專利名稱：：一種檢測(cè)α－L－巖藻糖苷酶活力的方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于血清α-L-巖藻糖苷酶(AFU)活力的測(cè)定方法及試劑，屬于生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase，AFU)的分類名為α-L-巖藻糖苷巖藻糖水解酶，它催化糖苷鍵水解，參與含有巖藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖脂的分解代謝。廣泛分布于人體的肝、腦、腎、胰和胎盤等各組織中，存在于細(xì)胞內(nèi)，定位于溶酶體，是酸性水解酶，本質(zhì)為糖蛋白。近年來(lái)，大量的研究資料表明，AFU不但是原發(fā)性肝癌的標(biāo)志物和診斷的可靠指標(biāo)，而且還可用于臨床監(jiān)測(cè)肝硬化病人是否發(fā)生惡變和糖尿病病情控制的觀察指標(biāo)。目前，測(cè)定α-L-巖藻糖苷酶的試劑，都存在一些缺點(diǎn)或不足之處。如干粉試劑需要復(fù)溶、而且復(fù)溶時(shí)間較長(zhǎng)、因復(fù)溶的人不同而瓶間差異較大。以PNP為底物的兩點(diǎn)法液體試劑，測(cè)定反應(yīng)的時(shí)間較長(zhǎng)；另外以CPNPF或CNPF作底物的試劑，雖然試劑不需復(fù)溶，可進(jìn)行批量樣本的自動(dòng)化檢測(cè)，但該類試劑的檢測(cè)時(shí)間還是相對(duì)較長(zhǎng)，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10分鐘；有的試劑雖然檢測(cè)時(shí)間較短，底物同樣也會(huì)自發(fā)水解而發(fā)黃，影響檢測(cè)效果。上述這些已知的方法都是采用405nm的波長(zhǎng)檢測(cè)，在檢測(cè)高膽紅素、溶血、脂濁的樣本時(shí)將會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果，檢測(cè)結(jié)果甚至?xí)霈F(xiàn)負(fù)數(shù)，所以此時(shí)測(cè)定的值是完全不準(zhǔn)確的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述
背景技術(shù)：
的不足，提供一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶(AFU)活力的方法以及試劑的改進(jìn)，該方法具有檢測(cè)時(shí)間較短、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單方便的特點(diǎn)，該試劑具有反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)、底物在保存過(guò)程中不會(huì)發(fā)生自發(fā)水解而發(fā)黃的情況。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的方法，將檢測(cè)樣品按比例加入試劑中混勻，在30-40℃孵育1.5-10分鐘，以使樣品中AFU催化試劑中的底物水解，生成L-巖藻糖，L-巖藻糖脫氫酶與生成的產(chǎn)物L(fēng)-巖藻糖反應(yīng)，同時(shí)使氧化型煙酰胺輔酶類似物還原，然后用全自動(dòng)生化分析儀于340nm處檢測(cè)吸光度的線性變化速率，從而計(jì)算出樣本中AFU的活力。所述樣品活力的計(jì)算公式為AFU活性＝(ΔA/min×TV×1000)/(ε×SV×P)。一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，包括緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、底物、表面活性劑，還包括以下氧化型煙酰胺輔酶類似物氧化型煙酰胺輔酶II、氧化型煙酰胺輔酶I、硫代-氧化型煙酰胺輔酶I、硫代-氧化型煙酰胺輔酶II之間的任意一種。所述的試劑是單試劑，其中包括緩沖液20-200mmol/L、防腐劑0.1-5mmol/L、穩(wěn)定劑0.01-20mmol/L、氧化型煙酰胺輔酶類似物0.1-10mmol/L、底物0.5-50mmol/L、表面活性劑0.1-20ml/L。所述的試劑是雙試劑，其中試劑A包括包括緩沖液20-150mmol/L、防腐劑2.5mmol/L-7mmol/L、穩(wěn)定劑0.01-18mmol/L、底物5-18mmol/L、表面活性劑2-10ml/L；試劑B包括包括緩沖液80-100mmol/L、防腐劑2.5-7mmol/L、穩(wěn)定劑2-12mmol/L、氧化型煙酰胺輔酶類似物6-8mmol/L。