病癥的例子包括ALL，CLL，AML，和 MDS。這里描述的預(yù)后方法可以用于確定某個(gè)個(gè)體是否適合于施用某個(gè)制劑(例如激動(dòng)劑，拮抗劑，多肽模擬物，蛋白質(zhì)，肽，核酸，小分子，或其它候選藥物)來(lái)治療疾病，例如癌癥(如ALL，CLL，_AML)。舉個(gè)例子，該分析可以用于確定某個(gè)個(gè)體能否施用細(xì)胞毒性藥物來(lái)治療細(xì)胞増殖性病癥，或能否施用免疫抑制劑來(lái)治療免疫系統(tǒng)病癥，包括那些涉及器官/組織移植的病癥。因此，本發(fā)明的特征還在于ー種控制個(gè)體癌癥或免疫系統(tǒng)疾病治療的方法。為了這個(gè)目的，在治療之前，治療中和治療后，可以確定一個(gè)個(gè)體的檢測(cè)樣本中的Hom基因表達(dá)水平。治療后Hom表達(dá)水平的升高指示該個(gè)體可以用同樣的方法進(jìn)行進(jìn)一歩治療。舉個(gè)例子，接受了器官或組織移植的患者通常要面對(duì)器官或組織排斥的問(wèn)題。也就是說(shuō)，身體對(duì)于器官或組織的免疫響應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致移植的失敗。為了解決這個(gè)問(wèn)題，器官或組織移植通常伴隨著非特異性免疫抑制治療以防止T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。盡管如此，這些免疫抑制劑會(huì)導(dǎo)致感染，高血壓，癌癥，和其他不良副作用。因此，需要對(duì)抑制進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在這方面，Hom-I的表達(dá)水平可以作為合適的免疫抑制水平或程度的標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于治療過(guò)程中Hom-I表達(dá)的水平來(lái)調(diào)整免疫抑制劑的量和治療的長(zhǎng)短。從上述分析的實(shí)踐中獲得的信息對(duì)于預(yù)測(cè)，確定疾病和其它影響個(gè)人健康狀況有害條件的進(jìn)展和臨床管理是有用的。在優(yōu)選實(shí)施方式中，上述診斷分析為預(yù)測(cè)，確定惡性腫瘤(癌癥)的進(jìn)展和管理提供了有用的信息，所述惡性腫瘤以的缺失或異常低水平的Hom 表達(dá)為特征。該信息可以更具體地協(xié)助臨床醫(yī)生設(shè)計(jì)化療或其它治療方案來(lái)從受折磨的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，例如人類，根除惡性腫瘤。下面的具體例子只是被視作說(shuō)明，而不以任何方式作為其余的披露的限制。盡管沒有進(jìn)ー步闡述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這里的描述可以將本發(fā)明最大限度地利用。這里所引用的所有公開物的全部?jī)?nèi)容被作為參考文獻(xiàn)引入。此外，以下提出的任何機(jī)制不以任何方式限制發(fā)明的范圍。^MM 1 Hom-I,—種LET/TCF相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制子，是ー種腫瘤抑制物L(fēng)EF/TCFs轉(zhuǎn)錄因子是經(jīng)典Wnt/beta-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，該信號(hào)通路對(duì)于早期胚胎發(fā)育中的細(xì)胞命運(yùn)決定是很關(guān)鍵的，并且其被暗示在各種癌癥中是ー個(gè)主要的致癌途徑。LEF/TCFs不具備內(nèi)源轉(zhuǎn)錄活性，但是卻被相關(guān)因子密切控制。在Wnt信號(hào)的存在下，LEF/TCFs與beta-連環(huán)蛋白組成復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)LEF/TCF下游的基因表達(dá)，包括得到確認(rèn)的癌基因，如cyclin Dl和C_myc。Xom(同樣被稱為Vent-2,Xbr-1,^P Vox)是果蠅homeobox基因OmlD的脊椎動(dòng)物同源基因。Xom被確認(rèn)為是BMP4的主要下游調(diào)節(jié)子，也是腹信號(hào)中心的必要組分。與beta-連環(huán)蛋白相似，Xom也是ー個(gè)不穩(wěn)定蛋白。我們檢測(cè)了 Xom對(duì)LEF/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的影響，確定Xom是ー個(gè)新的LEF/TCF相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。在此實(shí)施例中，通過(guò)序列同源捜索，分布數(shù)據(jù)和功能分析，我們確定了ー個(gè)新的轉(zhuǎn)錄子Hom-I作為人類Xom同源物的候選者。據(jù)發(fā)現(xiàn)，Hom-I與之前已知的VentX2共享ー個(gè)相同的0RF，但是在VentX2的已知序列之外它還包含ー個(gè)71 Ibp的5，UTR0下面描述了對(duì) Hom-I實(shí)施進(jìn)一歩的分析。材料和方法啟動(dòng)子-熒光素酶分析為進(jìn)行ー個(gè)典型的啟動(dòng)子-熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)染前M小時(shí)，將れ10セ93丁細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中。將1微克編碼目的基因的質(zhì)粒與0. 3 μ g熒光素酶-報(bào)告構(gòu)建體用3μ 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(TRANSIT，Mirus)進(jìn)行混合，根據(jù)產(chǎn)商操作指示轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用PBS洗滌細(xì)胞，用IX細(xì)胞裂解緩沖液(PR0MEGA)裂解細(xì)胞，刮下細(xì)胞，冰上收集。在桌上離心機(jī)上進(jìn)行簡(jiǎn)短的旋轉(zhuǎn)，將20 μ 1上清液與100 μ 1熒光素酶分析試劑(PR0MEGA)進(jìn)行混合，用TR717微板光度計(jì)(APPLIED BI0SYSTEM)測(cè)量熒光素酶的活性。RNA 分離，RT-PCR 和實(shí)時(shí) PCR用TRIzol方法提取總RNA0在Iml Trizol中勻漿細(xì)胞(IxlO6)，然后加入200ml 氯仿。漩渦混勻之后，12000rpm下離心樣本，將上清液收集到新的管子中。向每個(gè)樣本中加入異丙醇(500ml)，混勻，室溫放置30分鐘。在4°C下，12000rpm離心樣本30分鐘。收集沉淀，用70% ETOH洗滌，風(fēng)干，重懸于20 μ IDEPC-處理的H2O中。通過(guò)測(cè)量OD26tl來(lái)確定 RNA的終濃度。根據(jù)產(chǎn)商操作指南，用SuperSript第一鏈合成系統(tǒng)(INVITR0GEN)來(lái)合成第一鏈cDNA。簡(jiǎn)言之，每個(gè)樣本中的3 μ g總RNA被用于RT反應(yīng)，1 μ g RT產(chǎn)物用于PCR反應(yīng)。GAPDH用作內(nèi)參。通過(guò)測(cè)序確定PCR產(chǎn)物的身份。使用LightCycler系統(tǒng)(ROCHE)和 LightCycler快速啟動(dòng)DNA Master SYBR Green I，根據(jù)產(chǎn)商操作指南的指示來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR0基因表達(dá)的相對(duì)水平用該公式進(jìn)行計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)=2_ACd(ACd=特異基因的循環(huán)數(shù)-參考GAPDH基因的循環(huán)數(shù))。Hom-I的剪接克隆和5，cDNA步行從包含Hom-I基因組序列的BAC RP13克隆中，用引物Fl 5， AATTGAATTCAATGCGCCTCTCCTCCTCC 3，，Rl :5，TTAATCTAGATCATCAAAATGCATCCCCCGTCTG 3，通過(guò) PCR 反應(yīng)擴(kuò)增 2. 4kb 的 Hom-I基因組DNA。 用EcoRI和^CbaI消化PCR產(chǎn)物，并克隆進(jìn)CS2載體中。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用 TriZol方法提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的總RNA，使用Superscript第一鏈合成系統(tǒng)(INVITR0GEN) 進(jìn)行RT反應(yīng)。