專利名稱：在處的單核苷酸多態(tài)性和癌癥風(fēng)險的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及癌癥和分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了用于預(yù)測增加的發(fā)展成癌癥的風(fēng)險的組合物和方法。
背景技術(shù)：
盡管在癌癥檢測方面已經(jīng)實現(xiàn)了很多進(jìn)步，但是仍然存在一種需要來識別各種各樣的癌癥的新的遺傳標(biāo)記，從而可以方便的用于臨床應(yīng)用。迄今為止，對于預(yù)計發(fā)展成癌癥的風(fēng)險的方法只有很少的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的方法不僅提供了能夠有效識別乳腺和卵巢癌癥基因中多態(tài)性的方法，并且提供了評價這些單核苷酸多態(tài)性(SNPs)對靶向基因調(diào)節(jié)和乳腺及卵巢癌癥患病風(fēng)險的效果的方法，其中，所述乳腺和卵巢癌癥基因有效的改善miRNAs結(jié)合靶分子能力這些方法可以用來識別具有增加的乳腺癌癥及卵巢癌癥患病風(fēng)險的病人，這些病人在之前是不能被識別出來的。更為恰當(dāng)?shù)氖牵褂帽景l(fā)明的方法識別或者表征的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)發(fā)生在圍繞并且包括BRCAl基因的區(qū)域內(nèi)，或者發(fā)生在圍繞并且包括BRCAl基因的信使核糖核酸(mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明提供了一種方法，這種方法用于在與乳腺癌癥和卵巢癌癥有關(guān)的基因的3'-未翻譯的區(qū)域(UTR)中識別單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的方法，所述與乳腺癌癥和卵巢癌癥有關(guān)的基因能夠有效的修飾微RNAs(miRNAs)的結(jié)合能力。在一種優(yōu)選的實施方案中，與乳腺癌癥和卵巢癌癥有關(guān)的基因是BRCA1，包括BRCAl基因本身、在該基因組附近的區(qū)域、BRCAl調(diào)節(jié)的元素和/或其信使核糖核酸(mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。一些本領(lǐng)域內(nèi)已知的數(shù)據(jù)庫可以用來對所關(guān)心的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進(jìn)行計算機(jī)識別，這些數(shù)據(jù)庫包括，但是不局限于，HapMap(The International HapMap Project, Nature, 2003. 426，789-96 (發(fā)表在“自然”第似6期第789-796頁的“國際人類基因組單體型圖計劃”))、dbSNP(Sherry，S. T. et al. Genome Res 1999. 9，677_9)和人類工程數(shù)據(jù)庫 (Ensembl Project database)(可以從以下網(wǎng)址獲得 http//www. ensembl. org),以及一些專業(yè)算法，例如，PicTar (Landi，D. et al. DNA Cell Biol (DNA 細(xì)胞生物學(xué) M2007))、 TargetScan(Lewis,B. P. et al. Cell 2005.120,15-20),miRanda(John,B. et al. PLoS Biol2004. 2，e363)、miRNA. org (Betel，D. et al. Nucleic Acids Res (核酸研究)2008. 36，D 149-53)，和 Microlnspector(Rusinov，V. et al. Nucleic Acids Res 2005. 33，W696-700)， 從而識別miRNA結(jié)合位點。本發(fā)明還提供了一種識別乳腺和卵巢腫瘤、鄰近的正常組織(當(dāng)可以得到的時候)以及正常組織樣品的方法，從而評價miRNA互補(bǔ)位點上的序列變化。在本發(fā)明方法的一種優(yōu)選的實施方案中，BRCAl基因或者其mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包含所述miRNA互補(bǔ)位點。在本發(fā)明的某些實施方案中，使用鄰近的正常組織來證明這些變化是否是種系單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)。做為選擇，或者另外，非種系3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)突變也被進(jìn)行臨床有效性分析。此外、本發(fā)明提供了一種方法，用于體外評價識別的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)對目標(biāo)基因調(diào)節(jié)作用的效果。在本發(fā)明方法的一種優(yōu)先的方面中，BRCAl基因或者其mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含所述識別的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的方面中， BRCAlmRNA的3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)中包含所述識別的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。在本發(fā)明的某些方面，使用一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和熒光素酶試驗測定表達(dá)水平，來評價單核苷酸多態(tài)性(SNPs) (Chin，LJ. et al. Cancer Res 2008 (2008 年的癌癥研究).68，8535-40 ； Johnson, S. Μ. et al. Cell 2005. 120,635-47).為了產(chǎn)生野生型的 3'未翻譯的區(qū)域 (3' UTR)，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從一種細(xì)胞系中放大人類基因組。為了構(gòu)建變體序列，使用定點誘變的方法(Johnson，S. Μ. et al. Cell 2005. 120，635-47)。然后，將這些構(gòu)建物克隆進(jìn)入熒光素酶報道基因。最終，通過使用GraphPad柱定量報道基因的表達(dá)(Chin， L.J.et al. Cancer Res 2008. 68，8535-40)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于估計發(fā)展成為乳腺癌癥和卵巢癌癥的風(fēng)險的方法。在該方法的一個方面，相對于該疾病在世界人口中可預(yù)計的流行程度，將所關(guān)心的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的流行程度與在樣品癌癥人口中的流行程度相比較。在本發(fā)明方法的一種優(yōu)選的實施方案中，BRCAl基因或者其mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含所關(guān)心的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。 對于新的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，可以在與世界人口進(jìn)行比較之間，創(chuàng)造一種TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)試驗(Applied Biosystems公司)，用于等位基因識別。在這里提供的方法的其他的實施方案中，所關(guān)心的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與乳腺癌癥和卵巢癌癥病例參照物相比， 從而確定相對于總?cè)丝诤蜎]有攜帶這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的個體而言，發(fā)展成為乳腺癌癥和/或卵巢癌癥增加的患病風(fēng)險有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。具體地，本發(fā)明提供了一種分離的并且純化的BRCAl單倍體，這種分離的并且純化的BRCAl單倍體包括至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中，這種單核苷酸多態(tài)性(SNPs) 的存在增加了患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險。本發(fā)明的單倍體是分離的并且純化的基因組或者互補(bǔ)DNA序列。此外，單倍體是分離地，純化地，并且，任選地是，擴(kuò)增后的序列。從其中分理處單倍體序列的基因組DNA和互補(bǔ)DNA序列是來自生物樣品中的， 所述生物樣品包括，體液和組織。最常見地，衍生出單倍體的DNA序列是從，例如，血液或者腫瘤樣品中分離出來的，所述血液或者腫瘤樣品來自正?；颊呋蛘叽龣z測患者之中。在這種單倍體的一個方面，每一單核苷酸多態(tài)性(SNPs)都能改變一個或者一個以上miRNA 的活性。在這種單倍體的另一個方面，每個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)都能增加或者降低一個或者一個以上miRNA的活性。在某些方面，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)增加或者降低一個或者一個以上miRNA與miRNA結(jié)合位點的結(jié)合效果。miRNA結(jié)合效果的改變增加或者減少了 BRCAl的表達(dá)，并且，在優(yōu)選的實施方案中，miRNA結(jié)合效果的改變減少了 BRCAl的表達(dá)。單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以位于BRCAl基因的非編碼區(qū)域或者編碼區(qū)域、在此基因周圍，或者在能夠調(diào)節(jié)、改變或者減少BRCAl表達(dá)的基因組的基因序列中間或者基因序列之中。