所述的緩沖液是三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、甘氨酸、檸檬酸、硼酸鹽、HEPES、PIPES、MES、咪唑、醋酸緩沖液之間的一種或若干種的任意組合，其PH值為3-9。所述的防腐劑是疊氮鈉、硫柳汞、對(duì)羥基苯甲酸、硫脲、抗生素之間的一種或若干種的任意組合。所述的穩(wěn)定劑是乙二胺四乙酸二鈉鹽、BSA、氯化鎂、還原型谷胱甘肽、二巰基蘇糖醇、海藻糖、乙二醇之間的一種或若干種的任意組合。所述的底物是[a-L-(-)-巖藻糖1-磷酸雙(環(huán)己胺)鹽]苷、a-L-(-)-巖藻糖D-葡萄糖苷、a-L-(-)-巖藻糖D-半乳糖苷、a-L-(-)-巖藻糖乳糖苷、a-L-(-)-巖藻糖D-巖藻糖苷之間的一種。所述的表面活性劑是GenapolX-080、Tween-20、NP-40、OP乳化劑之間的一種或若干種的任意組合。本發(fā)明提供的方法由于在340nm處(紫外光下)檢測(cè)，因而靈敏度較高，準(zhǔn)確率較高，反應(yīng)時(shí)間較短(只有5-6分鐘)，并且直接在自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)，操作方法簡(jiǎn)單方便。本發(fā)明提供的試劑由于在紫外光下檢測(cè)，因而反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高；又由于采用的是無(wú)發(fā)色團(tuán)的底物，在2-8℃時(shí)可保存一年不會(huì)發(fā)生自發(fā)水解而發(fā)黃的情況。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的機(jī)理是AFU催化底物，生成產(chǎn)物L(fēng)-巖藻糖，通過(guò)L-巖藻糖脫氫酶與生成的產(chǎn)物L(fēng)-巖藻糖反應(yīng)，同時(shí)使氧化型煙酰胺輔酶類似物還原而使340nm處吸光度發(fā)生上升變化，其上升的程度與樣本中AFU活性成正比，從而計(jì)算出樣本中AFU的活力。因而本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法主要是將檢測(cè)樣品按比例加入試劑中混勻，在30-40℃孵育1.5-10分鐘(孵育溫度及時(shí)間也可另行選定，推薦37℃孵育1.5-6分鐘)，通過(guò)樣品中α-FU催化底物水解，生成L-巖藻糖，然后通過(guò)L-巖藻糖脫氫酶與生成的產(chǎn)物L(fēng)-巖藻糖反應(yīng)，同時(shí)使氧化型煙酰胺輔酶類似物還原而使340nm處吸光度發(fā)生上升變化，并用全自動(dòng)生化分析儀于340nm處，監(jiān)測(cè)線性速率，從而計(jì)算出樣本中AFU的活力。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的α-L-巖藻糖苷酶測(cè)定試劑，包括緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、氧化型煙酰胺輔酶類似物、底物、表面活性劑。各生化原料的比例根據(jù)單一試劑和雙試劑的不同分別確定。一般地，雙試劑可減少各生化原料之間的干擾，提高穩(wěn)定性。該測(cè)定試劑的制造較為簡(jiǎn)單，只需將上述各生化原料按確定比例混合即成。所述的氧化型煙酰胺輔酶類似物是NADP(氧化型煙酰胺輔酶II)、NAD(氧化型煙酰胺輔酶I)、thin-NAD(硫代-氧化型煙酰胺輔酶I)、thin-NADP(硫代-氧化型煙酰胺輔酶II)之間的一種。所述的緩沖液是三羥甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸鹽、甘氨酸、檸檬酸、硼酸鹽、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸)鈉鹽)、MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)、咪唑、醋酸緩沖液之間的一種或若干種的任意組合，其PH值為3-9。所述的防腐劑是疊氮鈉、硫柳汞、對(duì)羥基苯甲酸、硫脲、抗生素之間的一種或若干種的任意組合，。所述的穩(wěn)定劑是乙二胺四乙酸二鈉鹽、BSA、氯化鎂、還原型谷胱甘肽、二巰基蘇糖醇、海藻糖、乙二醇之間的一種或若干種的任意組合。所述的氧化型煙酰胺輔酶類似物是NADP、NAD、thin-NAD、thin-NADP之間的任意一種。所述的底物是a-L-巖藻糖的糖苷化合物，經(jīng)AFU催化水解后能生成L-巖藻糖。可以是[a-L-(-)-巖藻糖1-磷酸雙(環(huán)己胺)鹽]苷{(diào)α-L-(-)-Fucose1-phosphatebis(cyclohexylammonium)salt}、a-L-(-)-巖藻糖D-葡萄糖苷、a-L-(-)-巖藻糖D-半乳糖苷、a-L-(-)-巖藻糖乳糖苷、a-L-(-)-巖藻糖D-巖藻糖苷之間的任意一種。