專利名稱：生物技術(shù)生產(chǎn)軟骨素的制作方法
生物技術(shù)生產(chǎn)軟骨素領(lǐng)域現(xiàn)狀軟骨素是由交替的N-乙酰-D-半乳糖胺β 1 4和D-葡糖醛酸β 1 3的殘基形成的天然線性多糖。在脊椎動(dòng)物中，軟骨素以各種N-乙酰-D-半乳糖胺的4和6位羥基殘基硫酸化所產(chǎn)生的硫酸化形式存在，在一些情況下，是葡糖醛酸的2和3位殘基硫酸化(Sugahara K等人，J. Biol. Chem.，1996，271，26745-54)。軟骨素的分子量和硫酸化的程度與位點(diǎn)取決于組織的類型和年齡(Kuettner KE等人編著，Articular cartilage and osteoarthritis,NY,Raven Press, 1992 ；Volpi N編著，Chondroitin sulfate !structure, role and pharmacological activity, S.Diego, California Academic Press-Elsevier Inc,2006)o硫酸軟骨素屬于葡糖氨基聚糖的大家族，稱為GAG(Beaty NB和Mello RJ, J. Chromatography and BiomedicalApplications，1987，418，187-222)。這些多糖與蛋白質(zhì)共價(jià)連接作為蛋白聚糖，是所有結(jié)締組織的胞外基質(zhì)的普遍組分，發(fā)揮多種功能 (Ruoslathi E, Ann. Rev. Cell. Biol. , 1988,4,229-255 ；Kjellen L and Lindahl U, Ann. Rev.Biochem.，1991，60，443—76)。一些病原細(xì)菌生產(chǎn)莢膜結(jié)構(gòu)作為致病性因子。在一些情況下，為了在感染過程中欺騙免疫系統(tǒng)，莢膜是由GAG或相關(guān)結(jié)構(gòu)形成的。這些病原體的實(shí)例是多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) (DeAngelis PL,等人，Carbohydrate Res. 2002，337 (17)， 1547-52 ；Harper Μ,等 A, FEMS Microbiol.Lett. ,2006,265(1), 1-10 ；LeonovAV,等人，Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2006，Nov-Dec (7)，94-7)、大腸桿菌有莢膜菌株 K4 和 K5(Roberts IS, Ann. Rev. Microbiol. 1996,50,285-31 ；Bronner D,等人， J Bacteriol. 1993Sep ；175 (18) :5984-92 ；Jann B and Jann K In Escherichia coli Mechanisms of virulence. Cambridge Univ. Press. 1997 ；WhitfieldC, Annu. Rev. Biochem. 2006,75 :39-68. Stevens MP,等人，Mol. Microbiol. 1997，24 (5)，1001-12 ; Whitfield C and Roberts IS, Mol. Microbiol. 1999,31,1307-20 ；Ninomiya Τ,等人， J. Biol. Chem. 2002，277 (24)，21567-75)，和一些有莢膜的鏈球菌菌株(ffessels MR,等人， Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991,88,19,8317-21 ；Tlapak-SimmonsVL 等人，J. Biol. Chem.， 2005，280，13，13012-18)。硫酸軟骨素被用作抗風(fēng)濕和保護(hù)軟骨(condroprotective)藥物，應(yīng)用于治療膝的脛腓骨關(guān)節(jié)炎tibiofibular osteoarthritis和關(guān)節(jié)軟骨的骨關(guān)節(jié)炎(Kuettner KE 等人編著，in Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992 ； Simanek V 等 A,2005,149,51-56 ；Goerres GW 等人，J.Clinical Desitometry 2005， 8,484-487 ；Altman RD φ A, OsteoArthritis and Cartilage 2005,13,13-19 ；Chan PS,等人，OsteoArthritis and Cartilage 2005，13，387-394 ;Chou MM,等人，Exp. Biol. Med. 2005,230,255-262 ；Clegg DO,等人，New England J. of Medicine，2006，23， 795-808 ;Roman-Blas 等人，OsteoArthritis and Cartilage,2006,14,839-848 ；Maheu E 等人，OsteoArthritis and Cartilage，2006，14，303-322 ;FotiniN 等人，Biomed. Chromatogr. 2006,20,539-550 ；Lagnaoui R 等人，Thrapie2006，61，341-346 ;Volpi N 編著，Chondroitin sulfate :structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California AcademicPress-Elsevier Inc, 2006 ；Zhang W^A Ann. Rheum. Dis. 2007,66, 377-388)。目前，硫酸軟骨素是通過提取技術(shù)從各種動(dòng)物來源獲得的，例如豬軟骨、鯊魚鰭和硬骨魚的軟骨。原材料的短缺和下游純化工藝的復(fù)雜程度限制了該活性成分的全球利用度，因此市場受限于不能滿足不斷增長的需求。而且，從長遠(yuǎn)來看，由于不斷頒布對動(dòng)物來源藥物的安全性日益嚴(yán)格的管理?xiàng)l例，通過提取獲得的硫酸軟骨素可能將被排除在制藥市場之外。因此，對于開發(fā)替代性的生物技術(shù)對策，通過合適的微生物發(fā)酵來生產(chǎn)該類多糖或其前體的興趣與日俱增?？