使用引物Fl和Rl擴(kuò)增RT產(chǎn)物，用EcoRI和)(baI進(jìn)行消化，然后克隆進(jìn)CS2 載體中。為進(jìn)行5’cDNA歩行，使用從健康志愿者的外周白細(xì)胞中提取出來(lái)的總RNA來(lái)擴(kuò)增第一鏈cDNA。用正向引物擴(kuò)增5，非翻譯區(qū)，這些引物的起始位點(diǎn)位于-100，-161，-四1，-3 57，-471，-711，-843(起始密碼子ATG中的核苷酸“A”被定義為位點(diǎn)0)。免疫熒光和免疫共沉淀為進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，用TransIT(MIRUS)將GFP-Hom-I和Myc_TCF4共轉(zhuǎn)染進(jìn) HCT116細(xì)胞。用抗myc抗體對(duì)TCF4進(jìn)行染色，之后加入Alexa 568標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗 (INVITR0GEN)。通過(guò)DAPI看見細(xì)胞核，影像用波士頓兒童醫(yī)院的核心設(shè)施的共聚焦顯微鏡拍照。為進(jìn)行免疫共沉淀，將20 μ 1蛋白A/G瓊脂糖珠子(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)與 lug目的抗體混合以制備親和蛋白A/G珠子。為了制備細(xì)胞裂解液，用包含IX蛋白酶抑制劑(ROCHE)的IX細(xì)胞裂解緩沖液(PR0MEGA)裂解2xl06細(xì)胞。細(xì)胞裂解液在冰上孵育 30分鐘，簡(jiǎn)短超聲波沖擊后，在4°C下12000xg離心5分鐘。加入20 μ 1蛋白A/G珠子和 1 μ g免疫前血清，4°C下2小時(shí)，對(duì)上清液進(jìn)行進(jìn)一歩清理。簡(jiǎn)短的旋轉(zhuǎn)之后，將上清液與 20 μ 1抗體標(biāo)記的蛋白A/G珠子混合，4°C下過(guò)夜。用PBS 0. 2% NP40洗滌珠子4次。加入 2x樣本緩沖液，95°C煮沸5分鐘以釋放結(jié)合蛋白，簡(jiǎn)短離心，使用如文中的特異性抗體進(jìn)行 western印記分析。小鼠抗myc抗體和羊抗TCF4抗體購(gòu)自Santa Cruz。細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞分離和cDNA陣列本實(shí)施例中使用的細(xì)胞包括Nalm6細(xì)胞，Nalml6細(xì)胞，Reh細(xì)胞，RSll細(xì)胞，H蘇丹細(xì)胞，ALL樣本細(xì)胞，CLL樣本細(xì)胞，293T細(xì)胞，Jurkat細(xì)胞，Tail細(xì)胞，EBV轉(zhuǎn)換B細(xì)胞和來(lái)自于健康個(gè)體的配對(duì)B細(xì)胞，PC3細(xì)胞，LnCap細(xì)胞，MCF7細(xì)胞，MDA細(xì)胞，SK-N-AS細(xì)胞，H1299細(xì)胞，H460細(xì)胞和116細(xì)胞。所有這些細(xì)胞系被保存在額外加有10% FBS和
青霉素和鏈霉素的RPMI1640或DMEM中。健康個(gè)體來(lái)源的白細(xì)胞是從波士頓兒童醫(yī)院的健康的匿名捐血者所丟棄的白細(xì)胞中分離得到的。人體材料的實(shí)驗(yàn)是根據(jù)布里格姆婦女醫(yī)院的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)所批準(zhǔn)的準(zhǔn)則進(jìn)行實(shí)施的。T細(xì)胞，B細(xì)胞，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞都利用⑶3，⑶19，⑶15和⑶14抗體特異性標(biāo)記(MILTENYI BI0TEC)的MCAS微珠，根據(jù)產(chǎn)商操作指南來(lái)進(jìn)行分離。I^rimeExpress II人類正常組織cDNA板(#10020)購(gòu)自PRIMGEN。暫時(shí)轉(zhuǎn)染和Hom-I shRNA穩(wěn)定細(xì)胞系的建立對(duì)于HCTl 16和細(xì)胞，所有的暫時(shí)轉(zhuǎn)染都用脂質(zhì)體TransIT試劑(Mirus)根據(jù)產(chǎn)商操作指南來(lái)實(shí)施。對(duì)于Reh和Nalml6細(xì)胞，使用細(xì)胞系Nucleofector試劑盒V (細(xì)胞)， 根據(jù)產(chǎn)商操作指南，用電穿孔實(shí)施暫時(shí)轉(zhuǎn)染。Hom-IshRNA質(zhì)粒獲自O(shè)rigene Technologies ； 構(gòu)建體 1 :5’ CAAATCTGCCT GCGCCG GAGAGGACCATG 3’ ；構(gòu)建體 3 :5’ TTCAGAATCGCCGCATGAA ACACAAACGG 3，(SEQ ID NO :4)。為了建立Hom-I降低表達(dá)的細(xì)胞系，用Hom-IshRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小吋，利用500ng/ml嘌呤霉素處理4周以選擇Hom-I降低表達(dá)的細(xì)胞系。細(xì)胞活力分析，MTS増殖分析，以及咕胸腺嘧啶脫氧核苷摻入分析為進(jìn)行Hom-I超表達(dá)實(shí)驗(yàn)，用編碼GFP-Homl或GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后M 小吋，利用FAC G4分選細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BD BIOSCIENCE)將GFP陽(yáng)性細(xì)胞分選出來(lái)，接種于培養(yǎng)板中。為進(jìn)行細(xì)胞活力分析實(shí)驗(yàn)，將切105細(xì)胞以三個(gè)重復(fù)接種于12孔板中。在每個(gè)指示的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)錐蟲藍(lán)染色來(lái)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)4次。細(xì)胞活力用百分比來(lái)表示。為進(jìn)行 MTS増殖分析，將IxlO5細(xì)胞以三個(gè)重復(fù)接種于96孔板中。接種后48小吋，使用細(xì)胞滴度96 水性非放射性細(xì)胞増殖分析試劑盒(PR0MEGA)，根據(jù)廠商操作指南來(lái)測(cè)量細(xì)胞增殖速度。為進(jìn)行3H胸腺嘧啶脫氧核苷摻入分析，IxlO5分選的細(xì)胞以三個(gè)重復(fù)接種于96孔板中。接種后 48小吋，每個(gè)孔中加入咕胸腺嘧啶脫氧核苷(1. OUei/孔)，再培養(yǎng)18小吋。在-70°C冷凍過(guò)夜以裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到膜上，用PBS洗滌三次，使用TopCoimt NXT進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)(PACKARD BIOSCIENCE)。CHIP 分析Hela細(xì)胞于6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)M小時(shí)，然后用編碼myc-Hom-l或myc-tag的構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后M小吋，使用分析試劑盒(Upstate Cell Signaling)，按照廠商操作指南實(shí)施染色質(zhì)免疫沉淀(Chip)。Cyclin Dl啟動(dòng)子序列用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增F5' -CGGACTACAGGGGAGTTTTGTTG-3 ‘和 R5 ‘ -TCCAGCATCCAGGTGGCGACGAT-3 ‘，免疫球蛋白重鏈啟動(dòng)子啟動(dòng)子用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增F5 ‘ -AACCCTTTTCCCCCTCGTCT-3 ‘和 R5 ‘ -AGCACTGTGAGGTGGCTGC-3 ‘。使用1 %瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析PCR產(chǎn)物。統(tǒng)計(jì)分析用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。ρ值< 0. 05的差異被認(rèn)為是從統(tǒng)計(jì)意義上顯著的。結(jié)果Hom-I是Xom的同源物為了確定Xom的人類同源物，我們利用Xom同源結(jié)構(gòu)域(HD)的序列作為模板在 NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行捜索。捜索所掲示的候選基因被認(rèn)定為是Hom-l(之前被稱為 Ventx2)。