位于BRCAI基因非編碼區(qū)域以及編碼區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位于miRNA結(jié)合位點，并且因此抑制一個或者一個以上miRNA的活性。在這個單倍體的某些實施方案中，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由 ra9911630, rsl2516, rs8176318, rs3092995, rsl060915, rs799912，rs9908805，和rsl7599948所組成的組中。在一種優(yōu)選的實施方案中，單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由 rsl2516,rs8176318,rs3092995,rsl060915,^P rs799912 所組成的組中。在最具有選擇性的實施方案中，所述單倍體包含rs8176318和rsl060915。做為選擇， 所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)是rs8176318或rsl060915。在這里描述的單倍體能夠增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險。盡管本發(fā)明包括乳腺癌癥和卵巢癌癥的所有的亞類，但是乳腺癌癥的某些特定的亞類通常預(yù)計是三重陰性的(TN) (ER/PR/HER2陰性的)、是雌激素受體陽性(ER+)、雌激素和孕激素受體陽性的(ER+/PR+)、并且是人類表皮生長因子受體2陽性的(HER2+)。在一種優(yōu)選的實施方案中，這里描述的單倍體很少是最常見的與三重陰性(TN)的乳癌有關(guān)。不希望被任何理論所限制，在這里所列出的激素受體特異型乳癌亞類之中，三重陰性(TN)乳腺癌是最不常見的與偶發(fā)原因有關(guān)的乳腺癌，因此，這種乳腺癌最有可能是遺傳的。三重陰性(TN)乳腺癌與包含rs8176318單核苷酸多態(tài)性(SNP)和/或rsl060915的單倍體正向相關(guān)，尤其是在非洲籍美國患者中。本發(fā)明包含所有公開的單倍體。優(yōu)選的單倍體包括這里描述的“罕見的”單倍體GGACGCTA(SEQ ID NO :6)、GGCCGCTA (SEQ ID NO :9)、GGCCGCTG (SEQ ID NO: 10)、 GGACGCTG (SEQ ID NO :21)，或者 GAACGTTG (SEQ ID NO :26)。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了一種BRCAl多態(tài)特性，這種多態(tài)特性表明一種增加的發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險，所述特性包括確定存在或者不存在以下單核苷酸多態(tài)性(SNPs)rs8176318和rsl060915，其中，這些單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的存在表明具有增加的發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險。在某些實施方案中，該特性進(jìn)一步包括確定存在或者不存在至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由以下所組成的組中rs12516、rs30^995和rs799912。作為選擇，或者另外，該特性包括確定存在或者不存在至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由以下所組成的組中rs9911630、rs9908805和rsl7599948。在這種特性的一個方面，rs8176318、 rsl060915、rsl2516、rs3092995、rs799912、rs9911630、rs9908805、或者 rsl7599948 能夠改變至少一個微RNA(miRNA)的結(jié)合效果。做為選擇，rs8176318、rsl060915、rsl2516、 rs3092995、rs799912、rs9911630、rs9908805，和 rsl7599948 能夠增加或者減少至少一種微RNA (miRNA)的結(jié)合效果。所述至少一種miRNA是任意人類miRNA，由，例如，miRBase (公眾可以通過http://www.mirbase.org/得到)提供。在某些實施方案中，所述miRNA是 miR-19a, miR-18b, miR-19b, miR-146-5p, miR-18a, miR-365, miR-210, miR-7, miR-151-3p, miR-1180。優(yōu)選的，所述 miRNA 是 miR-7。在其他的實施方案中，該特性進(jìn)一步包括識別BRCAl基因中存在或者不存在至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述BRCAl基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)減少一種或者一種以上微RNA的結(jié)合效果。所述至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以存在于編碼區(qū)域或者非編碼區(qū)域。示范性的非編碼區(qū)域包括，但是不局限于，3'未翻譯的區(qū)域(UTR)、一種基因內(nèi)區(qū)、一種基因間的區(qū)域、一種順式調(diào)節(jié)元素、啟動子元素、增強(qiáng)子元素、或者5'未翻譯的區(qū)域(UTR)。編碼區(qū)域的一種非限制性的實施例是一種外顯子。在這里描述的特性能夠決定患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險。盡管本發(fā)明包括乳腺癌癥和卵巢癌癥的所有的亞類，但是乳腺癌癥的某些特定的亞類通常預(yù)計是三重陰性的(TN) (ER/PR/HER2陰性的)、是雌激素受體陽性(ER+)、雌激素和孕激素受體陽性的(ER+/PR+)、并且是人類表皮生長因子受體2陽性的(HER2+)。在一種優(yōu)選的實施方案中，這里描述的特性用于確定患者，尤其是非洲籍美國人，發(fā)展成為三重陰性(TN)乳腺癌的風(fēng)險。本發(fā)明還提供了一種識別一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)能夠減少BRCAl基因的表達(dá)并且增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險，該方法包括(a)從待檢驗患者中獲得樣品；(b)獲得一種對照樣品；(c)確定來自待檢驗的患者體內(nèi)的DNA序列的至少一個miRNA結(jié)合位點中存在或者不存在單核苷酸多態(tài)性 (SNP)；和(d)與該miRNA對來自對照樣品的相應(yīng)DNA序列的相同miRNA結(jié)合位點的結(jié)合效果相比較，評價至少一個miRNA對至少一個包含所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)的miRNA結(jié)合位點的結(jié)合效果，其中，對照樣品和待檢測樣品之間，如果所述至少一個miRNA與相應(yīng)的結(jié)合位點之間的結(jié)合效果存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化，則說明單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在會抑制miRNA-調(diào)節(jié)的保護(hù)作用或者增加miRNA-調(diào)節(jié)的BRCAl基因表達(dá)的阻遏作用，從而識別同樣能夠增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥風(fēng)險的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。對照樣品和待檢測樣品之間，如果所述至少一個miRNA與相應(yīng)的結(jié)合位點之間的結(jié)合效果存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加或者減少，則表明所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者缺失能夠抑制miRNA-調(diào)節(jié)的保護(hù)作用或者增加BRCAl基因表達(dá)的阻遏作用。在本方法的某些實施方案中，所述待檢測的患者已經(jīng)診斷患有乳腺癌癥或者卵巢癌癥。相反，對照樣品是從沒有沒診斷出患有任何癌癥的患者中獲得的。此外，所述對照樣品還可以是一種對照值，所述對照值來自數(shù)據(jù)庫或者臨床研究。體內(nèi)、體外或者在活體外評價miRNA對來自待測試樣品或者對照樣品的DNA序列中的結(jié)合位點的結(jié)合效果。本發(fā)明還提供了一種識別一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)能夠減少BRCAl基因的表達(dá)并且增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險，該方法包括(a)從待檢驗患者中獲得樣品；(b)確定來自待檢驗的患者體內(nèi)的DNA序列的至少一個miRNA結(jié)合位點中存在或者不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)；和(c)相對于單核苷酸多態(tài)性(SNP)在一種或者更多種世界人口中的預(yù)期發(fā)病率，評價乳腺癌癥或者卵巢癌癥人口中單核苷酸多態(tài)性(SNP)的發(fā)病率，其中，與一種或者一種以上世界人口相比，腫瘤樣品中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加，則說明這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)魚發(fā)展成乳腺癌癥或者卵巢癌癥的患病風(fēng)險正向相關(guān)，并且， 其中，在至少一個能夠降低BRCAl表達(dá)的miRNA結(jié)合位點內(nèi)存在或者不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)表明，這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在能抑制miRNA調(diào)節(jié)的保護(hù)作用或者增加miRNA調(diào)節(jié)的BRCAl基因表達(dá)阻遏作用，從而識別同樣能夠增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥風(fēng)險的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。