茖W(xué)文獻(xiàn)(RodriguezML 等人，Eur. J. Biochem.，1988，177，117-24 ；Manzoni M 等人，Biotechnology Letters，1996，18，383-6)和專利文獻(xiàn)(W0 01/02597 Al)的報(bào)道顯示通過發(fā)酵獲得軟骨素的可能性，使用大腸桿菌K4菌株生產(chǎn)軟骨素衍生物——K4多糖，其碳骨架與軟骨素相同，但在葡糖醛酸的C3處添加了 β呋喃果糖殘基?？梢酝ㄟ^對果糖殘基的受控的酸水解，從Κ4多糖獲得軟骨素(US6，288, 044 ；US 6，777，398)。然而，由于多糖前體在發(fā)酵過程中的低產(chǎn)量，在最佳情況下不超過0. 42g ·廠1 (W001/02597)，從K4前體生產(chǎn)軟骨素沒有被開發(fā)作為實(shí)際的工業(yè)方法。U. S. 2005266460 和一系列已報(bào)道的專利文件(W0 0180810, EP1282684, EP 1832662，U. S. 20030104601, U. S. 20050164984)描述了多殺巴斯德氏菌的軟骨素合酶的用途，該酶催化從相應(yīng)的UDP糖合成軟骨素。特別的是，這些文件要求保護(hù)編碼所述酶的核苷酸序列片段，表達(dá)此類核苷酸序列片段的重組系統(tǒng)(在原核和真核生物中的表達(dá)系統(tǒng))的構(gòu)建和使用，和從此類重組系統(tǒng)生產(chǎn)各種大小的軟骨素。所有的文件都缺少關(guān)于要求保護(hù)的工藝的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，特別是完全沒有詳細(xì)報(bào)道關(guān)于在生物技術(shù)方法中生產(chǎn)酶的發(fā)酵模式和軟骨素產(chǎn)量的數(shù)據(jù)。在第一優(yōu)先權(quán)之后約10年內(nèi)，沒有開發(fā)出任何與上述要求保護(hù)的內(nèi)容相關(guān)的產(chǎn)業(yè)方法。U. S. 20070015249和之前報(bào)道過的專利文件U. S. 20030109693描述了從大腸桿菌
K4中生產(chǎn)軟骨素合酶，及其在體外生產(chǎn)軟骨素的用途。由大腸桿菌K4的kfoC基因編碼的酶的生產(chǎn)，其特征是下列步驟kfoC擴(kuò)增、將基因克隆到載體pTrcHis中，和從商業(yè)的大腸桿菌TOP菌株中表達(dá)，其中所述基因位于負(fù)責(zé)莢膜抗原生物合成的基因簇的II區(qū)中。這兩份文件還要求保護(hù)具有天然和人工突變的蛋白質(zhì)，所述突變可引起軟骨素合酶輕微的結(jié)構(gòu)改變而不改變其催化功能。這些文件還缺少關(guān)于要求保護(hù)的生產(chǎn)工藝的產(chǎn)量、軟骨素合酶的生產(chǎn)和在體外從相應(yīng)的UDP-糖生產(chǎn)軟骨素的數(shù)據(jù)。EP 1950308 和一系列在先的專利文件(W0 2007145197、W02007069693、WO 2007058252、WO 2007058252、WO 2007023867)描述了使用大腸桿菌K4及其變體的軟骨素合酶，在體外合成軟骨素及其衍生物的方法，所述變體只有兩種轉(zhuǎn)移酶活性中的一種。U. S. 7，273，729 和一系列在先的專利文件(JP 2004024208、US20060052335, US 20060057697、US 7，232，676)描述了人軟骨素合酶的用途，該酶催化從相應(yīng)的UDP糖合成軟骨素。文件要求保護(hù)人軟骨素合酶的結(jié)構(gòu)、包含所述酶序列的表達(dá)載體、所述載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)，和合成軟骨素多糖鏈的方法。
U. S. 20070059805要求保護(hù)人軟骨素合酶的結(jié)構(gòu)、包含所述酶序列的表達(dá)載體、所述載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)，和合成軟骨素多糖鏈的方法。所有上述提及的文件都沒有解決相比通過從動(dòng)物來源提取獲得的硫酸軟骨素，以有競爭力的成本生產(chǎn)軟骨素的難題。特別是使用大腸桿菌K4、多殺巴斯德氏菌及其軟骨素合酶變體進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，其特征是發(fā)酵肉湯中的產(chǎn)量不超過0. 5g · Γ1。使用大腸桿菌Κ4、 多殺巴斯德氏菌或人的軟骨素合酶及其變體的類似的生物技術(shù)方法，具有與酶生產(chǎn)和使用 UDP糖作為底物相關(guān)的高成本。因而，以與市場需求相符合的成本生產(chǎn)軟骨素的難題仍然沒有實(shí)踐的解決方案。發(fā)明概述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，通過使用基于優(yōu)化的三階段發(fā)酵方法(分批-補(bǔ)料分批-微濾方案)和遺傳修飾的細(xì)菌的整合對策，可以通過發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素，獲得>881^的產(chǎn)量。所述細(xì)菌優(yōu)選是遺傳修飾的大腸桿菌Κ4菌株，從而改造方法的目標(biāo)是通過插入多拷貝的自體RfaH基因，改善負(fù)責(zé)合成Κ4多糖的整個(gè)酶復(fù)合體的加工性能，所述RfaH基因作為負(fù)責(zé)合成莢膜材料的基因簇轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)子發(fā)揮作用。高產(chǎn)量、易于開發(fā)下游純化方法、方法的低的總成本和低環(huán)境影響，使這些發(fā)現(xiàn)優(yōu)于之前描述過的生物技術(shù)對策(Rodriguez ML等人，Eur. J. Biochem.