Hom-I的開放閱讀框編碼258個(gè)氨基酸，而Xom則有327個(gè)氨基酸。如圖IA中所示，Hom-I的同源結(jié)構(gòu)域與Xom具有68 %的氨基酸序列同一性和85%陽(yáng)性(相似性)。 Hom-I包含ー個(gè)N端絲氨酸/蘇氨酸豐富區(qū)域(aa 4_89)，ー個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(aa 91-151)，以及ー個(gè)C端富含脯氨酸區(qū)域(aa 151-258)。這與Xom類似，其也包括ー個(gè)N端絲氨酸/蘇氨酸豐富區(qū)域(aa 31-1M)，ー個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(aa 172-233)，以及ー個(gè)C端富含脯氨酸區(qū)域 (aa 233-326) 利用Vector NTI蛋白質(zhì)對(duì)比程序，我們發(fā)現(xiàn)，除了同源結(jié)構(gòu)域，Hom-I與Xom在碳末端區(qū)域和在氨基末端的起始部位約10個(gè)氨基酸區(qū)域具有很高的相似性。兩個(gè)分子也具有一個(gè)與功能相關(guān)的不相対的N末端區(qū)域。比較基因組分析表明，Hom-I在靈長(zhǎng)類中是保守的(圖1B)，但是在其他物種中序列同源性已丟失。除了結(jié)構(gòu)的相似性，CGAP(癌癥基因組解析計(jì)劃)的EST數(shù)據(jù)顯示，Hom-I的表達(dá)譜與Xom的分布類似，它們?cè)诔审w組織中都表現(xiàn)非常有限的表達(dá)但卻在胚胎組織中表達(dá)。為了進(jìn)一步評(píng)估Hom-I的功能，使用BAC RP13作為模板，通過(guò)剪切克降獲得它的cDNA。除了已知的序列，位于Hom-I第一個(gè)外顯子上711bp的一個(gè)新的5，非翻譯區(qū)通過(guò)5，-cDNA步行被確定出來(lái)。Xom是背部特異性基因Goosecoid的轉(zhuǎn)錄抑制子。為了確定Hom-1與Xom之間任何潛在的功能類似性，將編碼Hom-I或Xom的mRNA與編碼激活素和(isc-熒光素酶報(bào)告構(gòu)建體的mRNA —起，注射進(jìn)兩細(xì)胞階段的非洲爪蟾的兩個(gè)分裂球的一個(gè)之中。在階段10的時(shí)候收集5個(gè)胚胎，用PR0MEGA熒光素酶分析系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶活性。發(fā)現(xiàn)Hom-I的表達(dá)抑制了激活素誘導(dǎo)的(isc-啟動(dòng)子的表達(dá)，這與Xom對(duì)(isc-啟動(dòng)子的抑制類似。這些結(jié)果與之前的發(fā)現(xiàn)是一致的，即Hom-l/Ventx2的表達(dá)抑制斑馬魚中的背部化。然而，如下圖所示，Xom通過(guò)其N末端區(qū)域使LEF/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)活，這是Xom不同于Hom-I的地方。因此，可以下結(jié)論Hom-I是Xom的同源物但不是Xom的直系同源物。Hom-I與Lef/Tcf轉(zhuǎn)錄因子組或復(fù)合物檢測(cè)了 Hom-I與LEFl/TCFs是否有相互作用。Myc-標(biāo)記的Hom-I在HCT116細(xì)胞中短期表達(dá)，Hom-I和TCF4之間潛在的相互作用通過(guò)免疫共沉淀而被確定。當(dāng)抗TCF4-包裹的珠子應(yīng)用于HCT116細(xì)胞提取物時(shí)，myc-Hom-1很容易地與TCF4免疫共沉淀。還發(fā)現(xiàn)Hom-I與TCF-4以一種點(diǎn)狀的方式共定位于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖2B)。為了確定Hom-I中的參與與Lef/Tcf因子相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，制備了 Hom-I的一系列缺失突變體，檢測(cè)它們與TCF4的親和性(圖2A)。發(fā)現(xiàn)如果同源結(jié)構(gòu)域和它周圍的50個(gè)氨基酸區(qū)域從Hom-I中缺失，由此產(chǎn)生的突變體并不能與抗-TCF4-包裹珠子免疫共沉淀，這表明Hom-I的同源結(jié)構(gòu)域和它周圍的區(qū)域在Hom-I與LEF1/TCF因子的相互作用中起著關(guān)鍵的作用。考慮到homeobox區(qū)域是Hom-I的DNA結(jié)合域，用20 μ g/ml溴化乙錠 tB)來(lái)排除在Hom-I與TCF4之間的相互作用中可能的核酸干擾。發(fā)現(xiàn)EtB并不會(huì)破壞TCF4和Hom-I的相互作用，這暗示著Hom-I與TCF4之前的相互作用并不依賴于它們與DNA的結(jié)合。Hom-I抑制beta-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)活Lef/Tcf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄使用LET/TCF報(bào)告TOPflash分析來(lái)確定Hom-I對(duì)于LEF/TCF4的beta-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)活的影響。發(fā)現(xiàn)Hom-I單獨(dú)并不能在細(xì)胞中激活LEF1/TCF4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。相反，Hom-I以一種濃度依賴性的方式阻礙了 beta-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)活Lef/Tcf介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步確認(rèn)Hom-I對(duì)于beta-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的抑制效果，實(shí)施分析來(lái)檢測(cè)Hom-I在HCTl 16細(xì)胞中對(duì)于LEF/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的影響，該細(xì)胞組成型地表達(dá)高水平內(nèi)源性beta-連環(huán)蛋白活性。這些結(jié)果顯示，Hom-I在HCTl 16細(xì)胞中是以一種濃度依賴性的方式抑制LEF1/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，但是對(duì)于beta-連環(huán)蛋白的mRNA或蛋白的表達(dá)卻沒有施加顯著的影響。為了探討隱藏在Hom-I活性之下的不同的機(jī)制，檢測(cè)了 Hom-I是否破壞了beta-連環(huán)蛋白和TCF4復(fù)合體的形成，該復(fù)合體是beta-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)活LEF/TCF靶基因所必需的。用Myc-Hom-I短期轉(zhuǎn)染HCTl 16細(xì)胞以增加濃度。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集HCT116細(xì)胞的裂解液，用特異性抗體免疫沉淀TCF4。特異性的抗體被用于檢測(cè)免疫復(fù)合物中的任何Hom-I和beta-連環(huán)蛋白。據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著免疫復(fù)合物中Myc-Hom-I水平的增高，免疫復(fù)合物中的beta-連環(huán)蛋白表現(xiàn)出相應(yīng)的下降，這表明，Hom-I的表達(dá)破壞了 beta-連環(huán)蛋白/TCF4復(fù)合物的形成。因此，與那些beta-連環(huán)蛋白/LEF/TCF信號(hào)中的諸如Chibby的beta-連環(huán)蛋白相關(guān)抑制子的功能類似，阻止beta-連環(huán)蛋白和LEF/TCF因子復(fù)合物的形成可以解釋Hom-I對(duì)于beta-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)活LEF/TCF的抑制作用。Hom-I調(diào)節(jié)beta-連環(huán)蛋白/LEF1/TCF下游基因的表達(dá)在該部分，實(shí)施分析來(lái)檢測(cè)Hom-I對(duì)于內(nèi)源性LEF/TCF靶基因表達(dá)的影響，例如cyclin Dl0首先，使用CHIP分析來(lái)檢測(cè)Hom-I與cyclin Dl啟動(dòng)子之間的相互作用。用編碼myc-Hom-1和對(duì)照myc-標(biāo)簽的質(zhì)粒暫時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，隨后該細(xì)胞被用于myc-標(biāo)簽抗體的免疫共沉淀。