在本方法的某些實施方案中，所述待檢測的患者已經(jīng)診斷患有乳腺癌癥或者卵巢癌癥。相反，對照樣品是從沒有沒診斷出患有任何癌癥的患者中獲得的。此外，所述對照樣品還可以是一種對照值，所述對照值來自數(shù)據(jù)庫或者臨床研究。世界人口是指地理學(xué)上有區(qū)別的人口(歐洲人或者非洲籍美國人)或者種族人口(德系猶太人的)，世界人口中的成員之間由于其身體原因或者文化原因，可以預(yù)計具有相似的遺傳背景。關(guān)于識別單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的方法，一種miRNA結(jié)合位點是憑經(jīng)驗確定的、 或者是從數(shù)據(jù)庫中識別的，或者是使用一種計算方法來預(yù)計的。此外，單核苷酸多態(tài)性 (SNP)的存在或者不存在是憑經(jīng)驗確定的、或者是從數(shù)據(jù)庫中識別的，或者是使用一種計算方法來預(yù)計的。此外，該發(fā)明提供了一種識別具有發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險的患者的方法，該方法包括，a)從待檢測患者中獲得DNA樣品；和b)確定來自樣品至少一種DNA序列中存在至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由rsl2516、 rs8176318、rs3092995和rs799912所組成的組中，其中，在至少一種DNA序列中存在至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)會使患者發(fā)展為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險與正?；颊呦啾仍黾?0倍。在一種優(yōu)選的實施方案中，該方法進(jìn)一步包括確定rs 1060915存在的步驟，其中，在至少一種 DNA 序列中，rsl060915 和選自由 rsl2516、rs8176318、rs3092995 和rs799912所組成的組中的至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在使患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險與正?；颊呦啾仍黾?00倍。所述正?；颊呤窃趓sl2516、 rs8176318、rs3092995、rs799912或者rsl060915處不攜帶公有的等位基因的患者。本發(fā)明還提供了一種識別具有發(fā)展成為三重陰性(TN)乳腺癌的風(fēng)險的患者的方法，該方法包括，a)從待檢測患者中獲得DNA樣品；和b)確定來自樣品至少一種DNA序列中存在rs8176318或者rs 1060915，其中，與正?；颊呦啾?，在至少一種DNA序列中存在 rs8176318或者rs 1060915會增加患者發(fā)展為三重陰性(TN)乳腺癌的風(fēng)險。在一種優(yōu)選的實施方案中，該方法包括確定rs8176318和rs 1060915存在的步驟，其中，在至少一個 DNA序列中結(jié)合存在rs8176318和rs 1060915進(jìn)一步增加了患者發(fā)展成為三重陰性(TN) 乳腺癌的風(fēng)險。所述正?；颊呤遣粩y帶rs8176318或者rs 1060915的患者。待檢測患者優(yōu)選是非洲籍美國人。如這里對單倍體、特性和方法的描述，乳腺癌是偶發(fā)性的或者遺傳的。此外，卵巢癌癥是偶發(fā)性的或者遺傳的。


圖1是miRNAs生物發(fā)生學(xué)的示意圖。圖2是一種BRCAl 3'未翻譯的區(qū)域(3‘ UTR)的注釋。圖3是癌癥群體中BRCAl 3'未翻譯的區(qū)域(3‘ UTR)的示意性比較。通過從IM個癌癥DNA樣品和14個耶魯對照物DNA樣品擴(kuò)增整個BRCAl 3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)獲得一種序列，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)就是以此序列為基礎(chǔ)的。圖4表示了來自46種世界人口，包括2，472個體的3中單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點上的BRCAl 3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)基因型。
圖5是一種圖解，表示了來自7種癌癥群體和1種耶魯對照物群體的總共384位個體3個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點處的BRCAl 3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)基因型。圖6表示了 8種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，這八種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)被用于推斷系譜并完成基因組BRCAl區(qū)域的單倍體分析。BRCAl基因中發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)包括 rsl2516、rs8176318、rs3092995、rs 1060915，和 rs799912。BRCAl 周圍發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)包括 ra9911630，rs9908805，和 rsl7599948。圖7表示了 BRCAl單倍體預(yù)計的發(fā)展。這里顯示了十種最常見的單倍體。每種單倍體都可以通過在其原始的單倍體(GGCCACTA，SEQ ID NO 8)上發(fā)生的變異的積累來解釋。絕大部分直接觀察到的單倍體都是被設(shè)計的，通過一個衍生的核苷酸變化而相互差異。 關(guān)于在方框中的兩個單倍體那個在譜系中先發(fā)生這里使用的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是不確定的。在世界范圍內(nèi)，AGCCATTA(SEQ ID NO 2)單倍體是目前最常觀察到的單倍體。標(biāo)記有“隨處可見”標(biāo)記的兩種單倍體存在于世界所有區(qū)域(GAACAGATA(SEQ ID N0:17)和 GAACGCTC(SEQ ID NO :18))中。該重組單倍體(AGCC-GCTG，SEQ ID NO: 19)只被發(fā)現(xiàn)在新大陸中，新大陸表示美洲的南部、中部和北部。圖8表示了來自全世界46種群體(2，472個體)的BRCAl區(qū)域單倍體數(shù)據(jù)。圖9表示了 7個癌癥群體和1個耶魯對照組(384個體)的BRCAl區(qū)域單倍體數(shù)據(jù)。群體大小對照組29個；乳腺/卵巢17 ；子宮55 ；卵巢,11 ；ER/PR+ 44 ；HER2+ 47 ； MP 39 ；三重陰性(TN) :76ο圖10表示了 BRCAl的種族分類。。圖11通過編碼區(qū)域突變狀態(tài)表示了 BRCAl單倍體數(shù)據(jù)。對110位病人進(jìn)行BRCAl 測試，并進(jìn)行單倍體分析。圖12是一種示意圖顯示了三重陰性(TN)和耶魯對照物的BRCAl區(qū)域單倍體出現(xiàn)率，通過種族數(shù)據(jù)相區(qū)別。圖13是一種示意圖顯示了通過種族和年齡相區(qū)別的三重陰性(TN)乳腺癌組中 BRCAl區(qū)域單倍體出現(xiàn)率。圖14是一種圖表描述了在每個被選擇的群體中，該衍生的等位基因在每個基因型單核苷酸多態(tài)性(SNP) (rsl2516等位基因A、rs8176318等位基因A、和rs30^995等位基因G)處的出現(xiàn)率檢測388位個體中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)歐洲籍美國人和非洲籍美國人對照物，和乳腺癌群體從左至右表示為三重陰性(TN)、HER2+、和ER+/PR+。圖15是一種圖表描述了通過診斷年齡確定的乳腺癌病人之間BRCAl罕見單倍體的出現(xiàn)率。使用罕見的BRCAl單倍體出現(xiàn)率評價所有已知診斷年齡的乳腺癌患者。在診斷時將乳腺癌病人分組，分為小于或者等于52歲或者大于52歲兩組。顯示有5種單倍體在對照物中罕見但是在乳腺癌患者中常見。圖16A是一種圖表描述了通過年齡診斷確定的乳腺癌病人之間BRCAl罕見單倍體的出現(xiàn)率。評價乳腺癌病人，從而得到在整個對照物群體中很少發(fā)現(xiàn)但是在乳腺癌病人中常見的單倍體。沿著Y軸顯示五種罕見的單倍體的出現(xiàn)率圖16B是一種示意圖描述了通過種族確定的乳腺癌之間BRCAl罕見單倍體的出現(xiàn)率。評價歐洲籍美國人和非洲籍美國人的乳腺癌患者的單倍體出現(xiàn)率。歐洲籍美國人和非洲籍美國人作為對照被引入。顯示了九種共有單倍體。顯示了5種其他的在對照物中罕見但是在乳腺癌患者中常見的單倍體(這些罕見的單倍體被編號，用型號標(biāo)記，并加方框)。 其他的非零單倍體出現(xiàn)率估計值被結(jié)合到其他種類中。以粗體表示三個3'未翻譯的區(qū)域 (3' UTR)多態(tài)性(在8個核苷酸位點中占位點2、3和4，假設(shè)位置1是最左邊的核苷酸， 位置8是最右邊的核苷酸)，用下劃線表示了 3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)內(nèi)衍生的等位基因。圖17A是一種圖表通過分類描述了乳腺癌病人之間BRCAl罕見單倍體的出現(xiàn)率。 通過亞類對乳腺癌病人分組，并評價乳腺癌病人，從而得到在整個對照物群體中很少發(fā)現(xiàn)但是在乳腺癌病人中常見的單倍體。沿著Y軸顯示五種罕見的單倍體的出現(xiàn)率圖17B是一種圖表通過分類和種族劃分描述了乳腺癌病人之間罕見單倍體的出現(xiàn)率。