，1988，177， 117-124 ；Manzoni M 等人，BiotechnologyLetters，1996，18，383-386 ;W0 01/02597 Al; US 6，288，044 ；US6, 777，398 ；US 2005266460 ；WO 01/80810 ；EP 1282684 ；EP 1832662 ； US 20030104601 ；US 20050164984 ；US 20070015249 ；US 20030109693 ；EP 1950308 ； WO 2007145197 ；WO 2007069693 ；WO 2007058252 ；W02007058252 ；WO 2007023867 ； US 7，273，729 JP 2004024208 ；US20060052335 ；US 20060057697 ；US 7，232，676 ；US 20070059805)。所開發(fā)的發(fā)酵方法，整合軟骨素的位點(diǎn)選擇性化學(xué)硫酸化作用的對策，使要求保護(hù)的生物技術(shù)方法與從動(dòng)物來源的原材料中提取硫酸軟骨素的常規(guī)方法相比較更有競爭性，后者由于目前關(guān)于產(chǎn)品安全性的條例的改變，可能將從制藥市場中消除。發(fā)明詳述本發(fā)明描述了使用遺傳修飾的細(xì)菌微生物(例如大腸桿菌，優(yōu)選K4)和使用允許生產(chǎn)莢膜多糖、軟骨素前體(在多糖K4的情況下，是在位置3的葡糖醛酸果糖基化的軟骨素)的特定生長條件的發(fā)酵方法，獲得高于8g · Γ1的產(chǎn)量，該產(chǎn)量比迄今描述過的方法高約20倍。該對策的特征是下列階段多步驟發(fā)酵方法(分批-補(bǔ)料分批-微濾方案)，應(yīng)用重組的大腸桿菌K4菌株， 其特征是存在多拷貝的自體RfaH基因(Santangelo和Roberts T.J Mol Cell 2002 APR 9(4) :698-700),所述RfaH基因是負(fù)責(zé)合成莢膜材料的基因簇轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)子；對缺少生物量的已耗盡的發(fā)酵肉湯直接進(jìn)行水解處理，能夠?qū)⒍嗵荎4轉(zhuǎn)化為軟骨素和果糖，同時(shí)通過切割微生物大量生產(chǎn)的脂多糖(LPQ成為0-鏈和脂質(zhì)A，而使發(fā)酵上清液脫毒，后者被立即沉淀，可以方便的去除；基于膜處理(membrane processes)的創(chuàng)新的下游純化工藝，能夠?qū)④浌撬?-鏈與培養(yǎng)基中存在的其他污染物分離。相比現(xiàn)有技術(shù)，要求保護(hù)的方法是新穎和有創(chuàng)造性的，因?yàn)檫@是唯一允許在工藝規(guī)模實(shí)施來生產(chǎn)軟骨素的方法，作為具有極大制藥市場潛力的多糖，軟骨素目前還沒有實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)、提取或生物技術(shù)的方法。此外，所要求保護(hù)的方法整合了軟骨素的位點(diǎn)選擇性硫酸化對策，使得目前能夠滿足市場上對硫酸軟骨素的增長的需求，規(guī)避了現(xiàn)有生產(chǎn)對策中基于動(dòng)物來源的提取和與使用動(dòng)物來源相關(guān)的問題。細(xì)菌菌株的改造野牛型大腸桿菌K4 (EcMwt)——有許多已知的大腸桿菌菌株都是有莢膜的，基于莢膜的抗原決定簇(目前已知約80種抗原決定簇)和物理、生物化學(xué)和遺傳性規(guī)則，被分為4個(gè)不同的血清學(xué)類別。組1和4的莢膜屬于引起腸道感染的大腸桿菌菌株，包括致腸病型(EPEC)、產(chǎn)腸毒素型(ETEC)和腸出血型(EHEC)菌株。組1莢膜是由多糖形成的，由于存在具有非常相似的結(jié)構(gòu)的糖醛酸，其是酸性的。組4莢膜的結(jié)構(gòu)反而極其不同，特征是在其重復(fù)的單元中存在N-乙?；陌被?。組2和3中的莢膜屬于引起腸外感染(ExPEC)的大腸桿菌菌株。EcMwt是經(jīng)過遺傳修飾過表達(dá)K4多糖的微生物，屬于血清學(xué)2組，可以以不同的代碼從主要的微生物保藏機(jī)構(gòu)獲得，例如美國典型培養(yǎng)物收藏中心USA(ATCC 23502)、 國際埃希氏菌中心，丹麥(菌株Bi 8337/41)、英國國立典型培養(yǎng)物收藏中心，UK(菌株NCTC 9005)和 Freiburg 收藏中心(菌株 U1-41 2616) 令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)EcMwt攜帶了內(nèi)源性質(zhì)粒，自此以首字母縮寫PK4命名，該質(zhì)粒在大腸桿菌K4中的存在尚未見文獻(xiàn)描述過。PK4包括約93，000個(gè)堿基，是組成型的，其特征是包括可用于插入異源基因序列 IDNO :1和/或IDNO 6的序列。它平均存在1_5拷貝/細(xì)胞，并且它的遺傳修飾是穩(wěn)定的。RfaH,負(fù)靑莢膜材料合成的基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子——細(xì)菌中的長的多順反子操縱子的轉(zhuǎn)錄通?；谳o助蛋白質(zhì)，其分子機(jī)制尚不清楚。例如，負(fù)責(zé)合成莢膜分子組分的基因簇2區(qū)和3區(qū)的單個(gè)mRNA分子的轉(zhuǎn)錄受抗終止子基因rfaH編碼的蛋白質(zhì)的控制，后者因此作為轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控子發(fā)揮功能，阻止轉(zhuǎn)錄物的過早阻礙。通過增加RNA聚合酶的加工性能，由RfaH基因編碼的蛋白質(zhì)激活若干負(fù)責(zé)腸道細(xì)菌致病性和育性的基因轉(zhuǎn)錄(Stevens MP 等人，Mol. Microbiological.，1997，24，1001-12)。一般而言，由 RfaH 基因編碼的蛋白質(zhì)是大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)的脂多糖核心的生物合成(Pradel E和 Schnaitman CA, J. Bacteriol.，1991，173，6428-31 ；Brazas R,等人，J. Bacteriol. 1991， 173,6168-73)、α-溶血素的合成和分泌(Bailey MJA 等人，Mol. Microbiol. 1992,6, 1003-10)以及性別因子 F 的生產(chǎn)(Beutin L 和 Achtman MJ，Bacteriol. 1979，139，730-37) 所必需的。并且，Zhang 及其同事(Zhang L 等人，Infect. Immuno. 