專利名稱：用于檢測(cè)結(jié)腸直腸癌診斷用的結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物基因的甲基化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)結(jié)腸直腸癌診斷用的結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物基因的甲基化的方法，尤其涉及檢測(cè)結(jié)腸直腸癌特異性標(biāo)志物基因的方法，該基因在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中被特異性地甲基化，從而為診斷結(jié)腸直腸癌提供信息。
背景技術(shù)：
即便是在醫(yī)學(xué)科學(xué)進(jìn)步的當(dāng)今時(shí)代，癌癥患者，尤其是實(shí)體瘤患者(不同于血液癌患者)的5年生存率也低于50%，且全部癌癥患者中的大約2/3都在晚期確診，并且?guī)缀跞荚诎┌Y診斷后的兩年內(nèi)去世。癌癥治療中這樣的糟糕結(jié)果不僅是治療方法的問題，還歸因于早期癌癥診斷、晚期癌癥的確診以及對(duì)癌癥治療后癌癥患者的后續(xù)追蹤的不易。 目前的臨床實(shí)踐中，經(jīng)病史詢問、身體檢查和臨床評(píng)估，如果疑似患有癌癥，再以放射線檢測(cè)和內(nèi)窺鏡檢查，之后才通過組織活檢確診為癌癥。然而，只有當(dāng)癌細(xì)胞數(shù)量超過十億，且癌直徑大于Icm時(shí)，通過現(xiàn)有的臨床實(shí)踐診斷癌癥才是可能的。這種情況下，癌細(xì)胞已經(jīng)具備了轉(zhuǎn)移能力，并且其中至少半數(shù)已經(jīng)轉(zhuǎn)移。同時(shí)，用于監(jiān)測(cè)由癌癥直接或間接產(chǎn)生的物質(zhì)的腫瘤標(biāo)志物被用于癌癥篩查，但它們由于準(zhǔn)確性有限會(huì)造成干擾，因?yàn)槠渲卸噙_(dá)半數(shù)的腫瘤標(biāo)志物甚至在癌癥存在的情況系下也表現(xiàn)為正常，卻經(jīng)常在甚至未患癌癥的情況下表現(xiàn)為陽性。另外，主要用于癌癥治療的抗癌劑具有只在癌體積較小時(shí)才有效的問題。癌癥難以診斷和治療的原因在于，癌細(xì)胞的高度復(fù)雜性和可變性。癌細(xì)胞過度且持續(xù)生長，侵害周圍組織，并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端器官，導(dǎo)致死亡。盡管有免疫機(jī)制的攻擊或抗癌治療，癌細(xì)胞依然存活，持續(xù)發(fā)展，且最適于存活的細(xì)胞群選擇性繁殖。癌細(xì)胞是具有高度生存力的活體，它的發(fā)生是由大量基因的突變所致。為使一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞，并發(fā)展成臨床可檢測(cè)的惡性癌瘤塊，必須發(fā)生大量基因突變。因此，為了從根本上診斷和治療癌癥，需要基因水平的治療途徑。近來，人們積極地嘗試遺傳分析技術(shù)來診斷癌癥。最簡單的典型方法是用PCR檢測(cè)血液中ABL =BCR融合基因(白血病的遺傳特征)的存在。該方法準(zhǔn)確率超過95%，且在使用這一簡單易行的遺傳分析來診斷和治療慢性粒細(xì)胞白血病后，該方法還被用于結(jié)果評(píng)估和后續(xù)研究。然而，該方法的缺陷在于，其只能用于某些血液癌。此外，還嘗試過另一種方法，其中使用RT-PCR和印跡技術(shù)來檢測(cè)癌細(xì)胞表達(dá)基因的存在，從而診斷血細(xì)胞中癌細(xì)胞的存在。然而，該方法的缺點(diǎn)在于，它只能用于一些癌癥，包括前列腺癌和黑色素瘤，且假陽性率高。另外，該方法中難以標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)和讀取，其效用也有限(Kopreski, M. S. et al. , Clin. Cancer Res. , 5:1961, 1999 ;Miyashiro, I. etal.，Clin. Chem.，47:505，2001)。近來，人們積極地嘗試了使用血清或血漿中DNA的基因檢測(cè)方法。這是一種檢測(cè)癌癥相關(guān)基因的方法，所述癌癥相關(guān)基因分離自癌細(xì)胞并釋放入血液中，并在血清中以游離DNA形式存在。據(jù)發(fā)現(xiàn)，實(shí)際癌癥患者血漿中DNA的濃度是正常人的5-10，這些增加的DNA大多數(shù)由癌細(xì)胞釋放。利用這些分離自癌細(xì)胞的DNA，分析癌癥特異性基因的異常，例如突變、缺失以及原癌基因(oncogene)和腫瘤抑制基因的功能缺失,可以診斷癌癥。