依據(jù)乳腺瘤亞類，歐洲籍和非洲籍美國人乳腺癌病人進(jìn)一步地被分組，并評價其罕見單倍體出現(xiàn)率。歐洲籍美國人和非洲籍美國人作為對照被引入。顯示有5種單倍體在對照物中罕見但是在乳腺癌患者中常見。圖18A-B是一對圖表，描述了三重陰性(TN)乳腺癌細(xì)胞(顯示了 MDA MB231細(xì)胞)轉(zhuǎn)染之后熒光素酶報道基因的轉(zhuǎn)錄阻遏作用，所述三重陰性(TN)乳腺癌細(xì)胞或者帶有與熒光霉素報道基因融合的野生型的(WT，rs 1060915G)或者帶有與熒光霉素報道基因融合的突變的BRCAl mRNA (包含rel060915A變體等位基因)BRCA1基因元素。向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染入包含WT或者變體BRCAlmRNA元素的熒光素酶報道基因(25納克)。轉(zhuǎn)染二十四小時后， 裂解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并檢驗其雙重?zé)晒馑孛富钚?。變體等位基因(A)被規(guī)范化為原始的等位基因(G)。通過studentd-tailed t-測驗決定統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)果表明在所有細(xì)胞系(9 種被試驗的細(xì)胞系)中WT和該變體BRCAl元素之間的熒光素酶活性存在1. 85倍的變化。 因此，rsl060915a是BRCAl基因內(nèi)的一種調(diào)節(jié)元素。當(dāng)存在rs 1060915時，miRNAs也許不會有效的結(jié)合(以相同的強(qiáng)度或者松緊度)BRCAl，或者不同的miRNAs與BRCAl結(jié)合，從而改變翻譯的調(diào)節(jié)作用。圖19是一種示意圖，顯示了靶向BRCAl基因內(nèi)rs 1060915周圍位點的miRNAs。預(yù)計四種候選miRNAs能夠與原始rsl060915等位基因或者變體rs 1060915等位基因結(jié)合， 但是不與作為選擇的單核苷酸多態(tài)性(SNP)等位基因結(jié)合。許多其他的miRNA預(yù)計能夠結(jié)合，產(chǎn)生較少的劇烈的相互作用或者變化。BRCAlrs 1060915，位置61-945‘ -AACAGCUACCC UUCCAUCAUAA⑶GACUCUUCUG-3‘ (SEQ ID NO28). Hsa-miR-7,5‘ -UGGAAGACUA⑶GAUUUUGUU GU-S' (SEQ ID NO 29). BRCAlrs 1060915，位置 79-1055‘ -AUAA⑶GACUCCUCUGCCCUUGAGG AC-S' (SEQ ID NO 30). Hsa-miR-129-5P,5' -CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-S‘ (SEQ ID NO
31).BRCAlrsl060915，位置 45-935' -UGGGAGCCAGCCUUCUAACAGCUACCCUUCCAUCAUAA⑶GACUCUUCU-S' (SEQ ID NO
32).Hsa-miR-185,5‘ -UGGAGAGAAAGGCA⑶UCCUGA-S‘ (SEQ ID NO 33).BRCAlrs 1060915，位置 44-965' -AUGGGAGCCAGCCUUCUAACAGCUACCCUUCCAUCAUAA⑶GACUCUUCUGCC-3' (SEQ ID NO 34). Hsa-miR-298，5‘ -AGCAGAAGCAGGGAGGUUCUCCCA-S ‘ (SEQ ID NO 35).圖20A是一種圖表，描述了與沒有罕見單倍體的癌癥病人相比，miR-7在BRCAl罕見單倍體腫瘤中顯著高水平的表達(dá)(P = 0. 04)?？梢灶A(yù)計的是，miR-7表達(dá)與單倍體有關(guān)而不是與乳腺癌的亞類有關(guān)。圖20B是一種圖表，描述了三重陰性(TN)乳腺癌病人中作為miRNAs函數(shù)的miRNA 表達(dá)的出現(xiàn)率。MiR-7、miR48、和miR-342在BRCAl腫瘤中高水平表達(dá)。例如，miR_7在三重陰性(TN)乳腺癌腫瘤中高水平表達(dá)。盡管沒有對其他乳腺癌亞類進(jìn)行試驗，但是可以預(yù)計，其他存在罕見BRCAl單倍體是亞類也會顯示高水平的miR-7表達(dá)作用。圖21是一種圖表，描述了 miR-7與野生型(WT)BRCAl (AA)和包含rs 1060915單核苷酸多態(tài)性(SNP)的BRCAl (GG)的結(jié)合效果。當(dāng)存在rsl060915單核苷酸多態(tài)性(SNP) 的情況下，MiR-7結(jié)合被改變。使用原始序列或者變體序列(包含rsl060915單核苷酸多態(tài)性(SNP) m BRCA1)轉(zhuǎn)染的HCC 1937+/+細(xì)胞(0. 5nM)。MiR_7，而不是其不規(guī)則的對照物與野生型(WT)BRCAl序列結(jié)合，那就是說miR-7特異性的改變BRCA表達(dá)。值得注意的是， 通過此模型中較高的熒光素酶表達(dá)顯示了所述改變的表達(dá)。可以預(yù)計的是miR-7和不規(guī)則對照物(scrambled control)都不能改變變體BRCAl的表達(dá)，這是因為不能預(yù)計其中存在的帶有變體等位基因的結(jié)合位點(所述變體等位基因破壞所述以其他的方式存在于野生型(WT)BRCAl中的miR-7結(jié)合位點，并假定其保護(hù)BRCAl并且使信使核糖核酸或者蛋白質(zhì)以較高的水平表達(dá))。
具體實施例方式乳腺癌是最常被診斷出的癌癥，并且目前是女性主要癌癥死亡原因之一。臨床分類和分子分類法成功的將乳腺癌并入亞類中并且在具有預(yù)后顯著性的種類中顯示獨特的基因表達(dá)。在本研究中出現(xiàn)的所有種類之間，種類分為雌激素受體(ER)陽性或者孕激素受體(PR)陽性、HER2接受基因-擴(kuò)增腫瘤、和三重陰性([TN]雌激素受體(ER)/孕激素受體 (PR)/HER2-腫瘤)。所述雌激素受體(ER)/孕激素受體(PR) +和HER2+腫瘤的結(jié)合是最常見 (80%)的乳腺癌，基本形態(tài)的腫瘤或者三重陰性(TN)腫瘤占乳腺癌的大約15-20% (Irvin WJ, Jr. and Carey LA. Eur J Cancer 2008 Q008 年歐洲癌癥雜志)；44 (18) :2799-805))。 三重陰性(TN)表現(xiàn)型代表了一種侵害性強(qiáng)的且人們認(rèn)知較少的癌癥亞類，這類癌癥在較為年輕的女性和非洲籍美國女性中最為常見。編碼BRCAl的序列突變是公知的乳腺癌風(fēng)險因子，但是，這些突變占每年所有乳腺癌病例的5%。總的來講，由BRCAl突變引起的乳腺腫瘤是最為常見的三重陰性(TN) (57% ) (Atchley DP, et al. J Clin Oncol 2008 ；26 (26) :4282-8)或者雌激素受體(ER) + 乳腺癌(34% ) (Tung N, et al. Breast Cancer Res ；12(1) :R12.)，和很少的 HER2+乳腺癌(大約 3% ) (Lakhani SR, et al. J Clin 0ncol2002 ；20 (9) :2310-8.)。由于 BRCAl 突變是很少見的，三重陰性(TN)腫瘤通常以較低的BRCAl表達(dá)為特征(Turner N, Tutt A, Ashworth A. Nature reviews 2004 ；4(10) :814-9)。BRCAl 突變只占三重陰性(TN)腫瘤的 10-20% (Young SR et al. BMC cancer2009 ；9 :86 ；Malone KE, et al. Cancer research 2006 ；66 (16) :8297-308 ；Nanda R, et al. JAMA 2005 ；294 (15) :1925-33)。這些結(jié)果說明， 可能存在其他的與BRCAl錯表達(dá)有關(guān)遺傳因素，所述BRCAl錯表達(dá)使個體傾向于發(fā)生乳腺癌。單倍體是基因或者DNA片段內(nèi)部幾個相互之間處于連接不平衡(LD)狀態(tài)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的模型，并且因此可以作為一種遺傳單位。當(dāng)單倍體作為群體內(nèi)所有可測量的等位基因或者不可測量的等位基因標(biāo)記物時，對所關(guān)心的區(qū)域的單倍體進(jìn)行研究可以縮窄搜索作為起因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的范圍。上述關(guān)于BRCAl單倍體與乳腺癌之間的關(guān)系的研究已經(jīng)得到了相互矛盾的結(jié)果。Cox等識別了五種共有單倍體(> 5% )， 這些單倍體可以通過四種標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)預(yù)測。對這些單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)進(jìn)行檢測顯示，在護(hù)士健康研究中，這些單倍體中的一個預(yù)報白人女性中偶發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險增加了 20% (Cox DG, et al. Breast Cancer Res 2005 ；7 (2) :R171_5)。 在單倍體、陽性家族史和乳腺癌患病風(fēng)險之間存在顯著的相互作用(/》= 0.0 (Cox DG, et al. Breast Cancer Res (乳腺癌研究)2005 ;7 O) :R171_5)。相反，F(xiàn)reedman 等人檢測了多種族群組調(diào)查中的一個群組中BRCAl位點的共有變化。該組中沒有顯示出BRCAl上的共有變異會影響偶發(fā)性乳腺癌的患病風(fēng)險(Freedman ML, et al. Cancer research 2005 ； 65(16) :7516-22)。這些單倍體研究主要針對編碼BRCAl的序列和BRCAl內(nèi)部區(qū)域中單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的變化(Dunning AM, et al. Human molecular genetics 1997 ；6 (2) 285-9 ；Bau DT, et al. Cancer research2004 ；64 (14) :5013-9)。