2004,72,7282-93)報(bào)道，一般而言，血清學(xué)2組的莢膜抗原的表達(dá)需要rfaH基因編碼的蛋白質(zhì)，并顯示所述蛋白質(zhì)是負(fù)責(zé)在大腸桿菌K5中合成莢膜多糖的基因簇2區(qū)的轉(zhuǎn)錄所必需的。Rahn和 Whitfield (Rahn A 和 C. Whitfield，Mol. Microbiological. 2003，47，1045-60)顯示，在大腸桿菌血清學(xué)1組中的K30，合成莢膜的簇的轉(zhuǎn)錄受RfaH基因產(chǎn)生的抗終止子機(jī)制的調(diào)節(jié)。RfaH基因和相應(yīng)蛋白質(zhì)在莢膜組分合成方法中的關(guān)鍵角色被涉及刪除或改變該基因的研究所間接證實(shí)。具體而言，Nagy及其同事(NagyG，等人，Infect. Immun. 2002，70， 4406-13)報(bào)道，從尿致病性(uropathogenic)大腸桿菌536菌株的基因組中刪除rfaH基因急劇的降低了在小鼠中的致病性，從野生型菌株導(dǎo)致的100%致死降低到突變菌株的 18%。消除RfaH基因還決定了 LPS表型的改變，和降低的K15莢膜和α-溶血素生產(chǎn)。Stevens 及其同事(Stevens MP 等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett.，1994，124，93-8)顯示了在 rfaH基因序列中導(dǎo)入突變，使大腸桿菌K5細(xì)胞在37°C不能生產(chǎn)莢膜。相反，文獻(xiàn)中沒有關(guān)于rfaH過表達(dá)效果的可獲得的數(shù)據(jù)。在菌株EcMwt中，rfaH基因處于受調(diào)控的啟動(dòng)子控制，該啟動(dòng)子決定了在靜止生長期中的最大表達(dá)(Stevens MP，等人，Mol. Microbiol.，1997，24，1001-12 ；Stevens Μ. P.， 等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett.，1994，124，93-98)。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌(例如大腸桿菌，尤其是EcMwt)的遺傳材料中整合一份或多份拷貝的rfaH基因，顯著的改善了 K4多糖的生產(chǎn)。為了實(shí)現(xiàn)更有效的轉(zhuǎn)錄，可以將整合的rfaH基因置于優(yōu)選在生長的所有階段都有效的啟動(dòng)子控制下，例如pGap，這是編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的GapA基因的組成型啟動(dòng)子，該酶是大腸桿菌代謝必需的關(guān)鍵酶。具體而言，PGap啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)是多啟動(dòng)子區(qū)，包括P1、P2、P3和P4啟動(dòng)子。其中， Pl啟動(dòng)子是最強(qiáng)的，然而，四個(gè)啟動(dòng)子協(xié)同作用，保證在不同條件下的基因轉(zhuǎn)錄，使其更通用和有效。仍然可以使用在大腸桿菌中有活性的其他組成型啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是具有作為莢膜多糖的軟骨素前體的細(xì)菌菌株，優(yōu)選改造的大腸桿菌菌株，其中所述多糖優(yōu)選是K4，其特征是包含至少一拷貝的編碼rfaH蛋白或其功能等價(jià)片段的序列。這可以通過插入多個(gè)基因拷貝以可選的或組合的方式，作為染色體DNA元件或作為質(zhì)粒元件或可轉(zhuǎn)座元件而改造。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)手段，編碼rfaH蛋白的序列置于組成型啟動(dòng)子的控制下，或者包括至少一種選自 SEQIDN0 :1、SEQIDN0 :6、SEQIDN0 :9、SEQIDN0 :11、SEQIDN0 :12、SEQIDN0 13、SEQIDN0 20 的序列。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)通過使用按三個(gè)順序步驟進(jìn)行的發(fā)酵方法分批、補(bǔ)料-分批和微濾分案，可以從這些改造的細(xì)菌中獲得高產(chǎn)量的K4多糖。第一個(gè)分批階段持續(xù)到由于營養(yǎng)物耗盡而發(fā)生微生物(μ )生長速率降低，同時(shí)導(dǎo)致PO2增加時(shí)為止。第二個(gè)補(bǔ)料-分批階段的關(guān)鍵特征是補(bǔ)料模式，其利用濃縮的營養(yǎng)物溶液，支持微生物以低于最大的速率生長。具體而言，所要求的發(fā)酵對策涉及這樣的可能性，即通過用發(fā)酵參數(shù)的變化驅(qū)動(dòng)補(bǔ)料，而自動(dòng)優(yōu)化營養(yǎng)物的添加，所述參數(shù)是與營養(yǎng)物利用度的條件典型相關(guān)的，例如α分壓或培養(yǎng)基的ρη。該對策是通過專用軟件創(chuàng)造控制環(huán)路來實(shí)施的， 所述專用軟件基于PID控制器的優(yōu)化參數(shù)，確保為了滿足微生物生長的營養(yǎng)物需求而實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)，從而延長了生長期，避免了代謝物溢流現(xiàn)象，該現(xiàn)象可能導(dǎo)致基質(zhì)中積累抑制生長的有機(jī)酸(在EcK4的情況下，> 5g · L—1的醋酸濃度抑制生長)。第三個(gè)階段被成為微濾分案，是當(dāng)毒性分解代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致微生物生長降低或停止生長時(shí)激活的，即使仍存在可利用的營養(yǎng)物。該工藝涉及使用置于生物反應(yīng)器內(nèi)部或外部的微濾模塊，對培養(yǎng)基微濾。在微濾過程中，通過水平控制器保持發(fā)酵體積恒定，是通過添加與培養(yǎng)基制品使用的相容性組成的生理鹽水，自動(dòng)恢復(fù)所移除的微濾液的體積，保持發(fā)酵體積恒定。在發(fā)酵方法末期，K4多糖部分存在于微濾液中，部分存在于發(fā)酵罐中。