用特異性引物擴(kuò)增Cyclin Dl啟動(dòng)子或作為陰性對(duì)照的IgG重鏈啟動(dòng)子Cmy。發(fā)現(xiàn)Hom-I與Cyclin Dl啟動(dòng)子特異性結(jié)合，但是不與對(duì)照Cmμ啟動(dòng)子結(jié)合。利用cyclin Dl啟動(dòng)子-熒光素酶分析進(jìn)一步檢測(cè)Hom-I對(duì)于Cyclin Dl的表達(dá)的影響。與Hom-1對(duì)LEF/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄一致，發(fā)現(xiàn)Horn-1在HCT116細(xì)胞中阻礙了Cyclin Dl啟動(dòng)子-熒光素酶構(gòu)建體的轉(zhuǎn)活，這與其對(duì)于TOPflash報(bào)告構(gòu)建體的效果類似。與Hom-I對(duì)于cyclin Dl表達(dá)的抑制效果一致，western印記分析顯示Hom-I導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cyclin Dl的水平發(fā)生濃度依賴型的降低。Hom-I是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控因子經(jīng)典Wnt/beta-連環(huán)蛋白/LEF/TCF通路被顯示與惡性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖有關(guān)系。在該部分，實(shí)施分析來(lái)評(píng)價(jià)Hom-I在細(xì)胞增殖中的作用。用RT-PCR檢查Hom-I在衍生自單個(gè)的和造血系統(tǒng)惡性腫瘤的癌癥細(xì)胞中的表達(dá)。確定了 Hom-I只在Nalml6淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞中，而不在其它癌癥細(xì)胞中表達(dá)(見下文和圖4D)。為了確定Hom-I對(duì)于細(xì)胞增殖的影響，GFP-Hom-I被暫時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)Reh淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中，該細(xì)胞并不表達(dá)內(nèi)源性Hom-1。陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用FACS進(jìn)行分選，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，MTT代謝分析和DNA合成咕胸腺嘧啶核苷摻入分析(圖3A)來(lái)確定Hom-I對(duì)于細(xì)胞增殖的影響。這些結(jié)果顯示Hom-I表達(dá)強(qiáng)烈地抑制Reh細(xì)胞的增殖。Hom-I對(duì)于其它癌癥細(xì)胞的增殖也獲得了類似的結(jié)果。為了進(jìn)一步評(píng)估Hom-I對(duì)于細(xì)胞增殖的影響，用shRNA技術(shù)下調(diào)Nalml6細(xì)胞中的Hom-I表達(dá)。將四個(gè)Hom-IshRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)Nalml6細(xì)胞中。這些構(gòu)建體對(duì)于下調(diào)Hom-I表達(dá)的有效性由RT-PCR確定，并使用實(shí)驗(yàn)室制備的特異性Hom-I抗體，由western印記分析進(jìn)一步證實(shí)。發(fā)現(xiàn)構(gòu)建體3對(duì)于Hom-I表達(dá)具有高特異性的活性，而構(gòu)建體1卻幾乎不引起效果(圖3B)。隨后，這些構(gòu)建體被用來(lái)轉(zhuǎn)染Nalmie細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素抗性來(lái)選擇陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些Hom-IshRNA對(duì)內(nèi)源性Hom-I表達(dá)的影響利用RT-PCR進(jìn)行確認(rèn)(圖3B，上欄)。Hom-I在對(duì)照和Hom-IshRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)使用Hom-I特異性抗體進(jìn)行免疫印記(圖3B，中欄)，并通過(guò)密度測(cè)定法來(lái)定量測(cè)定(圖3B，下欄)。這些結(jié)果表明構(gòu)建體-3，而非構(gòu)建體-1，有效地降低了 Hom-I在Nalml6細(xì)胞中的表達(dá)。利用細(xì)胞增殖分析和MTT分析進(jìn)一步確定Hom-I對(duì)細(xì)胞增殖的影響。如圖3C中所示，構(gòu)建體3對(duì)于Hom-I的下調(diào)與Nalmie的超增殖有關(guān)，但對(duì)照構(gòu)建體或構(gòu)建體1對(duì)于Nalmie的增殖不產(chǎn)生任何影響。上述結(jié)果顯示，Hom-I是細(xì)胞增殖的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子。為了確定Hom-I對(duì)于細(xì)胞增殖的影響是否與LEF/TCF靶基因的表達(dá)有關(guān)，檢測(cè)了Hom-I的下調(diào)對(duì)于cyclin Dl表達(dá)的影響。與超表達(dá)的效果相反，Hom-I的下調(diào)與cyclinDl在細(xì)胞中的水平增高有關(guān)(圖3D)。上述結(jié)果顯示，Hom-I至少部分通過(guò)抑制beta-連環(huán)蛋白/LEF/TCF信號(hào)和如cyclin Dl的下游細(xì)胞周期調(diào)控子的表達(dá)來(lái)下調(diào)細(xì)胞增殖。Hom-I的表達(dá)在造血細(xì)胞中是被高度調(diào)控的，并且顯示其與淋巴細(xì)胞白血病的癌變發(fā)生有關(guān)為了探討Hom-I的生理作用，利用組織cDNA陣列和RT-PCR來(lái)顯示其在成體組織的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)Hom-I的表達(dá)被高度限制在外周血白細(xì)胞中(圖4A)。外周血白細(xì)胞譜系分析顯示Hom-I在髓系和淋巴系中表達(dá)，包括單核細(xì)胞，B細(xì)胞，T細(xì)胞和中性白細(xì)胞(圖4B)。隨著B細(xì)胞的成熟，它的表達(dá)隨之增加(圖4C)。與Hom-I在外周B淋巴細(xì)胞中的生理表達(dá)相反，除了 Nalmie細(xì)胞之外，Hom-I在衍生自B細(xì)胞惡性腫瘤的癌癥細(xì)胞中基本不表達(dá)(圖4D)。此外，對(duì)衍生于單個(gè)癌癥的癌癥細(xì)胞系的篩查揭示，Hom-I并不在癌癥細(xì)胞系中表達(dá)，包括 HCT116，SW480, HT29, H印G2，PC3, LnCap, Hela, H460, H1299, MCF7, MDA 禾口SK-N-AS0 LEF/TCF因子已經(jīng)被表明在B淋巴細(xì)胞發(fā)育和白血病發(fā)生中起著重要的作用。與Hom-I對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)生的作用相一致，在EBV感染外周B細(xì)胞的永生化中，全長(zhǎng)Hom-I的表達(dá)水平被顯著降低。為了進(jìn)一步探討Hom-I在B細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)生中的作用，檢測(cè)外周血樣本中的全長(zhǎng)Hom-I的表達(dá)，這些樣本來(lái)自于新的診斷和未治療過(guò)的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的患者。所有ALL樣本包含最少95%的⑶19+白細(xì)胞。這些血樣中的總RNA水平的RT-PCR顯示，在所有7個(gè)ALL和10個(gè)CLL樣本中，Hom-I的表達(dá)顯著降低(圖5A)。還發(fā)現(xiàn)，在急性和慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中的外周血中，Hom-I表達(dá)下調(diào)與cyclin Dl的表達(dá)升高有關(guān)(圖5B)。一些機(jī)制能夠解釋Hom-I的表達(dá)被高度調(diào)控。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控，Hom-I的轉(zhuǎn)錄本包含一條長(zhǎng)的具有711個(gè)堿基對(duì)的富含GC的5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)。一個(gè)非典型的長(zhǎng)5’ UTR出現(xiàn)在大約10%的mRNA中，通常在能調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的基因之前，例如C-myc，HIF，和LEF/TCF。