MiRNAs是一類具有22個核苷酸的非編碼RNA，這種RNA是進(jìn)化上保守的，并且事實上在所有癌癥中都被異常表達(dá)，在所有癌癥中，這種RNA發(fā)揮一種新型的致癌基因或者腫瘤抑制子的作用。miRNAs結(jié)合3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)中信使核糖核酸(mRNA)的能力對于調(diào)節(jié)mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)是至關(guān)重要的，這種結(jié)合可以收到單核苷酸多態(tài)性的影響。目前的數(shù)據(jù)表明，在癌癥基因3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)中的變異是癌癥患病風(fēng)險有力的遺傳標(biāo)記。(Chin LJ, et al. Cancer research (癌癥研究)2008 ;68 :8535-40; Landi D, et al.Carcinogenesis 2008 ；29 (3) :579-84 ；Pongsavee M, et al. Genetic testing and molecular biomarkers (基因檢測和分子生物標(biāo)記物)2009 ； 13 (3) :307-17).目前已經(jīng)對BRCAl的3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)進(jìn)行研究，研究其中miRNA-結(jié)合位點的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，在泰國女性中，rs 12516和rs8176318上衍生的(和較不常見的)等位基因顯示與家族遺傳性的乳腺癌癥和卵巢癌癥具有正向相關(guān)性。該研究發(fā)現(xiàn)，在兩個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點上衍生的等位基因(A)的同型接合性被發(fā)現(xiàn)存在于癌癥病人中，且其在癌癥病人中的出現(xiàn)率是在未感染的泰國人中觀察到的出現(xiàn)率的三倍， 因此是一種顯著的癌癥相關(guān)因素(P = 0. 007)。功能分析顯示當(dāng)在相同的染色體上存在時， 在兩個位點都具有衍生的等位基因的BRCAl具有降低的功能活性，換言之，在rs8176318 處具有衍生的等位基因的BRCAl可以觀察到最大的降低(Pongsavee M，et al. Genetic testing and molecular biomarkers (基因測定和分子生物標(biāo)記物)2009 ;13 (3) :307-17). 該研究還發(fā)現(xiàn)3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)變體與已知的BRCAl突變無關(guān)。另外，在1998 年的研究報道了 BRCAl 3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)中第三單核苷酸多態(tài)性(SNP)上的等位基因，rs3092995，在非洲籍美國女性中與增加的乳腺癌患病風(fēng)險有關(guān)。與非洲籍美國人對照相比，一種罕見的衍生的G等位基因在非洲籍美國人乳腺癌病例中更為常見。在非洲籍美國女性中，乳腺癌年齡調(diào)節(jié)的OR和G等位基因是3. 5(95% Cl，1.2-10) (Newman B, et al. JAMA 1998 ；279 (12) :915-21).本發(fā)明部分的基于對單倍體的研究的，或者本發(fā)明是以對單倍體的研究為條件的，所述單倍體包括功能性的3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)變體，并且能夠更好的識別與乳腺癌患病風(fēng)險有關(guān)的BRCAl單倍體。此外，由于不同乳腺癌亞類的BRCAl功能障礙是變化的，根據(jù)不同的乳腺癌亞類對這些單倍體進(jìn)行評價。因此，識別乳腺癌患者中的3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，其中之一是個體顯著的。隨后，對這些變體和 BRCA13'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)周圍的五個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進(jìn)行單倍體分析，從而確定單倍體與乳腺癌之間的關(guān)系。這一研究進(jìn)一步確定了乳腺癌患者中共有的五種單倍體，但這五種單倍體在非癌癥群體中非常少見。這種罕見的BRCAl單倍體代表了與乳腺癌患病風(fēng)險有關(guān)的BRCAl功能障礙的一種新的遺傳標(biāo)記。癌癥是一種多層面的疾病，有不受控制的細(xì)胞增殖和能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞形成的受損傷細(xì)胞的殘留引起。細(xì)胞具有一系列防護(hù)措施，確保細(xì)胞分裂、分化和死亡發(fā)生在適當(dāng)?shù)臅r候。許多細(xì)胞因子能夠開通或者關(guān)閉調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的基因(hquela-Kerscher， A. &Slack,F. J. Nat Rev Cancer，2006，6 :259-69).選擇對這些腫瘤抑制基因有害物和致癌基因，從而患上癌癥。首先轉(zhuǎn)錄腫瘤抑制基因和致癌基因，然后將其翻譯為蛋白并表達(dá)其作用。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，那些小的，非編碼蛋白質(zhì)的RNA分子(又叫做微RNA(miRNAs))，既可以起到腫瘤抑制子的作用也可以起到致癌基因的作用。(Medina，P. P. and Slack, FJ. Cell Cycle 2008.7,2485-92).在人類疾病中，已經(jīng)顯示miRNAs在癌癥中被異常表達(dá)或者發(fā)生突變，這說明miRNAs是一類新型的致癌基因或者腫瘤抑制子基因，更為準(zhǔn)確的，被認(rèn)為是 oncomirs(Iorio, Μ. V.et al. Cancer Res 2005.65,7065-70).MiRNAs是進(jìn)化上保守的、短的、非編碼蛋白質(zhì)、單鏈RNA，其代表了一類新型的后轉(zhuǎn)錄基因調(diào)節(jié)子。研究顯示在腫瘤和正常組織之間的miRNA表達(dá)存在差異(Medina， P. P. and Slack, FJ. Cell Cycle (細(xì)胞循環(huán))2008. 7，2485-92)，并且事實上，在所有研究的癌癥亞類中 miRNAs 都處于異常水平(Esquela-Kerscher，A. &Slack，F(xiàn)J. Nat Rev Cancer 2006. 6,259-69)。MiRNAs與其靶向基因的3'未翻譯區(qū)域(UTRs)相結(jié)合，并且分別調(diào)節(jié)許許多多不同的靶向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這意味著miRNAs可以調(diào)節(jié)人類基因組中高達(dá)30%的編碼蛋白質(zhì)的基因(Chen，K.et al. Carcinogenesis2008. 29,1306-11).因此，性能不良的 miRNA 的作用可能是多效的，并且，其異常表達(dá)可以潛在的使細(xì)胞的動態(tài)平衡失衡，促進(jìn)疾病發(fā)生，包括促進(jìn)癌癥發(fā)生。 miRNA結(jié)合信使核糖核酸(mRNA)的能力對于調(diào)節(jié)mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)是至關(guān)重要的。然而，這種結(jié)合作用可以被存在于miRNA目標(biāo)地區(qū)的單一核苷酸多形性(SNP)影響，所述存在于miRNA目標(biāo)地區(qū)的單一核苷酸多形性(SNP)會消除存在的結(jié)合位點或者創(chuàng)造錯誤的結(jié)合位點(Chen，K. et al. Carcinogenesis 2008. 29，1306-11). miRNA靴向位點單一核苷酸多形性(SNP)在疾病中的作用，包括在癌癥中的作用剛剛開始被定義。MiRNAsMiRNAs是一大類小的非編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，這種RNA分子具有大約22個核苷酸長度，在后轉(zhuǎn)錄基因調(diào)節(jié)過程中通過與編碼蛋白質(zhì)的基因的mRNA配對發(fā)揮作用。最近， 已經(jīng)證明miRNAs在人類癌癥定位方面發(fā)揮作用，證據(jù)是，miRNAs能夠調(diào)節(jié)已知對存活途徑至關(guān)重要的蛋白質(zhì)(Esquela-Kerscher，A. &Slack，F(xiàn)J. Nat Rev Cancer 2006，6 :259-69 ; Ambros, V. Cell 2001,107:823-6 ；Slack, FJ.禾口 Weidhaas，J. B. Future Oncol 2006,2 73-82).由于miRNAs控制許多下游的靶點，因此它們很有可能作為治療癌癥的新的靶點。圖1使miRNAs的基本合成和成熟過程變得形象化 squela_Kerscher，A. and Slack, FJ. Nat Rev Cancer 2006. 6,259-69).簡單地說，使用 RNA 聚合酶 II 在細(xì)胞核中，從miRNA基因中轉(zhuǎn)錄得到miRNAs，從而形成長的初始RNA(前-miRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將所得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行封端并聚腺甘酸化(Esquela-Kerscher, A. and Slack, FJ. Nat Rev Cancer 2006. 6,259-69 ；Lee, Y. et al. Embo J 2002. 21，4663-70).