分批生長——培養(yǎng)基中釋放K4多糖是EcK4r和EcMwt的組成型特征，同時(shí)生物量產(chǎn)量和生產(chǎn)率(K4多糖/生物量)取決于培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件。營養(yǎng)物一為了生產(chǎn)K4多糖，EcK4r和EcMwt的生長可以使用具有不同組成的培養(yǎng)基；例如，葡萄糖、糊精、淀粉、甘油、玉米漿、糖蜜可用作碳源，而蛋白胨、酵母提取物、 酪蛋白水解物、胰蛋白胨和大豆粉、棉花粉(cotton flour)、豌豆粉可用作非動(dòng)物來源的有機(jī)氮和復(fù)雜營養(yǎng)物。然而，培養(yǎng)基中的碳源和有機(jī)氮源之間的比例對有效生產(chǎn)是關(guān)鍵性的 (K4多糖/生物量)。具體而言，培養(yǎng)基中的有機(jī)氮量的減少，導(dǎo)致微生物較低的生長能力， 這與較高的生產(chǎn)K4多糖的能力相關(guān)。由于第二種效應(yīng)的影響大于第一種，因此，在較少復(fù)雜來源的半確定成分培養(yǎng)基中觀察到較高的生產(chǎn)率(K4多糖/L發(fā)酵液)。充氧作用——培養(yǎng)基的充氧作用對微生物的生長和K4多糖的生產(chǎn)沒有關(guān)鍵性的效應(yīng)，只要避免嚴(yán)格厭氧條件，保證在純氧中至少PA > 5%的飽和度。pH——生長發(fā)生在pH 3和10之間，然而pH 6-8的范圍對微生物的生長和K4多糖的生產(chǎn)是最佳的。因此，用PH穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)將培養(yǎng)基的pH自動(dòng)維持在該pH間隔范圍內(nèi)。溫度——微生物的生長和K4多糖的生產(chǎn)發(fā)生在25-40°C間隔范圍內(nèi)，最大的產(chǎn)量在 37°C。生長期——微生物在培養(yǎng)基中釋放K4多糖，在指數(shù)生長期釋放部分K4多糖，在靜態(tài)期完全釋放K4多糖。在搖瓶和發(fā)酵罐中的牛長——在可比較的生長條件下，發(fā)酵罐比搖瓶產(chǎn)生高4倍的產(chǎn)量(K4多糖/L發(fā)酵液)。補(bǔ)料-分批生長——令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)料對策避免了溢流代謝，是通過保持新鮮營養(yǎng)物的添加低于底物攝取的關(guān)鍵速率，改善生物量和多糖K4的產(chǎn)量而獲得的。例如，可以通過使?fàn)I養(yǎng)物補(bǔ)料處于反應(yīng)器中的溶解氧濃度的控制下的發(fā)酵對策來實(shí)現(xiàn)，所述溶解氧濃度應(yīng)該維持在30%的p02。這是通過與投遞濃縮營養(yǎng)物溶液(例如，甘油-大豆或葡萄糖-酵母提取物)的補(bǔ)料泵連接的PID控制器快速而可復(fù)制的實(shí)現(xiàn)的。實(shí)際上，向生物反應(yīng)器中添加碳源導(dǎo)致DOT減少(溶解氧強(qiáng)度(DissolvedOxygen Tension)).因而，在分批發(fā)酵的末期，尤其是當(dāng)P02值開始增加時(shí)，開始濃縮營養(yǎng)物供應(yīng)的補(bǔ)料階段，并以低的偏移 (-20%的PA設(shè)定)恢復(fù)PA至設(shè)定值。當(dāng)PA值達(dá)到設(shè)定點(diǎn)時(shí)，補(bǔ)料泵自動(dòng)停止，關(guān)閉補(bǔ)料， 直到發(fā)酵肉湯中的碳源耗盡，導(dǎo)致PO2值突然升高，并觸發(fā)如上所述的新一輪循環(huán)。然后，在代謝控制下，根據(jù)培養(yǎng)物的營養(yǎng)需求自動(dòng)并順序的進(jìn)行補(bǔ)料階段。通過PH變化的作用可以激活相似的補(bǔ)料驅(qū)動(dòng)對策；在此情況下，必需排除用于PH調(diào)節(jié)的自動(dòng)化pH穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，當(dāng)pH 增加到超過預(yù)定義的基于微生物生理學(xué)的閾值(例如，PH 7.8)時(shí)，通過內(nèi)收泵(adduction pump)的開啟向內(nèi)補(bǔ)料。在微濾方案下的生長——通過微濾工藝去除發(fā)酵培養(yǎng)基中積累的有毒組分，可以延長微生物的生長期和K4多糖的生產(chǎn)。微濾工藝是用外部單元進(jìn)行的，所述單元優(yōu)選用中空纖維制造，用切向微濾方案操作，降低了濾膜的污垢，并維持了高的跨膜流動(dòng)。微濾液的體積是使用水平控制器，用與培養(yǎng)基相同組成的生理鹽溶液自動(dòng)恢復(fù)的。在微濾過程中，營養(yǎng)物是根據(jù)受限于生長速率的補(bǔ)料方案，以濃縮溶液的形式添加的。這允許避免不理想的代謝物溢流現(xiàn)象和在微濾培養(yǎng)基的輸出流(洗脫液)中丟失營養(yǎng)物。這些條件導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)基的可溶性組分的連續(xù)稀釋，因此生產(chǎn)的軟骨素的一部分可見于滲透液中的。在微濾方案中，由于膜的阻力(Rm)和膜上形成的濾餅的阻力(Re)，在發(fā)酵方法的第三階段中獲得的滲透液含有低水平的大分子污染物(例如，蛋白質(zhì)、LPS等)。 因此，可以在超濾膜(UF)上直接處理此類滲透液，避免蛋白酶預(yù)處理，相反所述預(yù)處理是在去除細(xì)胞組分后耗盡的培養(yǎng)肉湯所需要的?？蛇x的，將微濾的滲透液添加到不含細(xì)胞組分的耗盡的培養(yǎng)肉湯中。從發(fā)酵肉湯中純化軟骨素分離生物量——在發(fā)酵方法末期，可以通過微濾或離心，或通過使用Fimda板式過濾器的土過濾(earth filtration)，來實(shí)現(xiàn)生物量去除。通過微濾去除生物量——微濾方法在發(fā)酵方法的末期持續(xù)，中斷添加生理鹽水。 當(dāng)微濾液中的生物量的量達(dá)到方法相容的最大值時(shí)(300-400g濕生物量L—1，對應(yīng)于濃縮發(fā)酵肉湯的體積3-5倍)，添加一倍體積的去離子水，繼續(xù)微濾；重復(fù)該洗滌步驟至少3次。 將在發(fā)酵過程中生產(chǎn)的所有滲透液和與去除生物量(無細(xì)胞培養(yǎng)基)相關(guān)的滲透液倒在一起，進(jìn)行下游方法的后續(xù)步驟?？