專利名稱：用于酶促過酸生產(chǎn)的過水解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及過氧羧酸生物合成和原位酶催化領(lǐng)域。具體地講，提供使用酶催化劑制備過氧羧酸的方法，所述酶催化劑包含與來自乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis subsp. Iactis)的乙酰木聚糖酯酶具有同一丨丨生的酶催化劑。
背景技術(shù)：
過氧羧酸組合物可為有效的抗微生物劑。已經(jīng)描述了使用過氧羧酸清潔、滅菌和/或消毒硬質(zhì)表面、織物、肉制品、活植物組織和醫(yī)療器械以殺滅不良微生物生長(zhǎng)的方法(美國(guó)專利公開6，545，047 ;美國(guó)專利公開6，183，807 ;美國(guó)專利公開6，518，307 ;美國(guó)專利公 開申請(qǐng)公布20030026846 ;和美國(guó)專利公開5，683，724)過氧羧酸也已經(jīng)在多種衣物洗滌護(hù)理應(yīng)用中使用，例如它們用作漂白劑(美國(guó)專利公開3，974，082 ;美國(guó)專利公開5，296，161 ；和美國(guó)專利公開5，364，554)。過氧羧酸可通過羧酸烷基酯和過氧化物試劑如過氧化氫(參見OrganicPeroxides, Daniel Swern 編輯，第 I 卷，第 313-516 頁；ffiley Interscience, New York,1971)的化學(xué)反應(yīng)來制備。然而，在輕度堿性至酸性pH(約8至約4)下，所述反應(yīng)進(jìn)行的速度通常不足以產(chǎn)生適合多種商業(yè)消毒和/或漂白應(yīng)用的過氧羧酸濃度。克服過氧羧酸化學(xué)法制備缺點(diǎn)的一種方法是使用具有過水解活性的酶催化齊U。授予DiCosimo等人的美國(guó)專利公開申請(qǐng)11/638，635和美國(guó)專利公開申請(qǐng)公布2008/0176783 ；2008/0176299 ；以及 2009/0005590 公開了結(jié)構(gòu)上歸類為糖酯酶 CE-7 家族的成員的酶(例如先鋒霉素C脫乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[AXE])，它們特征在于將羧酸酯(在合適的過氧來源如過氧化氫的存在下)轉(zhuǎn)化成濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑的過氧羧酸的顯著過水解活性。糖酯酶CE-7家族的一些成員已顯示具有過水解活性，一旦反應(yīng)組分混合，其活性足以在I分鐘內(nèi)從醇、二醇和甘油的乙?；ブ挟a(chǎn)生4000_5000ppm過乙酸，以及在5分鐘至30分鐘內(nèi)產(chǎn)生至多9000ppm過乙酸(DiCosimo等人，美國(guó)專利申請(qǐng)公開2009/0005590)。通常，在包括過量底物，pH約6. 0至約8. 5和合適的溫度范圍內(nèi)的合適含水反應(yīng)條件下，在30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后CE-7過水解酶將產(chǎn)生濃度提高的過酸。通常使用有效量的至少一種緩沖液保持反應(yīng)pH。使用此類條件產(chǎn)生的過氧乙酸量可能超出期望的量或者可能花費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)而不能最終達(dá)到某些應(yīng)用的有效濃度。過氧羧酸(例如過乙酸)的酶促生產(chǎn)通常使用含水反應(yīng)條件進(jìn)行。同樣地，水解反應(yīng)(化學(xué)的和/或酶促的)通常通過水解酯底物和/或水解過氧羧酸產(chǎn)生相應(yīng)的羧酸(例如乙酸)，從而破壞所需的產(chǎn)物。酶促過水解(過氧羧酸或過氧羧酸與相應(yīng)的羧酸水解產(chǎn)物的混合物)的產(chǎn)物可腐蝕某些金屬表面。同樣地，可能期望限制反應(yīng)期間產(chǎn)生的過氧羧酸總量以防止或最小化所得溶液的腐蝕效應(yīng)。例如，需要在I分鐘內(nèi)產(chǎn)生不超過200ppm至IOOOppm過酸的應(yīng)用通常使用產(chǎn)生的過酸最終濃度遠(yuǎn)高于這些限制的反應(yīng)條件。在原位生成用于消毒硬質(zhì)表面的過酸的應(yīng)用中，希望具有快速生成不顯著超過有效消毒劑濃度上限的期望濃度過酸的能力，從而限制或防止表面某些組分的腐蝕。在原位生成用于漂白衣物或織物的過酸的應(yīng)用中，也期望對(duì)生成的高于漂白所需過酸的濃度進(jìn)行類似的限制。同樣地，需要提供快速制備期望的“目標(biāo)”濃度的過氧羧酸的方法，尤其是在過量底物的存在下更是如此。當(dāng)pH下降至低于約6. 0時(shí)，多種CE-7糖酯酶表現(xiàn)出過水解活性的降低或滅活，大多數(shù)CE-7過水解酶在等于或低于pH5. 0時(shí)被滅活。授予DiCosimo等人的美國(guó)專利公開申請(qǐng)12/539，025提出了通過選擇反應(yīng)組分和從 而形成反應(yīng)產(chǎn)物的條件(即過氧羧酸和對(duì)應(yīng)的羧酸水解產(chǎn)物)制備期望“目標(biāo)”濃度的過氧羧酸的方法，所述條件將反應(yīng)混合物的PH降低至其中酶催化劑具有極低或無過水解活性的值。選擇反應(yīng)組分和條件從而在10分鐘或更短時(shí)間內(nèi)將反應(yīng)混合物的PH降至低于6. 0，使得人們能夠控制產(chǎn)生的過氧羧酸濃度。然而，pH小于6.0的產(chǎn)物混合物可能不是一些消毒和/或漂白應(yīng)用所期望的，尤其是當(dāng)接觸反應(yīng)產(chǎn)物的表面易于腐蝕和漂白過度時(shí)更是如此。在此類環(huán)境下，需要控制酶促產(chǎn)生的過氧羧酸的量，所述過氧羧酸不依賴反應(yīng)混合物PH的大幅下降。