這些前-miRNAs 可以是一些長度為上千個堿基，并且在細(xì)胞核中使用RNA酶III酶Drosha及其輔助因子Pasha進(jìn)行，從而釋放出大約70個核苷酸長度，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(前-miRNA)。使用輸出蛋白5使前miRNAs以Ran-三磷酸鳥嘌呤核苷(GTP)-依賴性方式從細(xì)胞核中輸出到細(xì)胞質(zhì)中，然后，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer，一種核糖核酸酶III酶處理。這會釋放一種長度大約為22個堿基核苷酸、雙鏈miRNA =HiiRNA復(fù)式結(jié)構(gòu)(miRNA duplex)，這種miRNA復(fù)式結(jié)構(gòu)被整合入一種 RNA-誘導(dǎo)的靜止復(fù)合物(miRISC)中。在這一點上，所述復(fù)合物現(xiàn)在能夠調(diào)節(jié)其靶向基因。圖1描述了根據(jù)miRNA和它的靶點之間的互補(bǔ)程度，基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用如何以兩種途徑之一進(jìn)行。結(jié)合mRNA靶分子并攜帶有不完成的互補(bǔ)區(qū)的MiRNAs靶向蛋白質(zhì)翻譯水平上的基因表達(dá)。使用這種機(jī)制的miRNAs的互補(bǔ)位點通常出現(xiàn)在靶分子mRNA基因的3'未翻譯區(qū)域(UTR)。能夠以理想的互補(bǔ)性結(jié)合其mRNA靶分子的MiRNAs可以誘導(dǎo)靶分子-mRNA 裂解。使用這種機(jī)制的MiRNAs結(jié)合miRNA互補(bǔ)位點，所述miRNA互補(bǔ)位點通常發(fā)現(xiàn)在信使核糖核酸靶分子的編碼序列或者開放閱讀框(ORF)上。在哺乳動物中，miRNAs是基因調(diào)節(jié)因子，基本上在被研究的所有癌癥亞類中都可以觀察到不正常水平的這種基因調(diào)節(jié)因子。合適的能夠結(jié)合其靶分子基因的miRNA對于調(diào)節(jié)信使核糖核酸水平和蛋白質(zhì)表達(dá)至關(guān)重要。然而，成功的結(jié)合作用可以被存在于miRNA 結(jié)合部位的單一核苷酸多形性(SNP)影響，所述存在于miRNA目標(biāo)地區(qū)的單一核苷酸多形性(SNP)會廢除存在的結(jié)合位點或者創(chuàng)造錯誤的結(jié)合位點。因此，在miRNA結(jié)合部位的多態(tài)性對基因和蛋白質(zhì)表達(dá)具有大范圍的作用，并代表了另一種遺傳變異性的來源，所述遺傳變異性可以影響人類疾病，包括癌癥的患病風(fēng)險。miRNA結(jié)合部位的單一核苷酸多形性(SNP)在疾病中的作用剛剛開始被定義，并且在乳腺癌基因中識別單一核苷酸多形性 (SNP)能夠修飾miRNAs的結(jié)合能力，從而起到靶分子基因調(diào)節(jié)作用并影響乳腺癌癥和/或卵巢癌癥的患病風(fēng)險。在乳腺癌基因中識別單一核苷酸多形性(SNP)可以幫助識別一種新型途徑，這種途徑可以確認(rèn)具有增加的乳腺癌癥和/或卵巢癌癥患病風(fēng)險的病人。MiRNAs不但靶向靶分子信使核糖核酸和基因的非編碼區(qū)域，而且靶向編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域。miRNA的機(jī)制在非編碼區(qū)和編碼區(qū)之間的靶分子識別是不同的。當(dāng)miRNA在編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域識別出一種結(jié)合位點時，與miRNA識別結(jié)果和當(dāng)在非編碼區(qū)域的結(jié)合時的翻譯靜止作用相比，miRNA結(jié)合的翻譯靜止作用會減少。此外，與位于非編碼區(qū)域的結(jié)合位點點火區(qū)相比，位于編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)部的miRNA結(jié)合位點點火區(qū)可能需要更大量的與 miRNAs結(jié)合的核苷酸。位于編碼區(qū)域內(nèi)部的miRNA結(jié)合位點也可能發(fā)生單一核苷酸多形性 (SNP)，并且因此，影響一種或者一種以上miRNA調(diào)節(jié)靶分子基因表達(dá)的能力。可以預(yù)計的是，在編碼區(qū)域中的單一核苷酸多形性(SNP)和影響miRNA活性的單一核苷酸多形性(SNP)在對靶分子蛋白質(zhì)表達(dá)的作用方面具有定量上或者定性上相似的作用。做為選擇，在編碼區(qū)域中的單一核苷酸多形性(SNP)和影響miRNA活性的單一核苷酸多形性(SNP)在對靶分子蛋白質(zhì)表達(dá)的作用方面具有定量上或者定性上不同的作用。進(jìn)一步可以預(yù)計的是，當(dāng)非編碼區(qū)和編碼區(qū)同時存在單一核苷酸多形性(SNP)時，這些單一核苷酸多形性(SNP)都能影響一種或者一種以上miRNAs與其各自結(jié)合位點的結(jié)合，這些單獨的單一核苷酸多形性(SNP)協(xié)同發(fā)揮作用，影響靶分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者蛋白質(zhì)的表達(dá)。MiRNA的活性進(jìn)一步地被細(xì)胞周期影響。在細(xì)胞周期臨界點，某些miRNAs已經(jīng)顯示能夠激活翻譯作用或者誘導(dǎo)靶分子信使RNA的上調(diào)節(jié)(Vasudevan S. et al. Science, 2007. 318(5858) :1931-4).因此，miRNAs的活性在例如細(xì)胞周期的生長階段(Gi和G2)和合成階段(Si)的翻譯阻遏作用以及細(xì)胞周期間歇期(Go)的翻譯活化作用之間來回震蕩。 盡管不希望被任何理論限制，癌細(xì)胞進(jìn)入并在不恰當(dāng)?shù)臅r間或者以不恰當(dāng)?shù)某霈F(xiàn)率完成細(xì)胞周期。此外，癌細(xì)胞通常在不保護(hù)功能或者足夠水平的DNA修理蛋白質(zhì)(包括BRCA1)的情況下完成細(xì)胞周期。由于健康的、非癌性細(xì)胞可以處于Go階段，在此階段，與BRCAl結(jié)合的miRNA上調(diào)節(jié)腫瘤抑制板蛋白質(zhì)的表達(dá)，癌細(xì)胞最常處于生長期，在此期間，miRNA轉(zhuǎn)錄抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明預(yù)計，在影響至少一個miRNA結(jié)合活性的非編碼區(qū)域和/或編碼區(qū)域中一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在能夠阻止BRCAl的上調(diào)節(jié)作用，例如，這可以誘導(dǎo)健康細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，在此過程中，其他的miRNAs進(jìn)一步抑制BRCAl和/或其他腫瘤抑制基因的表達(dá)。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)單一核苷酸多態(tài)性(單核苷酸多態(tài)性(SNP))是指同一種族的各個成員之間(或者一種個體的成對的染色體之間)基因組(或者其他共有序列)具有不同的單一核苷酸時存在的DNA序列變化。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可以發(fā)生在基因編碼序列、基因非編碼區(qū)域或者發(fā)生在基因之間的基因間區(qū)域。由于遺傳密碼的退化性，在編碼序列內(nèi)部的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)不一定改變所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。當(dāng)一種單核苷酸多態(tài)性(SNP) 突變導(dǎo)致的一種新型的DNA序列編碼相同的多肽序列時，這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)突變被命名為同義(也被稱為靜態(tài)突變)。相反地，當(dāng)一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)突變導(dǎo)致的一種新型的DNA序列編碼不同的多肽序列時，這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)突變被命名為非同義。不在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)也可能造成基因剪接、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或者非編碼RNA序列的結(jié)果。對于本發(fā)明的方法，存在于非編碼RNA區(qū)域內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是非常重要的，這是由于這些區(qū)域包括調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列與miRNA分子互補(bǔ)并且是與其他調(diào)節(jié)因子發(fā)生相互作用所必須的。存在于基因組序列內(nèi)部的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)被轉(zhuǎn)錄進(jìn)入信使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中進(jìn)行退化作用或者翻譯靜止作用，所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被miRNA分子靶向。存在于基因組序列或者序列的信使RNA 3'未翻譯的區(qū)域(UTR)內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)對于本發(fā)明方法是尤其重要的。BRCAlBRCAl (乳腺癌1，早期發(fā)病階段)是一種人類腫瘤抑制基因。盡管BRCAl最與乳腺癌相關(guān)，但是BRCAl基因存在于人體的所有細(xì)胞上。作為一種腫瘤抑制基因，BRCAl負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖作用并且防止通過修復(fù)損傷DNA或者啟動由于DNA受損嚴(yán)重而不可以被修復(fù)的細(xì)胞的細(xì)胞自殺程序來引入突變。如果腫瘤抑制基因，例如BRCAl，被突變或者被誤調(diào)節(jié)了，然后其功能受到抑制，擇該細(xì)胞可以使用不完整的復(fù)制DNA進(jìn)行增殖。此外，該細(xì)胞非常頻繁的進(jìn)入細(xì)胞周期。在這種環(huán)境中，形成腫瘤。與良性腫瘤不同，癌癥性腫瘤表示不受控制的生長、入侵和破壞鄰近組織、通過淋巴或者血液轉(zhuǎn)移到身體其他位置。