這條長(zhǎng)的5，UTR能夠形成一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，調(diào)控Hom-I的翻譯啟動(dòng)。因此，Hom-I的5’ UTR很可能在Hom-I表達(dá)的翻譯水平調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用。上述結(jié)果顯示，Hom-I是一個(gè)腫瘤抑制子，作為，至少部分作為L(zhǎng)EF/TCF-下游癌基因，如cyclin D1，表達(dá)的抑制子而起功能。這些結(jié)果還顯示了 Hom-I能夠用于預(yù)測(cè)淋巴細(xì)胞白血病的臨床行為，并且可作為鑒定能治療各種病癥，如癌癥，的藥物的靶標(biāo)。實(shí)施例2 Hom-I在p53充分型和缺陷型癌癥細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染，化療人類大腸癌細(xì)胞系HCT116，SW480，人類肺癌細(xì)胞系H460和H1299獲自于美國(guó)典型培養(yǎng)中心(Manassas，VA)。HCT116(p53+)細(xì)胞系是贈(zèng)品。所有細(xì)胞系在37°C和5% (X)2下培養(yǎng)。HCT116，HCT116(p53+)和 SW480 的細(xì)胞培養(yǎng)基包含 McCoy，s 5A(INVITROGEN,Carlsbad, CA)，而 H460 和 HU99 的則包含 RPMI-1640 (INVITROGEN)。細(xì)胞培養(yǎng)基中均加Λ 10%的胎牛血清(HYCLONE, Logan, UT)，100單位/ml青霉素，100 μ克/ml鏈霉素，和250ng/ml 的兩性霉素 B(MEDIATECH，Hemdon, VA)。根據(jù)廠商操作說(shuō)明，用 Lipofectamine2000 (INVITR0GEN)轉(zhuǎn)染。本研究中使用的抗癌癥藥物，包括5-氟尿嘧啶(5_FU，50ug/ml)和鹽酸阿霉素(D0X，0. 4ug/ml)從SIGMA (ST. Louis, MO)購(gòu)得。所有藥物都溶解于DMSO中，并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至合適的濃度。質(zhì)粒及其構(gòu)建用基于PCR的技術(shù)將編碼Hom的核酸亞克隆進(jìn)pCS2+載體，GFP-標(biāo)簽。通過(guò)體外翻譯和測(cè)序來(lái)證實(shí)構(gòu)建體。共聚焦顯微鏡HCT116細(xì)胞接種于玻璃載玻片上，用Hom-GFP表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。M小時(shí)后，在PBS中用仲甲醛固定細(xì)胞，碘化丙啶(PI，SIGMA)復(fù)染色。在PBS中洗滌4次，每次5分鐘后，裝上玻片，用共聚焦顯微鏡進(jìn)行分析。細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)分析收集包括附著的和漂浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞，在含有終濃度為3. 7%甲醛，0.5%Nonidet P40，和lOyg/ml的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚的PBS溶液中進(jìn)行固定。通過(guò)在顯微鏡下觀察到凝聚染色質(zhì)和微核化來(lái)評(píng)估細(xì)胞凋亡。每個(gè)條件至少實(shí)施3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次至少測(cè)量400個(gè)細(xì)胞。用3- (4，5- 二甲基噻唑-2) _5_ (3-羧基甲基苯基)-2- (4-磺苯基)_2H_四唑分析(MTT)在96孔板(8，000細(xì)胞/每孔)中測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)，根據(jù)廠商操作說(shuō)明，使用CellTiter96 AQueous One Solution (PR0MEGA, Madison, WI)來(lái)進(jìn)行測(cè)量。使用 VERSAmax 可調(diào)酶標(biāo)儀(Sunnyvale，CA)測(cè)量A49tlnm值。載體處理的細(xì)胞被設(shè)定為1 (100 。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)，并至少重復(fù)兩次。群落形成分析根據(jù)廠商操作說(shuō)明，用Lipofectamine 2000 (INVITR0GEN)在IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染細(xì)胞M小時(shí)。然后收集細(xì)胞，用FAC G4分選流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)分選GFP-載體或GFP-Homl陽(yáng)性細(xì)胞。這些GFP陽(yáng)性細(xì)胞以每孔1 X IO5細(xì)胞置于6孔板中。讓細(xì)胞生長(zhǎng)5-10天，之后用結(jié)晶紫(SIGMA)進(jìn)行染色。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少兩次，在每次測(cè)試中均獲得了相似的結(jié)果。 異種移植腫瘤和組織染色 所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是經(jīng)過(guò)哈佛醫(yī)學(xué)院學(xué)校動(dòng)物保護(hù)和利用委員會(huì)的批準(zhǔn)的。在IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用Lipofectamine 2000 (INVITR0GEN)轉(zhuǎn)染細(xì)胞M小時(shí)。然后收集細(xì)胞，用FAC G4分選流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)分選載體-GFP或Homl-GFP陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)將 IxlO5 載體-GFP 或 Hom-GFP 陽(yáng)性 HCTl 16 (p53+/+)或 HCTl 16 (p53+)細(xì)胞 s. c 注射進(jìn)5至6周齡的雌性無(wú)胸腺裸鼠(SIM0NSEN LABORATORIES,Gilroy,CA)的側(cè)腹中來(lái)建立移植腫瘤。同時(shí)，將Ix IO6包括GFP-陽(yáng)性和陰性的未分選的細(xì)胞s.c注射到其他裸鼠中，建立未分選移植腫瘤模型。每周用卡尺測(cè)量3次，根據(jù)公式(長(zhǎng)度χ寬度2)/2計(jì)算腫瘤體積，以監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。立即用10%中性緩沖福爾馬林固定移植腫瘤組織。然后將該組織進(jìn)行石蠟包埋和切片。用蘇木精和伊紅(H組)對(duì)切片進(jìn)行染色，然后用于組織學(xué)分析。用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)，根據(jù)廠商操作說(shuō)明利用重組末端轉(zhuǎn)移酶(ROCHE，Indianapolis, IN)和 dUTP-Alexa 594(MOLECULAR PROBES)進(jìn)行染色，再用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚進(jìn)行復(fù)染色。所有的圖像都使用SPOT照相圖形軟件，通過(guò)Nikon TS800熒光顯微鏡獲得。細(xì)胞分級(jí)從2個(gè)60-cm2皿中離心收集漂浮的和附著的細(xì)胞，重懸于均質(zhì)緩沖液中(0. 25mol/L蔗糖，10mmol/L HEPES (pH 7. 4)，和 lmmol/L EGTA)，在冰上用 2_ml 的 Dounce 勻漿器勻漿40次。勻漿物在1000xg，4°C下離心10分鐘以沉淀細(xì)胞核。上清液繼續(xù)在14，OOOxg，4°C下離心30分鐘，獲得胞漿(上清)組分。Western 印記對(duì)總細(xì)胞裂解液，線粒體和胞漿組分進(jìn)行純化，并用4-20% Tris-甘氨酸凝膠(INVITR0GEN, Carlsbad, CA)電泳進(jìn)行分離。對(duì)于活性的caspase_3，PARP和Hom的分析，提取總細(xì)胞，并用4-20% Tris-甘氨酸凝膠(INVITR0GEN)電泳進(jìn)行分離。