需解決的問題是提供酶促制備在含水反應(yīng)混合物中的期望濃度的過氧羧酸的方法，所述反應(yīng)混合物不依賴顯著降低的PH或低于6. 0的pH。選擇的反應(yīng)組分和反應(yīng)條件應(yīng)能夠快速產(chǎn)生期望的過氧羧酸，其濃度一旦達(dá)到目標(biāo)濃度不再顯著提高。發(fā)明概述已經(jīng)通過發(fā)現(xiàn)在5分鐘或更短時(shí)間內(nèi)制備期望濃度的過氧羧酸的酶促方法解決了所述問題，所述酸濃度一旦達(dá)到期望濃度基本上不再提高；其中反應(yīng)混合物的PH在反應(yīng)期間保持在6. 0和9. 0之間。所述方法包括使用包含具有過水解活性的酶的酶催化劑，所述酶與來自乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)的乙酰木聚糖酯酶具有至少95%的同一性。本發(fā)明的酶催化劑能夠在5分鐘或更短時(shí)間內(nèi)快速產(chǎn)生具有基本上穩(wěn)定的目標(biāo)濃度的過氧羧酸的產(chǎn)物混合物，甚至在過多底物的存在下和PH6. 0至9. 0的范圍內(nèi)依然如此；所述條件下其他CE-7過水解酶通常在5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后產(chǎn)生濃度顯著提高的過氧羧酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備目標(biāo)濃度的過氧羧酸的方法，包括a)選擇一組反應(yīng)組分,所述反應(yīng)組分包含I)至少一種底物，所述底物選自i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯[XJmR5其中；X =式 R6-C(O)O 的酯基；R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當(dāng)R6 = C2-C7時(shí)，R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個(gè)碳原子各自包含不超過一個(gè)輕基或不超過一個(gè)酯基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；m = I至R5中的碳原子數(shù)目；并且其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
權(quán)利要求
1.制備目標(biāo)濃度的過氧羧酸的方法，包括 (a)選擇一組反應(yīng)組分,所述反應(yīng)組分包含 (I)至少一種底物，所述底物選自 (1)具有以下結(jié)構(gòu)的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當(dāng)R6 = C2-C7時(shí)，R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個(gè)碳原子各自包含不超過一個(gè)輕基或不超過一個(gè)酯基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； Hl = I至&中的碳原子數(shù)目；并且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度； ( )具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
2.權(quán)利要求I的方法，其中在等于或大于混合所述反應(yīng)組分后30分鐘的反應(yīng)時(shí)間，在混合所述反應(yīng)組分后一分鐘產(chǎn)生的過氧羧酸濃度的增加不超過100%。
3.權(quán)利要求I的方法，其中在等于或大于混合所述反應(yīng)組分后五分鐘的反應(yīng)時(shí)間，在混合所述反應(yīng)組分后一分鐘產(chǎn)生的過氧羧酸濃度的增加不超過50%。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在等于或大于混合所述反應(yīng)組分后五分鐘的反應(yīng)時(shí)間，在混合所述反應(yīng)組分后一分鐘產(chǎn)生的過氧羧酸濃度的增加不超過20%。
5.權(quán)利要求I的方法，其中通過所述方法產(chǎn)生的過氧羧酸總量不受所述反應(yīng)混合物中的底物量或過氧量的限制。
6.權(quán)利要求I的方法,其中所述反應(yīng)混合物的pH范圍為約6.5至約8. 5。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述反應(yīng)混合物的pH范圍為約7.O至約8. O。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含至少一種緩沖液。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種緩沖液選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、以及磷酸鈉和磷酸鉀的混合物。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述底物選自甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙?；揪厶牵灰阴；揪厶瞧危沪?D-呋喃核糖-I，2，3，5-四乙酸酯；三-鄰-乙?；?D-半乳醛；三-鄰-乙?；?葡萄烯糖；I，2-乙二醇；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2_ 丁二醇；1，3-丁二醇；2，3_ 丁二醇；1，4_ 丁二醇；1，2_戊二醇；2，5_戊二醇；1，6_戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇的單酯或二酯；丙二醇二乙酸酯；乙二醇二乙酸酯；以及它們的混合物。