16
具體地說，BRCAl通過同源重組修復(fù)DNA中的雙鏈缺口，其中，同源重組是指一種方法，通過這一方法同源完整的核苷酸序列在兩個相似或者相同的DNA鏈之間進(jìn)行交換， 例如，在來自姐妹染色單體的序列、來自同源染色體之間或者來自相同染色體(根據(jù)細(xì)胞周期的階段)作為模板的序列之間交換。但是，這種BRCAl蛋白質(zhì)不能單獨發(fā)揮作用。BRCAl 與其他腫瘤抑制基因蛋白質(zhì)、DNA損傷傳感蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白相結(jié)合形成一種大的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物被叫做BRCAl-相關(guān)基因組監(jiān)測復(fù)合物(BASC)。盡管所述BRCAl蛋白質(zhì)可以形成一種復(fù)合物實施其細(xì)胞功能，在BRCAl基因中的突變足夠解除對細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞增殖過程的調(diào)節(jié)作用。重要的是，本發(fā)明提供了單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、單倍體、用于識別能夠預(yù)防或者抑制一種或者一種以上miRNAs與BRCAl基因編碼或者非編碼區(qū)域結(jié)合功能的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的方法、和通過檢測這里描述的至少一種多態(tài)性來預(yù)測增加的發(fā)展成為癌癥的患病風(fēng)險的方法。本發(fā)明提供了用于識別并表征BRCAl內(nèi)部單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的方法。盡管不希望被局限于一定的理論，但是可以預(yù)計，這里公開的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和使用本發(fā)明公開的方法識別的在miRNA結(jié)合位點內(nèi)存在的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、或者使用本發(fā)明公開的方法識別的能夠相反影響miRNA活性的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)會產(chǎn)生“較緊 WliRNA相互作用或者一種或者一種以上miRNA與BRCAl的結(jié)合作用，或者，有時，產(chǎn)生“較松的”miRNA相互作用或者這種相互作用的減少。在3'未翻譯的區(qū)域(3' UTR)中的這些 miRNAs增加的結(jié)合效果或者活性導(dǎo)致減少的BRCAl轉(zhuǎn)錄作用和在該細(xì)胞中整體低水平的 BRCAl蛋白質(zhì)。外顯子內(nèi)可能的結(jié)合損失還可能導(dǎo)致較低水平的BRCA1。因此，在這里識別的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)抑制BRCAl腫瘤抑制基因，從而在不檢測BRCAl的情況下允許細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞增殖基質(zhì)進(jìn)行。如上所述，未調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖作用會導(dǎo)致增加的發(fā)展成癌癥的風(fēng)險。下面提供了示范性的BRCAl基因和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。所有的GenBank記錄數(shù)據(jù)(通過 NCBI登記號提供)在此通過引證并入本文。人類BRCAl轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變體1被NCBI登記號NM_007294和SEQ ID NO 11的核苷酸
序列編碼。
權(quán)利要求
1.一種BRCAl單倍體，這種BRCAl單倍體包含至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中， 這種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的存在增加了患者發(fā)展成為胸部癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單倍體，其中，每個單核苷酸多態(tài)性(SNP)改變一個或者一個以上miRNA的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單倍體，其中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)位于BRCAl基因的非編碼區(qū)域或者編碼區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單倍體，其中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)位于BRCAl基因的非編碼區(qū)域或者編碼區(qū)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者4所述的單倍體，其中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由 ra9911630、 rsl2516, rs8176318, rs3092995, rsl060915, rs799912, rs9908805,和 rsl7599948所組成的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單倍體，其中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由rsl2516、 rs8176318、rs3092995、rsl060915 和 rs799912 所組成的組中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單倍體，其中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)是rs8176318或者 rsl060915o
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單倍體，其中所述單倍體包含rs8176318和rsl060915。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單倍體，其中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在增加患者發(fā)展成為三重陰性(TN)乳腺癌的風(fēng)險。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單倍體，其中所述的單倍體包括GGACGCTA(SEQID NO 6)、GGCCGCTA (SEQ ID NO :9)、GGCCGCTG (SEQ ID NO :10)、GGACGCTG (SEQ ID NO :21)，或者 GAACGTTG(SEQ ID NO :26)所示的核苷酸序列。
11.一種BRCAl多態(tài)特性，這種多態(tài)特性表明一種增加的發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險，所述特性包括確定存在或者不存在以下單核苷酸多態(tài)性(SNPs) rs8176318和 rsl060915，其中，這些單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的存在表明具有增加的發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特性，其中所述特性進(jìn)一步包括確定選自由rsl2516、 rs3092995和rs799912所組成的組的至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特性，其中所述特性進(jìn)一步包括確定選自由rs9911630、 rs9908805和rsl7599948所組成的組的至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特性、其中rs8176318和rs1060915改變至少一個微 RNA (miRNA)的結(jié)合效果。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或者13所述的特性，其中rsl2516、rs3092995、rs799912、 rs9911630、rs9908805或者rs 17599948改變至少一個miRNA的結(jié)合效果。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特性，其中所述至少一個miRNA是miR-7。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特性，其中，該特性進(jìn)一步包含識別BRCAl基因中存在或者不存在一個種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述BRCAl基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)改變一種或者一種以上微RNA的結(jié)合效果。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的特性，其中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)存在于非編碼區(qū)域或者編碼區(qū)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的特性，其中非編碼區(qū)域是3'未翻譯的區(qū)域(UTR)、一種基因內(nèi)區(qū)、一種基因間的區(qū)域、一種順式調(diào)節(jié)元素、啟動子元素、增強(qiáng)子元素、或者5'未翻譯的區(qū)域(UTR)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的特性，其中，所述編碼區(qū)域是外顯子。