在這方面，人們已有積極的嘗試，通過檢測(cè)血清中突變K-Ras原癌基因、p53腫瘤抑制基因和pl6基因的啟動(dòng)子甲基化，以及微衛(wèi)星的標(biāo)記和不穩(wěn)定性，用以診斷肺癌、頭頸癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌及肝癌(Chen, X. Q. et al. , Clin. Cancer Res. , 5:2297, 1999;Esteller, M. et al. , CancerRes. , 59:67, 1999 ; Sanchez-Cespedes, M. et al. , Cancer Res. , 60:892, 2000 ; Sozzi, G.etal. , Clin. Cancer Res. , 5:2689，1999)。同時(shí)，在除血液之外的樣品中也能檢測(cè)到癌細(xì)胞的DNA。在一種已嘗試的方法中，通過基因或抗體測(cè)試來檢測(cè)肺癌患者的痰或支氣管肺泡灌洗液中癌細(xì)胞或原癌基因的存在(Palmi sano, W. A. et al. , Cancer Res.，60:5954，2000; Sueoka, E. et al. , CancerRes. ,59:1404, 1999)。另外，已有檢測(cè)結(jié)腸和直腸癌患者糞便中原癌基因的存在(Ahlquist, D. A. et al. , Gastroenterol. , 119:1219-27，2000)和檢測(cè)尿液和精液中啟動(dòng)子甲基化異常(Goessl, C. et al. , Cancer Res. , 60:5941, 2000)的其他方法的嘗試。然而，為了準(zhǔn)確地診斷導(dǎo)致大量基因異常并表現(xiàn)出各種癌癥不同的突變特征的癌癥，需要一種以準(zhǔn) 確且自動(dòng)化的方式同時(shí)分析大量基因的方法。然而，上述方法尚未建立。因而，最近提出了通過檢測(cè)DNA甲基化來診斷癌癥的方法。當(dāng)某基因的啟動(dòng)子CpG島高度甲基化時(shí)，該基因的表達(dá)沉默(silenced)。這被解釋為該基因喪失功能的主要機(jī)制，即便活體中所述基因的蛋白質(zhì)編碼序列并無突變。另外，這也被分析為是導(dǎo)致人類癌癥中一些腫瘤抑制基因功能喪失的因素。因此，對(duì)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化分析非常有助于癌癥研究。已有通過例如甲基化特異性PCR (下文中稱為“MSP”)或自動(dòng)堿基測(cè)序的方法來分析所述啟動(dòng)子CpG島的甲基化，并將分析結(jié)果用于癌癥診斷和篩查的積極嘗試。相當(dāng)數(shù)量的疾病是由基因異常造成的，而基因異常最常見的形式是基因編碼序列的改變。這種遺傳性改變稱為突變。當(dāng)任何基因中發(fā)生突變時(shí)，該基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致異常和缺失，并且該突變的蛋白質(zhì)會(huì)引起疾病。然而，特定基因的表達(dá)異常也會(huì)引起疾病，即便所述基因中并未發(fā)生突變。這其中一個(gè)典型的例子是甲基化，其中甲基偶聯(lián)至基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，即所述啟動(dòng)子CpG島的胞嘧啶堿基，這種情況下，所述基因的表達(dá)沉默。這就是所謂的表觀遺傳變化(epigenetic change)。這種變化傳遞給后代，導(dǎo)致相關(guān)蛋白質(zhì)以與突變相同的方式表達(dá)缺失。最典型地，癌細(xì)胞中腫瘤抑制基因由于啟動(dòng)子CpG島的甲基化而表達(dá)沉默，導(dǎo)致癌變(Robertson，K. D. etal. , Carcinogensis, 21:461,2000)。對(duì)于癌癥確診而言，重要的是不僅檢測(cè)突變基因，而且檢測(cè)該基因發(fā)生突變的機(jī)制。之前的研究集中于編碼序列中的突變，即微觀變化，例如點(diǎn)突變、缺失和插入，或宏觀的染色體異常。然而，近年來，表觀遺傳變化據(jù)報(bào)導(dǎo)與這些突變同等重要，所述表觀遺傳變化的典型例子是所述啟動(dòng)子CpG島的甲基化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組DNA中，除了 A，C，G和T外還有第五種堿基，即5_甲基胞嘧啶，其中甲基偶聯(lián)到所述胞嘧啶環(huán)的第5個(gè)碳上(5-mC)。5-mC總是只與CG 二核苷酸中的C偶聯(lián)(5’ -mCG-3’)，這常被標(biāo)識(shí)為CpG。CpG的C通常由于偶聯(lián)著甲基而被甲基化。這種CpG的甲基化抑制了基因組中重復(fù)序列，例如Alu或轉(zhuǎn)座子，的表達(dá)。另外，這種CpG是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表觀遺傳變化最頻發(fā)的位點(diǎn)。