11.權(quán)利要求I的方法，其中所述產(chǎn)生的過氧羧酸為過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β -羥基丁酸、或它們的混合物。
12.權(quán)利要求I的方法，其中所述酶催化劑為微生物細(xì)胞、透化的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物、部分純化的酶或純化的酶的形式。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述酶催化劑缺乏過氧化氫酶活性。
14.權(quán)利要求I的方法，還包括以下步驟(c)使表面或無生命的物體與步驟(b)中產(chǎn)生的過氧羧酸接觸，從而將所述表面或所述無生命的物體消毒、脫色、除臭或漂白。
15.權(quán)利要求I的方法，還包括以下步驟(c)使織物與步驟(b)中產(chǎn)生的過氧羧酸接觸，從而所述織物獲得有益效果。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述有益效果選自消毒、漂白、脫色、除臭、以及它們的任何組合。
17.制備目標(biāo)濃度的過氧羧酸的方法，包括 (a)選擇一組反應(yīng)組分,所述反應(yīng)組分包含 (I)至少一種底物，所述底物選自 (i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當(dāng)R6 = C2-C7時(shí)，R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個(gè)碳原子各自包含不超過一個(gè)輕基或不超過一個(gè)酯基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵；Hl = I至&中的碳原子數(shù)目；并且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；(ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
18.權(quán)利要求17的方法，其中在等于或大于混合所述反應(yīng)組分后30分鐘的反應(yīng)時(shí)間，在混合所述反應(yīng)組分后五分鐘產(chǎn)生的過氧羧酸濃度的增加不超過50%。
19.權(quán)利要求18的方法，其中在等于或大于混合所述反應(yīng)組分后30分鐘的反應(yīng)時(shí)間，在混合所述反應(yīng)組分后五分鐘產(chǎn)生的過氧羧酸濃度的增加不超過20%。
20.組合物，包含 (a)—組反應(yīng)組分,所述反應(yīng)組分包含 (I)至少一種底物，所述底物選自 (i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當(dāng)R6 = C2-C7時(shí)，R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個(gè)碳原子各自包含不超過一個(gè)輕基或不超過一個(gè)酯基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； Hl = I至&中的碳原子數(shù)目；并且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度； (ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述酶催化劑包含具有氨基酸序列SEQID N0:4的酶。
22.試劑盒，包括 (a)第一隔室，所述第一隔室包含(1)酶催化劑，所述酶催化劑包含與SEQID NO :4具有至少95%的氨基酸同一性的酶； (2)至少一種底物，所述底物選自 (i)具有以下結(jié)構(gòu)的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當(dāng)R6 = C2-C7時(shí)，R6任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個(gè)碳原子各自包含不超過一個(gè)輕基或不超過一個(gè)酯基；其中R5任選地包含一個(gè)或多個(gè)醚鍵； Hl = I至&中的碳原子數(shù)目；并且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度； (ii)具有以下結(jié)構(gòu)的甘油酯OR1-C-O-CH2-CH-CH2-OR4 OR3 其中R1 = C1-C7直鏈或支鏈烷基，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，并且R3和R4各自為H或R1C(O);和 (iii)選自乙?；瘑翁?、乙?；呛鸵阴；嗵堑囊阴；?；和(3)任選的緩沖液；和(b)第二隔室，所述第二隔室 包含(1)過氧源；(2)過氧化物穩(wěn)定劑；和(3)任選的緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了從羧酸酯中快速制備目標(biāo)濃度的過氧羧酸的方法。更具體地講，羧酸酯在酶催化劑的存在下與過氧源如過氧化氫反應(yīng)，所述酶催化劑包含與來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的具有過水解活性的乙酰木聚糖酯酶具有同一性的酶。多肽為結(jié)構(gòu)上歸類為糖酯酶家族7(CE-7)成員的酶。通過本發(fā)明方法制備的過氧羧酸可用于消毒、漂白和其他衣物洗滌護(hù)理應(yīng)用。本發(fā)明也提供了包含所述反應(yīng)組分的組合物和通過所述方法制備的過氧羧酸。
文檔編號(hào)C12P7/40GK102782143SQ201080054802
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月1日
發(fā)明者J·E·加瓦根, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司