蛇x的，可以將培養(yǎng)肉湯收集到消毒的容器中，并在特定的自動(dòng)化系統(tǒng)中進(jìn)行交叉流微濾處理，使用截留在0. 22至0. 6 □ m的盒式或優(yōu)選中空纖維。在此情況下，操作條件涉及150CM 40°C之間的T，在0. 8至1. 2atm之間的跨膜壓力，和40-100L · (min · mT1 的再循環(huán)切向流容量。施加較高的Δρ(>0. 5atm)導(dǎo)致跨膜流的增加和較短的處理時(shí)間， 但導(dǎo)致形成較厚的濾餅，后者阻止了完全回收洗脫液中的K4多糖。通過離心去除生物量——在發(fā)酵末期，通過連續(xù)離心從培養(yǎng)肉湯中分離生物量。 如果預(yù)先沒有超濾，則在實(shí)施下游方法的后續(xù)階段前，將回收的培養(yǎng)肉湯添加到超濾滲透液中。通過土過濾去除生物量——對于每升肉湯，所添加的過濾土(優(yōu)選硅藻土 )的量等于肉湯中濕生物量重量的4-8倍，然后，將懸浮液補(bǔ)入FUNDA型平板濾器中，在壓力下 (3-6bar)過濾。可以在通過特定的不對稱微濾膠囊(例如，GE的0. 6至0. 2 □ m)微濾后， 處理澄清的肉湯(0D600 ( 0. 1)以蛋白質(zhì)降解。蛋白質(zhì)的水解降解——為了將含有K4多糖的培養(yǎng)基去蛋白質(zhì)，添加一種或多種蛋白水解酶，優(yōu)選真菌蛋白酶(米曲霉(Aspergillus oryzae) 2-6UL—1)，并允許根據(jù)使用的溫度作用一定的時(shí)間長度05-37°C下l-;3h，4°C下8-20h)。超濾-滲濾——使用手動(dòng)或自動(dòng)化系統(tǒng)，超濾不含細(xì)胞組分和經(jīng)去蛋白化的發(fā)酵材料，所述系統(tǒng)安裝了用于切向超濾(UF)的膜，所述膜裝備為盒式或中空纖維模塊，由與方法相容的材料制造而成，優(yōu)選聚醚砜或聚丙烯，截留為50-300KDa，優(yōu)選lOOKDa，并具有包含在0. 02至0. 05m2/升待處理液體之間的面積。UF加工參數(shù)的操作范圍實(shí)例是切向流再循環(huán)容量4-10L · min—1 ；跨膜壓力0. 5-1. 4atm ；溫度20_40°C ；pH 4-8。培養(yǎng)肉湯不含細(xì)胞并經(jīng)過去蛋白化，如果沒有分開處理，則可以補(bǔ)充來自發(fā)酵階段的滲透液，將所述培養(yǎng)肉湯初始體積濃縮至多10-20倍，去除低分子量的污染物(鹽、肽、剩余營養(yǎng)物)。之后，用去離子化水或超純水(HPW 2-5體積)透析濃縮液，完全去除低分子量組分。酸處理——濃縮液進(jìn)行酸水解有雙重目的，即將K4多糖去果糖基化形成軟骨素和果糖，以及將LPS脂多糖脫毒化，從沉淀的脂類組分(脂質(zhì)A)中分離多糖組分(0-鏈)。使用的非窮舉的水解條件實(shí)例是0. 5至3.0% (ν/ν)的醋酸，pH 2-4，溫度60-100°C，水解時(shí)間1-池。在通過離心、過濾或微濾去除LPS的脂類組分后，使溶液成為中性pH，并與等體積的0. 1-0. 2M NaCl溶液混合，并再次濃縮-滲濾。可選的，可以在未濃縮的澄清肉湯去蛋白化后實(shí)施酸水解醋酸pH< 3， l-3h IOO0C )。該實(shí)驗(yàn)方法還導(dǎo)致脂多糖水解，和脂質(zhì)A的后續(xù)釋放及其沉淀，以及K4多糖的去果糖基化，從而產(chǎn)生軟骨素。在水解后，冷卻培養(yǎng)肉湯并離心，調(diào)節(jié)上清液至pH7，補(bǔ)充NaCl，然后濃縮并滲濾， 去除培養(yǎng)基的0-鏈和剩余組分。使用的膜(盒式或中空纖維模塊)由與方法相容的材料制成，優(yōu)選聚丙烯或聚醚砜，截留為lO-lOOKDa，優(yōu)選50KDa，并具有0010-0005m2/升待處理液體的過濾面積。由于去果糖基化涉及k4多糖和軟骨素的分子量之間約30%差異，故限制了膜的大小，因此，選定的截留分子范圍允許良好的回收，同時(shí)保留從低分子量污染物中純化的效應(yīng)(醋酸鈉、其他鹽類、肽剩余物、0-鏈)。UF方法參數(shù)的操作范圍實(shí)例是切向流再循環(huán)容量 4-10L .HiirT1 ；跨膜壓力0. 8-1. 4atm ；溫度20-40°C ;pH5_8。將上清液初始體積濃縮3-5倍， 去除大部分低分子量的污染物(果糖、0-鏈、鹽)，然后用去離子化水(5. 2倍體積)滲濾，完全去除低分子量組分，并推動(dòng)0-鏈(10-15KDa)與去果糖基化的軟骨素(30_50KDa)分離?；厥哲浌撬亍梢匀缦禄厥諟粑镏写嬖诘能浌撬豠)通過用有機(jī)溶劑沉淀 (在存在0. 1-0. 3M氯化鈉的條件下的2-5倍體積的95% ν/ν乙醇或丙酮)和之后在真空下熱干燥；b)通過凍干；c)通過噴霧干燥器。要求保護(hù)的下游方法能夠回收> 80%的理論值，導(dǎo)致生產(chǎn)> 95%純度的軟骨素， 內(nèi)毒素含量降低> 104，蛋白質(zhì)含量< 0.05%且麗30-50KD。在并非意在限制本發(fā)明范圍的條件下，下列實(shí)施例描述了 K4多糖的重組過度生產(chǎn)子的構(gòu)建，發(fā)酵對策和軟骨素純化的下游方法。實(shí)施例部分實(shí)施例1 構(gòu)建重組EcK4rl用于構(gòu)建重組子EcK4rl (大腸桿菌K4重組子1)的對策涉及為了在整個(gè)生長期內(nèi)獲得rfaH基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄，而在多拷貝(1- 的EcMwt (野生型K4大腸桿菌)內(nèi)源性H(4 質(zhì)粒中整合含有處于PGapPl (編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，GADPH的基因的組成型Pl啟動(dòng)子的一部分)控制下的rfaH基因的表達(dá)盒。A)構(gòu)建插入盒1)從EcMwt中提取基因組DNA——根據(jù)生產(chǎn)商提供的規(guī)程，使用Qiagen提供的 DNeasy Blood & Tissue試劑盒從EcK4wt中提取基因組DNA。2)適用于整合盒——在所有的PCR反應(yīng)中，使用高保真的DNA聚合酶(Expand High Fidelity PCR System，Roche)，在擴(kuò)增過程中降低失誤率。根據(jù)相同的規(guī)程實(shí)施所有的擴(kuò)增步驟，包括50-100ng起始材料；終濃度達(dá)200mM的引物Up ；終濃度達(dá)200mM的引物 Dw ；IX Taq緩沖液；IU Taq ；超純milliQ H2O至50 μ 1終體積。表1列舉了擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中使用的所有引物。3)功能盒(片段I)的擴(kuò)增~使用引物對pK4_up和FRT_dw(表1)擴(kuò)增試劑盒提供的盒。pK4-up oligo含有與PK4質(zhì)粒的5’部分相似的50bp區(qū)域，這是重組事件意在靶向的。使用的PCR模式是94°C下2' ；25個(gè)循環(huán)94°C下1'，56°C下Γ，72°C下2'； 72°C下 30〃。