這種CpG的5-mC經(jīng)天然脫氨成為T，因而哺乳動(dòng)物基因組中的所述CpG僅表現(xiàn)出1%的頻率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常頻率(l/4xl/4=6. 25%)。CpG異常集中的區(qū)域被稱為CpG島。所述CpG島是指長度在0. 2_3kb，C+G含量超過50%，且CpG比例高于3. 75%的位點(diǎn)。人類基因組中約有45，000個(gè)CpG島，大多見諸于調(diào)控基因表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)域。實(shí)際上，CpG島存在于占人類基因約50%的管家基因(housekeepinggene)的啟動(dòng)子上(Cross, S. et al. , Curr. Opin. Gene Develop. , 5:309，1995)。同時(shí)，正常人的體細(xì)胞中，這種管家基因啟動(dòng)子位點(diǎn)的CpG島是未甲基化的，而印記基因(imprinted gene)和失活的X染色體上的基因被甲基化，使所述基因在發(fā)育過程中不表達(dá)。致癌過程中，甲基化見諸于啟動(dòng)子CpG島中，并限制相應(yīng)基因的表達(dá)。特別地，如果甲基化發(fā)生在腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子CpG島中，所述基因調(diào)控細(xì)胞周期或凋亡，修復(fù) DNA，參與細(xì)胞粘著和細(xì)胞間相互作用，和/或抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，則這種甲基化以與編碼序列的突變相同的方式阻斷了所述基因的表達(dá)和功能，從而促進(jìn)了癌癥的發(fā)生發(fā)展。另夕卜，由于衰老所述CpG島中還會(huì)發(fā)生部分甲基化。一個(gè)有趣的事實(shí)是，在基因突變會(huì)導(dǎo)致先天癌癥的癌癥發(fā)展但所述基因的突變不會(huì)發(fā)生在獲得性癌癥中的情況下，所述基因的啟動(dòng)子CpG島的甲基化代替了突變。典型的例子包括所述基因的啟動(dòng)子甲基化，例如獲得性腎癌VHL(von Hippel Lindau)、乳腺癌BRCAl、結(jié)腸直腸癌MLHl以及胃癌E-CAD。另外，所有癌癥中的約半數(shù)均發(fā)生了 pl6啟動(dòng)子甲基化或Rb突變，而其余癌癥則表現(xiàn)出p53突變或p73、pl4及類似基因的啟動(dòng)子甲基化。一個(gè)重要的事實(shí)是，啟動(dòng)子甲基化引起的表觀遺傳變化導(dǎo)致了遺傳變化(S卩，編碼序列突變)，并且癌癥的發(fā)展被所述遺傳和表觀遺傳變化的結(jié)合共同推進(jìn)。例如在MLHl基因中，存在如下情況在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中MLHl基因的一個(gè)等位基因由于基因突變或缺失而功能喪失，而剩下的一個(gè)等位基因由于啟動(dòng)子甲基化而不發(fā)揮功效。另外，如果MLHljP一種DNA修復(fù)基因，的功能由于啟動(dòng)子甲基化而喪失，則其他重要基因的突變發(fā)生有助于促進(jìn)癌癥的發(fā)展。大多數(shù)癌癥表現(xiàn)出與CpG有關(guān)的三種共性，S卩，腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子CpG島的高度甲基化，剩余CpG堿基位點(diǎn)的低甲基化(hypomethylation),以及甲基化酶即DNA胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的活性增加(Singal, R. &Ginder, G. D.，Blood, 93:4059, 1999;Robertson, K. etal.，Carcinogensis，21:461，2000;Malik,K. &Brown,K.W., Brit.J. Cancer, 83:1583，2000)。當(dāng)啟動(dòng)子CpG島被甲基化時(shí)，相應(yīng)基因的表達(dá)被阻斷的原因并未清楚地建立起來，但據(jù)推測(cè)是因?yàn)榧谆疌pG結(jié)合蛋白(MECP)或甲基化CpG結(jié)合域蛋白(MBD)以及組蛋白去乙酰化酶與甲基化的胞嘧啶相結(jié)合，從而造成染色體的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變和組蛋白改變。究竟啟動(dòng)子CpG島甲基化是直接造成癌癥的發(fā)展，還是作為癌癥發(fā)展后的次生變化仍然未確定。