所述的表面活性劑是GenapolX-080、Tween-20、NP-40、OP乳化劑之間的一種或若干種的任意組合。本發(fā)明所述的緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、氧化型煙酰胺輔酶類似物(以下實(shí)施例中簡(jiǎn)稱輔酶)、底物、表面活性劑及其它生化原料均可外購(gòu)獲得。實(shí)施例1(檢測(cè)方法)雙試劑測(cè)定的基本操作<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="796">加入物空白管測(cè)定管試劑1(μl)200200蒸餾水(μl)25——樣品(μl)——25混勻，30℃孵育9分鐘試劑2(μl)5050混勻，30℃延60秒，在波長(zhǎng)340nm處測(cè)定反應(yīng)線性期的吸光度變化，然后再計(jì)算平均每分鐘的吸光度變化率ΔA/min.</table></tables>計(jì)算公式TV總反應(yīng)體積SV樣品體積εNADH在340nm的毫摩爾消光系數(shù)6.22P為比色杯光徑實(shí)施例2(檢測(cè)方法)單試劑測(cè)定的基本操作單試劑測(cè)定的基本操作計(jì)算公式與前相同。實(shí)施例3(雙試劑)試劑A(R1)緩沖液MES20mmol/L防腐劑硫脲2.5mmol/L穩(wěn)定劑二巰基蘇糖醇0.005mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na0.005mmol/L表面活性劑NP-403ml/L底物a-L-(-)-巖藻糖-D-葡萄糖苷5mmol/L試劑B(R2)緩沖液Tris80mmol/L防腐劑疊氮鈉2.5mmol/L穩(wěn)定劑海藻糖10mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na2mmol/L輔酶NADP8mmol/L實(shí)施例4(雙試劑)試劑A(R1)緩沖液甘氨酸100mmol/L防腐劑疊氮鈉5mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na2mmol/L表面活性劑Tween-202ml/L底物a-L-(-)-巖藻糖-D-半乳糖苷18mmol/L試劑B(R2)緩沖液Tris100mmol/L防腐劑疊氮鈉7mmol/L穩(wěn)定劑BSA8mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na2mmol/L輔酶NADP6mmol/L實(shí)施例5(雙試劑)試劑A(R1)緩沖液檸檬酸150mmol/L防腐劑硫脲7mmol/L穩(wěn)定劑乙二醇4mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na4mmol/L穩(wěn)定劑氯化鎂12mmol/L表面活性劑GenapolX-08010ml/L底物a-L-(-)-巖藻糖的-巖藻糖苷15mmol/L試劑B(R2)緩沖液硼酸鹽100mmol/L防腐劑疊氮鈉5mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na2mmol/L輔酶NADP8mmol/L實(shí)施例6(單試劑)緩沖液甘氨酸20mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na0.005mmol/L穩(wěn)定劑海藻糖0.005mmol/L表面活性劑NP-4020ml/L底物a-L-(-)-巖藻糖-D-葡萄糖苷0.5mmol/L防腐劑疊氮鈉0.1mmol/L輔酶Thin-NADP0.1mmol/L實(shí)施例7(單試劑)緩沖液MES200mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na2mmol/L穩(wěn)定劑乙二醇18mmol/L表面活性劑GenapolX-0800.1ml/L底物a-L-(-)-巖藻糖-D-葡萄糖苷50mmol/L防腐劑疊氮鈉5mmol/L輔酶Thin-NADP10mmol/L實(shí)施例8(單試劑)緩沖液甘氨酸100mmol/L穩(wěn)定劑EDTA.2Na5mmol/L穩(wěn)定劑海藻糖5mmol/L表面活性劑NP-4010ml/L底物a-L-(-)-巖藻糖-D-葡萄糖苷25mmol/L防腐劑疊氮鈉0.1mmol/L輔酶Thin-NADP50mmol/L。權(quán)利要求1.一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的方法，其特征在于將檢測(cè)樣品按比例加入試劑中混勻，在30-40℃孵育1.5-10分鐘后，以使樣品中AFU催化試劑中的底物水解，生成L-巖藻糖，L-巖藻糖脫氫酶與生成的產(chǎn)物L(fēng)-巖藻糖反應(yīng)，同時(shí)使氧化型煙酰胺輔酶類似物還原，然后用全自動(dòng)生化分析儀于340nm處檢測(cè)吸光度的線性變化速率，從而計(jì)算出樣本中AFU的活力。