21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特性，其中所述乳腺癌是三倍陰性乳腺癌。
22.—種識別單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)降低BRCAl基因的表達(dá)并且增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的患病風(fēng)險，所述方法包括(a)從待檢測患者處獲得樣品；(b)獲得對照樣品；(C)確定來自該檢測樣品的DNA序列內(nèi)部的至少一個miRNA結(jié)合位點中存在或者不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)；并且(d)與該miRNA對來自對照樣品的相應(yīng)DNA序列的相同miRNA結(jié)合位點的結(jié)合效果相比較，評價至少一個miRNA對至少一個包含所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)的miRNA結(jié)合位點的結(jié)合效果，其中，對照樣品和待檢測樣品之間，如果所述至少一個miRNA與相應(yīng)的結(jié)合位點之間的結(jié)合效果存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化，則說明單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在會抑制miRNA-調(diào)節(jié)的保護(hù)作用或者增加miRNA-調(diào)節(jié)的BRCAl基因表達(dá)的阻遏作用，從而識別同樣能夠增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥風(fēng)險的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。
23.一種識別一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)能夠減少 BRCAl基因的表達(dá)并且增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險，該方法包括(a)從待檢驗患者中獲得樣品；(b)確定來自待檢驗的患者體內(nèi)的DNA序列的至少一個miRNA結(jié)合位點中存在或者不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)；和(c)相對于單核苷酸多態(tài)性(SNP)在一種或者更多種世界人口中的預(yù)期發(fā)病率，評價乳腺癌癥或者卵巢癌癥人口中單核苷酸多態(tài)性(SNP)的發(fā)病率，其中，與一種或者一種以上世界人口相比，腫瘤樣品中所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加，則說明這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)魚發(fā)展成乳腺癌癥或者卵巢癌癥的患病風(fēng)險正向相關(guān)，并且，其中，在至少一個能夠降低BRCAl表達(dá)的miRNA結(jié)合位點內(nèi)存在或者不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)表明，這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在或者不存在能抑制 miRNA調(diào)節(jié)的保護(hù)作用或者增加miRNA調(diào)節(jié)的BRCAl基因表達(dá)阻遏作用，從而識別同樣能夠增加患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥風(fēng)險的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或者23所述的方法，其中，所述待檢測的患者已經(jīng)診斷患有乳腺癌癥或者卵巢癌癥。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，對照樣品是從沒有診斷出患有任何癌癥的患者中獲得的。
26.根據(jù)權(quán)利要求22或者23所述的方法，其中，所述miRNA結(jié)合位點是憑經(jīng)驗確定的、 或者是從數(shù)據(jù)庫中識別的，或者是使用其中所述計算方法來預(yù)計的。
27.根據(jù)權(quán)利要求22或者23所述的方法，其中，存在或者不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)是憑經(jīng)驗確定的、或者是從數(shù)據(jù)庫中識別的，或者是使用一種計算方法來預(yù)計的。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述結(jié)合效果是體外或者體內(nèi)評價的。
29.根據(jù)權(quán)利要求22或者23所述的方法，其中，乳腺癌是偶發(fā)性的或者是遺傳性的。
30.根據(jù)權(quán)利要求22或者23所述的方法，其中，卵巢癌是偶發(fā)性的或者是遺傳性的。
31.一種識別具有發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險的患者的方法，該方法包括，a)從待檢測患者中獲得DNA樣品；和b)確定來自樣品至少一種DNA序列中存在至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的，所述單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自由rs 12516、rs8176318、 rs3092995和rs799912所組成的組中，其中，在至少一種DNA序列中存在至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)會使患者發(fā)展為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險與正?；颊呦啾仍黾?0倍。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，該方法進(jìn)一步包括確定rsl060915存在的步驟， 其中，在至少一種DNA序列中，rsl060915和選自由rsl2516、rs8176318、rs3092995和 rs799912所組成的組中的至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在使患者發(fā)展成為乳腺癌癥或者卵巢癌癥的風(fēng)險與正常患者相比增加100倍。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述正常患者是不攜帶rsl2516、rs8176318、 rs3092995、rs799912 或者 rsl060915 的患者。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，乳腺癌是偶發(fā)性的或者是遺傳性的。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，卵巢癌是偶發(fā)性的或者是遺傳性的。
36.一種識別具有發(fā)展成為三重陰性(TN)乳腺癌的風(fēng)險的患者的方法，該方法包括， a)從待檢測患者中獲得DNA樣品；和b)確定來自樣品至少一種DNA序列中存在rs8176318 或者rs 1060915，其中，與正?；颊呦啾?，在至少一種DNA序列中存在rs8176318或者rs 1060915會增加患者發(fā)展為三重陰性(TN)乳腺癌的風(fēng)險。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，該方法包括確定rs8176318和rs1060915存在的步驟，其中，在至少一個DNA序列中結(jié)合存在rs8176318和rs 1060915進(jìn)一步增加了患者發(fā)展成為三重陰性(TN)乳腺癌的風(fēng)險。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或者37所述的方法，其中，乳腺癌是偶發(fā)性的或者是遺傳性的。
39.根據(jù)權(quán)利要求36或者37所述的方法，其中，卵巢癌是偶發(fā)性的或者是遺傳性的。
40.根據(jù)權(quán)利要求36或者37所述的方法，其中，待檢測主體是非洲籍美國人。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在與乳腺癌癥和卵巢癌癥有關(guān)的基因內(nèi)部識別突變的方法，例如，用于識別單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的方法，所述基因修飾微RNA(miRNAs)的結(jié)合效果。在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法識別一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)能夠通過增加或者減少至少一種miRNA的結(jié)合效果來減低BRCA1基因的表達(dá)。通過在miRNA結(jié)合位點進(jìn)入單核苷酸多態(tài)性(SNPs)產(chǎn)生的miRNA與BRCA1結(jié)合的變化能夠調(diào)節(jié)或者減少BRCA1表達(dá)，并最終導(dǎo)致乳腺或者卵巢癌細(xì)胞未調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖。
文檔編號C12Q1/68GK102575289SQ201080037526
公開日2012年7月11日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者C·佩爾蒂埃, J·B·溫迪哈斯 申請人:耶魯大學(xué)