所使用的抗體包括GFP (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), Histone-I (Ab-1, NE0MARKERS, Fremont, CA),和 β-肌動(dòng)蛋白(SIGMA)，活性 caspase-3 (BD BIOSCIENCES)，以及 PARP (CELL SIGNALINGTECHNOLOGY, Boston, MA)。合適的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗被用于檢測(cè)一抗和抗原復(fù)合物的結(jié)合，之后用Western Lightning Western印記化學(xué)發(fā)光試劑Plus (PERKINELMER，Boston, ΜΑ)檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄-PCR根據(jù)廠商操作說(shuō)明，用TRIzol 試劑(INVITR0GEN)分離總RNA。用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(INVITR0GEN)合成第一鏈cDNA。接著，將每個(gè)RT反應(yīng)的混合物用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)從20 (GAPDH)至35(Hom)不等。每個(gè)循環(huán)包括一個(gè)熱變性階段(94 °C，60秒)，一個(gè)退火階段(57°C，30秒)，一個(gè)延伸階段(72°C，30秒)。PCR產(chǎn)物根據(jù)大小在2%的瓊脂糖凝膠中被分級(jí)，并能在紫外燈下看到。用于擴(kuò)增Hom的引物包括5，-AAGGCAATTAGGCGCTGCTT-3，和 5’ -ACAGAACAACTGAGTCCTCCA-3，。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以均值士SD來(lái)表示。用ANOVA分析來(lái)評(píng)估統(tǒng)計(jì)分析，在該分析中，使用最小顯著差異法來(lái)實(shí)施多重比較。如果差異偶然發(fā)生的概率<5/100，則認(rèn)為差異是顯著的(P< 0. 05)。結(jié)果Hom-I編碼一個(gè)核蛋白Hom-I是非洲爪蟾Xom蛋白的人類同源物，它們具有相似的結(jié)構(gòu)同源性。為了確定Hom-I的細(xì)胞內(nèi)定位，構(gòu)建了編碼具有氨基末端GFP標(biāo)簽的全長(zhǎng)Hom-I的表達(dá)載體。將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中，用共聚焦顯微鏡觀察嵌合蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布。HCT116細(xì)胞的細(xì)胞核用PI染色以進(jìn)行標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)Hom-I靶向轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核中，與PI同位。為了進(jìn)一步確定Hom-I的核定位，用蔗糖梯度來(lái)對(duì)亞細(xì)胞組分進(jìn)行分級(jí)，隨后用western印記分析確定Hom-I在各個(gè)組分中的分布。發(fā)現(xiàn)Hom-I富集于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核組分中，而GFP富集于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)組分中。Hom通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制人類腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)如上面所討論的，Hom-I是致癌Wnt信號(hào)的拮抗劑。為了確定Hom-I對(duì)實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的影響，實(shí)施分析來(lái)檢測(cè)Hom-I對(duì)于人類癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。發(fā)現(xiàn)用編碼GFP-Hom-I或GFP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HCTl 16結(jié)腸癌細(xì)胞，H460肺癌細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞(用腺病毒Ela轉(zhuǎn)化，帶有一個(gè)與新霉素共選擇的溫度敏感性T抗原)。對(duì)于所有的這三個(gè)細(xì)胞系，通過(guò)GFP信號(hào)的指示，大約有35-50 %的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，根據(jù)廠商操作說(shuō)明用MTS分析細(xì)胞生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)GFP對(duì)于待測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)不產(chǎn)生任何影響。然而，GFP-Hom-I對(duì)待測(cè)癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制。有趣的是，GFP-Hom-I在非癌癥細(xì)胞中具有很低的生長(zhǎng)抑制效果。這些發(fā)現(xiàn)與之前的觀察即腫瘤依賴(對(duì)致癌通路)相一致。此外，實(shí)施群落形成分析來(lái)探討Hom-I對(duì)于細(xì)胞長(zhǎng)期生存的影響。用編碼GFP-Hom-I或GFP的質(zhì)粒暫時(shí)轉(zhuǎn)染HCTl 16細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞，通過(guò)GFP信號(hào)分選細(xì)胞，然后以每孔IX IO5個(gè)細(xì)胞的稀釋度置于6孔板中。定植于板中之后M小時(shí)，用熒光顯微鏡和相差顯微鏡可見HCTl 16結(jié)腸細(xì)胞(90%附著在板上)。定植后96小時(shí)，再一次用相差顯微鏡和熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在定植后96小時(shí)的時(shí)候，在轉(zhuǎn)染GFP-Hom-I的孔中很少有GFP陽(yáng)性的細(xì)胞，這表明GFP-Hom-I抑制了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)。在其它的人類癌癥細(xì)胞系中也觀察到了類似的結(jié)果，包括Sw480，H460和HU99。與暫時(shí)轉(zhuǎn)染研究的結(jié)果一致，293T細(xì)胞的生長(zhǎng)只會(huì)被GFP-Hom-I輕微抑制。分選的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)顯示GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中形成多個(gè)群落，但是在用GFP-Hom-I轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中很少有群落產(chǎn)生。在GFP-Hom-I轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，群落數(shù)量只是降低了 20%。為了確定GFP-Hom-I轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中這種生長(zhǎng)抑制是否是細(xì)胞凋亡的結(jié)果，通過(guò)顯微觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞以確定凋亡特征的存在，來(lái)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行評(píng)定，這些特征諸如凝集的染色質(zhì)和如之前所描述的用Hoechst 33258染色后的微核化(Waldman T，et al. Nature1996,381 :713)。發(fā)現(xiàn)GFP并不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是GFP-Hom-I在人類癌癥細(xì)胞系中誘導(dǎo)了大量的細(xì)胞凋亡。此外，GFP-Hom-I并不能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，這是一個(gè)非癌癥細(xì)胞系。這些結(jié)果表明Hom-I是人類癌癥細(xì)胞有力的生長(zhǎng)抑制誘導(dǎo)劑，其是部分通過(guò)誘導(dǎo)凋亡起作用。Hom-I的生長(zhǎng)抑制效果在非癌癥人類四31~細(xì)胞中顯著減少，這可能反映出之前注意到的現(xiàn)象即癌癥依賴于致癌通路。