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的方法，其特征在于所述樣品的計(jì)算公式為AFU活性＝(ΔA/min×TV×1000)/(ε×SV×P)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于試劑包括緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、底物、表面活性劑，還包括以下氧化型煙酰胺輔酶類似物氧化型煙酰胺輔酶II、氧化型煙酰胺輔酶I、硫代-氧化型煙酰胺輔酶I、硫代-氧化型煙酰胺輔酶II之間的任意一種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于所述的試劑是單試劑，其中包括緩沖液20-200mmol/L、防腐劑0.1-5mmol/L、穩(wěn)定劑0.01-20mmol/L、氧化型煙酰胺輔酶類似物0.1-10mmol/L、底物0.5-50mmol/L、表面活性劑0.1-20ml/L。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于所述的試劑是雙試劑，其中試劑A包括包括緩沖液20-150mmol/L、防腐劑2.5-7mmol/L、穩(wěn)定劑0.01-20mmol/L、底物5-18mmol/L、表面活性劑2-10ml/L；試劑B包括包括緩沖液80-100mmol/L、防腐劑2.5-7mmol/L、穩(wěn)定劑2-12mmol/L、氧化型煙酰胺輔酶類似物6-8mmol/L。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于所述的緩沖液是三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、甘氨酸、檸檬酸、硼酸鹽、HEPES、PIPES、MES、咪唑、醋酸緩沖液之間的一種或若干種的任意組合，其PH值為3-9。7.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于所述的防腐劑是疊氮鈉、硫柳汞、對(duì)羥基苯甲酸、硫脲、抗生素之間的一種或若干種的任意組合。8.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于述的穩(wěn)定劑是乙二胺四乙酸二鈉鹽、BSA、氯化鎂、還原型谷胱甘肽、二巰基蘇糖醇、海藻糖、乙二醇之間的一種或若干種的任意組合。9.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于所述的底物是[a-L-(-)-巖藻糖1-磷酸雙(環(huán)己胺)鹽]苷、[a-L-(-)-巖藻糖1-磷酸雙(環(huán)己胺)鹽]苷、a-L-(-)-巖藻糖D-葡萄糖苷、a-L-(-)-巖藻糖D-半乳糖苷、a-L-(-)-巖藻糖乳糖苷、a-L-(-)-巖藻糖D-巖藻糖苷之間的一種或若干種的任意組合。10.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的一種檢測(cè)α-L-巖藻糖苷酶活力的試劑，其特征在于所述的表面活性劑是GenapolX-080、Tween-20、NP-40、OP乳化劑之間的一種或若干種的任意組合。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于血清α－L－巖藻糖苷酶(AFU)活力的測(cè)定方法及試劑，屬于生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)α－L－巖藻糖苷酶(AFU)活力的方法及試劑的改進(jìn)，其應(yīng)具有檢測(cè)時(shí)間較短、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單方便，以及底物在保存過(guò)程中不會(huì)自發(fā)水解而發(fā)黃的特點(diǎn)。提供的技術(shù)方案是一種檢測(cè)α－L－巖藻糖苷酶活力的方法，將檢測(cè)樣品按比例加入試劑中混勻，在30－40℃孵育1.5－10分鐘，然后用全自動(dòng)生化分析儀于340nm處檢測(cè)吸光度的線性變化速率，從而計(jì)算出樣本中AFU的活力。一種檢測(cè)α－L－巖藻糖苷酶活力的試劑，包括緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、底物、表面活性劑，還包括氧化型煙酰胺輔酶類似物。文檔編號(hào)G01N1/28GK1731146SQ200510060400公開(kāi)日2006年2月8日申請(qǐng)日期2005年8月11日優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日發(fā)明者王賢理,蒙凱,蔡其浩申請(qǐng)人:王賢理