4) Pgap (Pl)啟動(dòng)子(片段II)的擴(kuò)增~使用EcMwt染色體DNA作為擴(kuò)增甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子的模板。pGap_Up和pGap_dw引物(表1)用于根據(jù)下列模式的 PCR 反應(yīng)94°C下 2' ；25 個(gè)循環(huán)94°C下 30〃，52°C下 30〃 ；72°C下 30"。表1 用于構(gòu)建盒和用于在EcK4rl突變體中篩選陽性克隆的引物。
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權(quán)利要求
1.從細(xì)菌莢膜多糖前體制備軟骨素的方法，其特征是生長和擴(kuò)增包含至少一份改造拷貝的編碼rfaH蛋白或其功能等價(jià)片段的序列的細(xì)菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述rfaH蛋白編碼序列選自a.編碼細(xì)菌中的rfaH蛋白的序列，b.能夠在嚴(yán)緊條件下(例如，包括40至50°C之間的溫度，1.2-1.8x HPB)與大腸桿菌 rfaH序列雜交的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述rfaH序列或其功能等價(jià)片段包含在具有序列SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 13, SEQ ID N0:20 的表達(dá)盒內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(Escherichiacoli)，選自菌株K5、Κ4、Κ30，具有作為多糖前體的Κ5、Κ4和Κ30莢膜多糖，或者所述細(xì)菌是多殺巴斯德 1 (Pasteurella multocida)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，其中所述生產(chǎn)生物是在位置3的葡糖醛酸殘基上具有果糖基化的莢膜多糖軟骨素的大腸桿菌菌株EcK4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述大腸桿菌K4菌株選自ATCC23502I(美國典型培養(yǎng)物收藏中心——USA)、菌株Bi 8337/41(國際埃希氏菌中心——丹麥)、菌株NCTC 9005(英國國立典型培養(yǎng)物收藏中心——UK)、菌株U1-41 2616 (Freiburg收藏中心)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中所述rfaH蛋白編碼序列是通過插入多個(gè)基因拷貝而改造的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述多基因拷貝包括在染色體DNA、質(zhì)粒元件或可轉(zhuǎn)座元件中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述質(zhì)粒元件是K4中的內(nèi)源性質(zhì)粒，優(yōu)選的特征是至少包括序列ID NO :1禾口 ID NO :6。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的方法，其中所述rfaH蛋白編碼序列是通過插入組成型啟動(dòng)子而改造的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述組成型啟動(dòng)子選自甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼基因的多重啟動(dòng)子和其他大腸桿菌蛋白質(zhì)的組成型啟動(dòng)子，及其功能性等價(jià)片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的方法，其中細(xì)菌的生長和擴(kuò)增是通過在含有至少一種有機(jī)氮源、一種碳源和礦物鹽的復(fù)雜培養(yǎng)基中培養(yǎng)而進(jìn)行的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述有機(jī)氮源選自一種或多種下列化合物酵母提取物、bacto casitone、胰蛋白胨、豆粉、棉花粉、豌豆粉；碳源選自一種或多種下列化合物 葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、玉米漿、甘油；礦物鹽選自一種或多種下列的鹽磷酸鹽、 磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽、錳鹽、鐵鹽、銅鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求12-13的方法，其中在培養(yǎng)基中，有機(jī)氮源的比例范圍從0.1至 10%,優(yōu)選從0. 1至3%，碳源的比例范圍從0. 1至20%，優(yōu)選從0. 5至5%，礦物鹽的比例范圍從1至5%，優(yōu)選從1.5至2.5%。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14的方法，其中細(xì)菌的生長和擴(kuò)增是在分批發(fā)酵的條件下進(jìn)行的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中，在分批階段末期，隨著營養(yǎng)物減少，通過添加濃縮的營養(yǎng)物溶液按補(bǔ)料-分批分案進(jìn)行發(fā)酵。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中濃縮的營養(yǎng)物溶液包括碳源，例如甘油、葡萄糖、糊精、淀粉、玉米漿或其組合；和氮源，例如酵母提取物、大豆蛋白胨、植物蛋白水解物或其組I=I O