Hom-I在ρ53缺陷型細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡Ρ53是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因。超過(guò)百分之五十的癌癥由于Ρ53基因的直接突變而具有失活的Ρ53。為了確定Hom-I的腫瘤抑制效果是否依賴于功能性的ρ53，實(shí)施分析來(lái)研究Hom-I對(duì)于3個(gè)癌癥細(xì)胞系的效果，這三個(gè)細(xì)胞系是HCTl 16ρ5!3ΚΟ，ρ53缺陷性HU99以及Ρ53突變型SW480，其中由于突變或人工敲除而使ρ53喪失其功能。分析Hom-I對(duì)這些癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的效果的方法從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)和上述的方法是一樣的。實(shí)施MTS分析，體外細(xì)胞生長(zhǎng)分析，以及群落形成分析。這些結(jié)果顯示Hom-I強(qiáng)烈地抑制了這些缺乏功能性Ρ53的待測(cè)癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)(分別地，P <0.01)。在ρ53缺陷型細(xì)胞中，凋亡圖像顯示Hom-I同樣誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。Hom-I 誘導(dǎo) Caspase-3 的激活Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。它部分或者全部負(fù)責(zé)許多重要蛋白質(zhì)的蛋白裂解，例如核酶聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。Caspase-3被確定為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一個(gè)關(guān)鍵性的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子。凋亡的誘導(dǎo)導(dǎo)致前caspase-3被切割以及產(chǎn)生活性的17kDa caspase-3和12kDa caspase-3片段。激活的caspase-3靴向包括PARP和其它c(diǎn)aspases在內(nèi)的凋亡通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。為了研究caspaes-3的激活是否參與Horn-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提取總蛋白，利用活性caspase-3抗體通過(guò)western印記來(lái)分析caspase-3的活性。發(fā)現(xiàn)在p53充分型和缺陷癌癥細(xì)胞中，是GFP-Hom-I而不是GFP的表達(dá)激活了 caspase-3。這些結(jié)果表明Hom-I以P53非依賴性的方式誘導(dǎo)caspase-3的激活。Hom-I在體內(nèi)通過(guò)誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)為了確定Hom-I在體內(nèi)是否具有抗腫瘤活性，用編碼GFP或GFP-Hom-I的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HCTl 16p53野生型(WT)細(xì)胞系和HCT116 p53敲除型(KO)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染效率大約為35-40% (圖6A)。這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)率通過(guò)向裸鼠的背部皮下注射細(xì)胞來(lái)確定。表達(dá)GFP的細(xì)胞被注射進(jìn)背部的左邊，而表達(dá)GFP-Hom-I的細(xì)胞則被注射進(jìn)背部的右邊。腫瘤的生長(zhǎng)通過(guò)原位檢測(cè)和剪除來(lái)測(cè)定(圖6B)。發(fā)現(xiàn)在p53充分型和p53缺陷性HCTl 16細(xì)胞中，是GFP-Hom-I而不是GFP在體內(nèi)抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。H&E染色以及TUNEL染色的原位凋亡分析顯示表達(dá)Hom-I的腫瘤表現(xiàn)出大量的片段化DNA，這表明Hom-I在體內(nèi)通過(guò)誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例3 =Hom-I抑制子誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表汰實(shí)施分析來(lái)確定Hom-I是否可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞中的前炎性細(xì)胞因了的表達(dá)，例如白細(xì)胞介素-1 (IL-I)，白細(xì)胞介素-6 (IL-6)，白細(xì)胞介素-8 (IL-8)，腫瘤壞死因子-α (TNF- α )，和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)。特別地，確定從細(xì)胞中抑制Hom-I，通過(guò)RNAi制劑，是否會(huì)降低細(xì)胞因子的表達(dá)。未分化的單核U937細(xì)胞在包含M-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)四天，該培養(yǎng)基可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化。將這些細(xì)胞用直接作用于Hom-l(構(gòu)建體3)或GFP的RNAi制劑進(jìn)行電穿孔，然后再繼續(xù)培養(yǎng)3天。據(jù)評(píng)估，只有一半的電穿孔細(xì)胞成功吸收了 RNAi制劑。脂多糖(LPS，1 μ g/ml)隨后加入到培養(yǎng)基中以誘發(fā)細(xì)胞因子的表達(dá)；24小時(shí)后收集細(xì)胞。用如實(shí)施例1中描述的方法，提取細(xì)胞的總RNA，對(duì)提取的RNA進(jìn)行RT-PCR，用實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量細(xì)胞中IL-1, IL-6, IL-8，或 TNF-alpha mRNA。據(jù)發(fā)現(xiàn)在用靶向Hom-I的RNAi制劑電穿孔的細(xì)胞中，細(xì)胞因子的mRNA水平被極大地降低。相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞(也就是，用靶向GFP的RNAi制劑電穿孔的細(xì)胞)，每種細(xì)胞因子的mRNA水平都降低了 40%至60%。因?yàn)橹挥幸话氲募?xì)胞吸收了 RNAi制劑，真實(shí)的抑制程度比40-60%更高，可能會(huì)達(dá)到100%或接近于100%。該結(jié)果表明，Hom-I抑制劑，例如RNAi制劑，可以用于降低前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，因此能夠治療ARDS和其它的由這些細(xì)胞因子介導(dǎo)的類似的呼吸道/肺部病癥。實(shí)施例4 Hom-I促進(jìn)淋巴細(xì)胞發(fā)育Hom-I在正常髓系和淋巴系細(xì)胞中是高度表達(dá)的。在造血干細(xì)胞的成熟過(guò)程中，其表達(dá)被上調(diào)。未分化的包含GFPTet或GFPHom-lTet的單核細(xì)胞U937細(xì)胞被用于該實(shí)驗(yàn)中。GFPTet或GFPHom-lTrt是轉(zhuǎn)基因，當(dāng)暴露在四環(huán)素(Tet)下就能夠被激活，從而能分別過(guò)量表達(dá)GFP和GFP與Hom-I融合蛋白。細(xì)胞在含有Tet的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。隨后如上述加入LPS，M小時(shí)后收獲細(xì)胞。用如上述同樣的方式確定IL-1，IL-6，IL-8，TNF-alpha，或M-CSF的mRNA水平。據(jù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的mRNA水平在超表達(dá)Hom-I的細(xì)胞中顯著增高。比只表達(dá)GFP的對(duì)照細(xì)胞中的水平高約10至超過(guò)300倍。該結(jié)果表明Hom-I促進(jìn)淋巴細(xì)胞的成熟和分化。