然而，明確的是，腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化是癌癥的重要指標(biāo)，并因而能用于許多應(yīng)用，包括癌癥的診斷和早期檢測(cè)、癌癥發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)估、癌癥預(yù)后、治療后的后續(xù)檢查以及對(duì)抗癌治療反應(yīng)的預(yù)估。近來，人們進(jìn)行了積極嘗試，檢查血液、痰、唾液、糞便或尿液中的腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化，并將檢查結(jié)果用于各種癌癥的診斷和治療(Esteller, M. et al. , Cancer Res. , 59:67, 1999;Sanchez-Cespedez, M. et al. , CancerRes.,60:892，2000;Ahlquist, D. A. et al. , Gastroenterol. , 119:1219, 2000)。為了使利用啟動(dòng)子甲基化的癌癥診斷的準(zhǔn)確性最大化，根據(jù)各個(gè)階段分析癌癥的發(fā)展，并區(qū)分根據(jù)癌癥和老化發(fā)生的變化，需要能夠準(zhǔn)確分析啟動(dòng)子CpG島的所有胞嘧啶堿基的甲基化的檢查。目前，該檢查的標(biāo)準(zhǔn)方法是亞硫酸鹽基因組測(cè)序法，其中，樣品DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理，待檢測(cè)靶基因的CpG島的所有區(qū)域通過PCR擴(kuò)增，接著分析擴(kuò)增區(qū)域的堿基序列。然而，這種檢查的問題在于，一定時(shí)間內(nèi)能被檢查的基因或樣品數(shù)量有限。另外的問題在于，自動(dòng)化很難，且需要大量的時(shí)間和費(fèi)用。在約翰 霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院(JohnsHopkins School of Medicine)、MD安德森癌癥中心(the MD Anderson Cancer Center)、柏林夏麗戎大學(xué)醫(yī)學(xué)院(Charite- Universit;"Usmedizin Berlin)等中，關(guān)于癌癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化的 研究開展活躍。由此獲得的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)通過DNA甲基化協(xié)會(huì)(DMS)互相交換，并存儲(chǔ)于MethDB (http: //www. methdb. de)中。同時(shí)，EpiGenXPharmaceuticals 公司目前正開發(fā)與CpG島甲基化相關(guān)的治療劑,而Epigenomics公司目前正致力于研究通過使用不同的技術(shù)，例如DNA芯片和MALDI-T0F來檢測(cè)啟動(dòng)子甲基化，以將啟動(dòng)子甲基化應(yīng)用于癌癥診斷。相應(yīng)地，本發(fā)明的發(fā)明者們付出了大量的努力來開發(fā)有效的結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物，該標(biāo)志物使癌癥和癌變風(fēng)險(xiǎn)的早期診斷以及癌癥預(yù)后的預(yù)測(cè)成為可能。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖2(Syndecan2)), SIMl (NM_05068,單意同源物 I (Single-minded homologl)(果妮)以及S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含 VPS10 域的受體 3(Sortilin_related VPSlOdomaincontaining receptor 3))的基因在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中被特異性甲基化,且利用這些基因作為生物標(biāo)志物，通過檢測(cè)甲基化程度，可以診斷結(jié)腸直腸癌，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)主要目標(biāo)是提供一種結(jié)腸直腸癌特異性的甲基化生物標(biāo)志物，所述標(biāo)志物在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中特異性甲基化，并能有效地用于結(jié)腸直腸癌診斷，以及所述標(biāo)志物在為結(jié)腸直腸癌的早期診斷提供信息中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是一種檢測(cè)SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖2), SIMl (NM_05068,單意同源物I)(果蠅)以及S0RCS3 (NM_014978，分揀蛋白相關(guān)的含VPS10域的受體3)基因的甲基化的方法，所述基因的甲基化為結(jié)腸直腸癌特異性的甲基化生物標(biāo)志物，以及利用同樣的方法來診斷結(jié)腸直腸癌的試劑盒和核酸芯片。