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17的方法，其中碳源和氮源的重量比范圍從1至20，優(yōu)選從5至10。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18的方法，其中濃縮營養(yǎng)物溶液的添加是在檢測了發(fā)酵材料的 PO2后進(jìn)行的，且其中所述PA維持在10-50%，優(yōu)選25-35%的空氣飽和范圍內(nèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中濃縮營養(yǎng)物溶液的添加是通過將營養(yǎng)物補(bǔ)料泵置于發(fā)酵材料的PH控制下進(jìn)行的，且其中所述pH維持在6至7. 5，優(yōu)選7. 2至7. 5的范圍。
21.根據(jù)權(quán)利要求15-20的方法，其中a)分批階段進(jìn)行的時(shí)間范圍從6至8小時(shí)，生物量濃度按濕重表示范圍從0.6至1%;b)補(bǔ)料-分批階段進(jìn)行的時(shí)間范圍從6至12小時(shí)，生物量濃度按濕重表示范圍從15至 4(^廣，該階段是當(dāng)微生物生長由于營養(yǎng)物耗盡而傾向于減慢時(shí)激活的，一般在發(fā)酵7- 后；其中，任選的，補(bǔ)料-分批階段b)整合了發(fā)酵肉湯的微濾，所述微濾是基于由毒性分解代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致微生物生長率降低而激活的，優(yōu)選在微生物生長12-48小時(shí)后進(jìn)行，其中通過添加與培養(yǎng)基使用的相同組成的生理鹽水保持發(fā)酵體積恒定，具有的生物量濃度按濕重表示范圍從40至leOgL—1。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中微濾階段是用板式結(jié)構(gòu)(flatconfiguration)的膜或中空纖維膜進(jìn)行的，截留在0. 1和0. 5μπι之間，優(yōu)選在0. 1和0. 2μπι之間，操作的切向流為 80-120L(min · m2”，優(yōu)選 90-100L(min-m2)-1。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22的方法，其中，在發(fā)酵末期，通過連續(xù)離心、過濾、優(yōu)選在土濾器上進(jìn)行，或者通過微濾，將生物量與培養(yǎng)肉湯分離，并回收無細(xì)胞的培養(yǎng)肉湯。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中為了獲得軟骨素，通過蛋白酶消化和酸熱處理來處理包含軟骨素的莢膜多糖前體的培養(yǎng)肉湯，組合至少一種下列額外的步驟超濾/滲濾、溶劑沉淀、真空過濾-干燥、噴霧干燥。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其中蛋白酶消化是通過用2-5U/L的蛋白酶孵育無細(xì)胞培養(yǎng)肉湯來進(jìn)行的，優(yōu)選在室溫下攪拌1-5小時(shí)，或在4°C攪拌IO-M小時(shí)。
26.根據(jù)權(quán)利要求M-25的方法，其中酸熱處理是為了將K4莢膜多糖去果糖基化為軟骨素；為了將LPS切割成寡糖(ο-鏈)和脂類(脂質(zhì)A)組分，而通過用0.5%-2%稀釋的醋酸，在60至110°C范圍的溫度下進(jìn)行處理的，優(yōu)選的時(shí)間范圍是0. 5-2小時(shí)，其中所述脂類組分隨后被沉淀并去除，例如通過離心。
27.根據(jù)權(quán)利要求23-26的方法，其中通過超濾/滲濾濃縮軟骨素是在板式結(jié)構(gòu)或中空纖維膜上進(jìn)行的，截留分子量范圍在50kDa至300kDa，優(yōu)選IOOkDa,優(yōu)選跨膜壓力(TMP) 梯度范圍從0. 8至1. 4atm，切向流為400_800L(h · m2”1。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-27的方法，其中所述溶劑沉淀是通過向無細(xì)胞培養(yǎng)肉湯添加2-4 倍體積的可混溶有機(jī)溶劑，之后沉淀軟骨素而進(jìn)行的，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮。
29.根據(jù)權(quán)利要求23-28的方法，其中醋酸處理是在超濾/滲濾濃縮后進(jìn)行的。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-29的方法，為了回收形式為任選的干燥沉淀物的軟骨素，還包括超濾和噴霧干燥器的干燥步驟。
31.制備硫酸軟骨素的方法，其特征是使用根據(jù)權(quán)利要求1-30的方法，并進(jìn)一步包括軟骨素的位點(diǎn)選擇性化學(xué)硫酸化作用。
32.大腸桿菌K4菌株，其特征是包括至少一個(gè)拷貝的改造的rfaH基因。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的菌株，其中所述rfaH蛋白編碼序列或其功能等價(jià)片段經(jīng)改造包括多個(gè)基因拷貝，可選的或組合的包含在染色體DNA、質(zhì)粒元件或可轉(zhuǎn)座的元件中。
34.根據(jù)權(quán)利要求32-33的改造的大腸桿菌K4菌株，其中rfaH蛋白編碼序列處于組成型啟動(dòng)子的控制下。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的菌株，其特征是包括至少一種選自SEQIDN0:1、SEQIDN0 :6、 SEQIDN0 9, SEQIDN0 11, SEQIDN0 12、SEQIDN0 13、SEQIDN0 20 的序列。
全文摘要
描述了通過發(fā)酵遺傳突變的細(xì)菌，高濃度的生產(chǎn)軟骨素的創(chuàng)新方法。
文檔編號(hào)C12P19/26GK102459625SQ201080032889
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日
發(fā)明者C·斯基拉爾迪, D·奇米尼, M·德羅薩 申請人:阿爾特剛股份有限公司