進(jìn)一步實(shí)施分析來(lái)檢測(cè)Hom-I在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的作用，上述兩種細(xì)胞是天然和獲得性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵性因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hom-I對(duì)單核細(xì)胞發(fā)育為巨噬細(xì)胞起著關(guān)鍵的作用。更為具體地，在初級(jí)單核細(xì)胞中抑制Hom-I的表達(dá)對(duì)終端巨噬細(xì)胞的分化帶來(lái)了極度的損害。使用上述的siRNA將單核細(xì)胞中的Hom-I表達(dá)降低，這使得成纖維細(xì)胞樣形狀的形態(tài)發(fā)生終止，大大減少了細(xì)胞表面⑶71標(biāo)志，F(xiàn)cyRI⑶64，⑶40，⑶86，整聯(lián)蛋白CDllb和CDllc，TLR4(Toll樣受體4)，MR(甘露糖受體)和CD14的表達(dá)。有趣的是，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法確定該蛋白的低表達(dá)并沒有降低初級(jí)單核細(xì)胞的活力。其它一些細(xì)胞表面分子的表達(dá)，例如HLA-DR，并沒有受到Hom-I低表達(dá)的影響，這排除了單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的降低由Hom-I抑制的細(xì)胞毒性導(dǎo)致的可能性。另外，與對(duì)照細(xì)胞相比，用siRNA轉(zhuǎn)染的單核細(xì)胞表現(xiàn)出降低的吞噬活性，這表明Hom-I是單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的功能性發(fā)育所必需的。相反，Hom-I在單核細(xì)胞中的超表達(dá)加速了單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化，如轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面CD71表達(dá)升高所顯示。類似的，Hom-I在髓系U937細(xì)胞中的異常表達(dá)也誘發(fā)了它們的分化，表現(xiàn)出突出的巨噬細(xì)胞特征，包括上面提及的標(biāo)志物的表達(dá)，明顯的形態(tài)學(xué)變化(細(xì)胞變得有附著性，產(chǎn)生大量的偽足)，增強(qiáng)的吞噬活性，以及前炎性細(xì)胞因子分泌的增高。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示了 M-CSF受體是Hom-I的直接的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)。在臨床患者中，Hom-I的表達(dá)與一些前炎性細(xì)胞因子表達(dá)正相關(guān)的事實(shí)表明，Hom-I在炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)理和治療中起著重要的作用。其它
具體實(shí)施例方式本說(shuō)明書中所公開的所有特征可以進(jìn)行任意的組合。本發(fā)明所公開的每個(gè)特征都可以被另外一個(gè)具有相同，等同或類似目的的特征所代替。因此，除非有特別陳述，每一個(gè)公開的特征只是一類等同或類似特征的例子。本發(fā)明已經(jīng)描述了許多實(shí)施例。然而，這將被理解為可以有多種改進(jìn)而不背離本發(fā)明的精神和范圍。相應(yīng)地，其它實(shí)施例落入下述權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種RNAi制劑，其包含第一鏈，該第一鏈包含與編碼Hom-I蛋白的基因區(qū)域具有同源性的第一核苷酸序列，其中所述RNAi制劑靶向編碼Hom-I蛋白的基因轉(zhuǎn)錄得到的mRNA。
2.如權(quán)利要求1的RNAi制劑，其中RNAi制劑進(jìn)一歩包含第二鏈，該第二鏈具有與第一序列互補(bǔ)的第二核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1的RNAi制劑，其中所述第一序列包括4，6，7，或8。
4.ー種含有如權(quán)利要求1的RNAi的藥物組合物。
5.如權(quán)利要求3的藥物組合物，其中該藥物組合物是ー種鼻腔氣霧劑或吸入氣霧劑組合物。
6.一個(gè)分離的核酸，其包含序列SEQ ID NO :3，4，6，7，或8，或其互補(bǔ)序列。
7.ー種降低個(gè)體中前炎性細(xì)胞因子水平或炎性細(xì)胞水平或活性的方法，包括向所需要的個(gè)體施用有效量的含有序列SEQ ID NO 1的多肽的抑制劑。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中所述的細(xì)胞因子是TNF-α，IL-Ιβ，或IL6。
9.如權(quán)利要求7的方法，其中所述抑制劑是ー種抗體，一條反義核酸或ー個(gè)RNAi制劑。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中RNAi制劑包含序列SEQID Ν0:4，6，7，或8。
11.如權(quán)利要求7的方法，其中抑制劑是潑尼松，依木蘭，甲氨喋呤或驍悉。
12.—種治療患有免疫系統(tǒng)疾病或處于免疫系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)中的人類個(gè)體的方法，包括向所需要的個(gè)體施用有效量的含有序列SEQ ID NO 1的多肽的抑制劑。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中抑制劑是ー種抗體，一條反義核酸或ー個(gè)RNAi制劑。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中RNAi制劑包含序列SEQID NO :4，6，7，或8。
15.如權(quán)利要求12的方法，其中免疫系統(tǒng)疾病是ー種炎癥疾病。
16.如權(quán)利要求12的方法，其中免疫系統(tǒng)疾病是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。
17.如權(quán)利要求12的方法，其中個(gè)體患有或疑似患有流行性感冒。
18.ー種提高個(gè)體中炎性細(xì)胞的水平或活性的方法，包括向所需要的個(gè)體施用有效量的含有序列SEQ ID NO :1或5的多肽，或其功能等同物，或編碼該多肽的核酸。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
20.一種控制患者治療的方法，包括確認(rèn)處于或者需要治療ー種癥狀的患者， 從患者中獲取生物樣本，確定樣本中基因的表達(dá)水平，該基因編碼包含SEQ ID NO 1的多肽， 其中如果該水平處于或高于預(yù)定值，則該患者被確定為適合進(jìn)行治療。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中該方法進(jìn)ー步包括將表達(dá)水平與患者或醫(yī)生或患者的看護(hù)者進(jìn)行交流。
22.如權(quán)利要求20的方法，其中的癥狀是細(xì)胞増殖性疾病。
23.如權(quán)利要求20的方法，其中的癥狀是炎性或自身免疫性疾病。
24.ー種用于診斷免疫系統(tǒng)疾病或控制患者治療的試劑盒，包括ー種或多種選自于包含以下的組具有SEQ ID NO :1序列的蛋白的特異性抗體， 具有SEQ ID NO 1序列的多肽， 擴(kuò)增SEQ ID NO :2，3，或5的片段的PCR引物對(duì)，以及在嚴(yán)格條件下與參考核酸的互補(bǔ)鏈雜交的核酸，其中的參考核酸由SEQ ID N0:2，3，或 5組成。
25.如權(quán)利要求M的試劑盒，其中的疾病是ALL，CLL，AML，MDS，SLE，IBD，RA或移植排斥。
26.—種診斷個(gè)體中免疫系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括從該個(gè)體中獲得生物樣本；確定樣本中基因的表達(dá)水平，該基因編碼含有SEQ ID NO 1的多肽。
27.如權(quán)利要求20的方法，其中的疾病是細(xì)胞増殖性疾病，如果該表達(dá)水平低于第一預(yù)定水平或沒有表達(dá)，則個(gè)體被確定為患有或傾向于發(fā)生細(xì)胞增殖性疾病。
28.如權(quán)利要求20的方法，其中的疾病是炎性或自身免疫性疾病，如果該表達(dá)水平高于第二預(yù)定水平，則該個(gè)體被確定為患有或傾向于發(fā)生該疾病。
全文摘要
本發(fā)明揭露治療免疫系統(tǒng)疾病的組合物和方法。還揭露了診斷方法和預(yù)后方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102575250SQ201080032111
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月15日
發(fā)明者朱正侖, 高紅 申請(qǐng)人:朱正侖, 高紅