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)用于結(jié)腸直腸癌診斷的結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物基因的甲基化的方法，所述方法包括步驟(a)制備包含DNA的臨床樣品；以及(b)檢測(cè)所述臨床樣品DNA中的至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或者所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島的甲基化(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及
(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。本發(fā)明還提供了一種用于診斷結(jié)腸直腸癌的組合物，所述組合物包含至少一個(gè)如下基因的CpG島、或者所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及 (iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。本發(fā)明提供了一種通過檢測(cè)結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物基因的甲基化以診斷結(jié)腸直腸癌的方法，所述方法包括步驟(a)制備包含DNA的臨床樣品；以及(b)如果所述臨床樣品DNA中的至少一個(gè)如下基因的CpG島或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島被檢測(cè)為甲基化，則診斷所述臨床樣品為結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸癌進(jìn)展期(progression stage)(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。本發(fā)明還提供了至少一個(gè)如下基因的CpG島或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島在結(jié)腸直腸癌診斷中的用途(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。本發(fā)明還提供了用于診斷結(jié)腸直腸癌的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增包含至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或者所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島的片段的PCR引物對(duì)；以及用于對(duì)通過所述引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的測(cè)序引物(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I (果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)本發(fā)明還提供了用于診斷結(jié)腸直腸癌的核酸芯片，所述芯片上固定有探針，所述探針能與包含至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或者所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島的片段在嚴(yán)格的條件下雜交(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)本發(fā)明的其他特征和實(shí)施方式將在后面詳細(xì)的說明和所附權(quán)利要求書中更加明確。附圖
簡要說明圖I是顯示通過CpG微陣列從正常人和結(jié)腸直腸癌患者尿液細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)甲基化生物標(biāo)志物的過程的示意圖。圖2是顯示從所述結(jié)腸直腸癌微陣列數(shù)據(jù)中篩選結(jié)腸直腸癌特異性高度甲基化基因的過程的示意圖。
圖3是顯示通過焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系和正常人結(jié)腸直腸組織中的7個(gè)生物標(biāo)志物候選基因的甲基化程度的結(jié)果圖表。圖4是顯示通過焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)腸直腸癌組織和相鄰正常組織中3個(gè)甲基化生物標(biāo)志物的甲基化程度的結(jié)果圖表。圖5是顯示通過ROC曲線分析檢測(cè)3個(gè)結(jié)腸直腸癌甲基化生物標(biāo)志物的靈敏性和特異性，以評(píng)價(jià)所述生物標(biāo)志物診斷結(jié)腸直腸癌的能力的結(jié)果圖表。圖6顯示了通過甲基化特異性PCR來證實(shí)正常人和結(jié)腸直腸癌患者的排泄物組織中SDC2生物標(biāo)志物基因的甲基化結(jié)果(圓圈甲基化特異性PCR產(chǎn)物)。發(fā)明的最佳實(shí)施方式
除非另有限定，本文所用的所有技術(shù)和科技術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意思相同。總的來說，本文所用的術(shù)語眾所周知，并為本領(lǐng)域所通用。本發(fā)明的特征在于，將SDC2(NM_002998，多配體蛋白聚糖2)，SMl (NM_05068，單意同源物I)(果蠅)以及S0RCS3(NM_014978，分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)基因的CpG島用作生物標(biāo)志物，所述CpG島在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中被特異性甲基化。一方面，本發(fā)明致力于一種用于診斷結(jié)腸直腸癌的組合物，所述組合物包含至少一個(gè)如下基因的CpG島或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。在本發(fā)明中，所述CpG島可以位于所述基因的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)。這里，所述SDC2基因的內(nèi)含子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+681到+1800核苷酸(nt)之間，并可包含SEQID NO: I的核苷酸序列。另外，所述S0RCS3基因的內(nèi)含子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+851到+2000核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。而且，所述CpG島可以位于所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域。這里，所述SMl基因的啟動(dòng)子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-1500到-501核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列。在本發(fā)明中，篩選到在正常人和結(jié)腸直腸癌患者之間表現(xiàn)出甲基化程度差異最大的7個(gè)生物標(biāo)志物候選基因，這些基因中，SDC2, SIMl和S0RCS3基因被證實(shí)能夠用于診斷結(jié)腸直腸癌。根據(jù)本發(fā)明的用于篩選甲基化標(biāo)志物基因的方法包含步驟(a)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離基因組DNA ； (b)將所述分離的基因組DNA與甲基化DNA結(jié)合蛋白反應(yīng)，從而分離出甲基化DNA ;以及(c)擴(kuò)增所述甲基化DNA，將所述擴(kuò)增后的DNA與CpG微陣列雜交，接著選取在所述正常細(xì)胞和所述癌細(xì)胞之間表現(xiàn)出甲基化程度差異最大的基因，從而確定甲基化標(biāo)志物基因。上述用于篩選生物標(biāo)志物基因的方法能夠發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸直腸癌中，以及在進(jìn)展成結(jié)腸直腸癌的組織的不同異常發(fā)育階段中的差別化甲基化基因。所述篩選出的基因能夠用于結(jié)腸直腸癌篩查、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、預(yù)后、疾病鑒定、疾病階段診斷以及治療靶標(biāo)選取。鑒定在結(jié)腸直腸癌中被甲基化的基因以及在結(jié)腸直腸癌不同階段的異常，使得在早期以準(zhǔn)確而有效的方式診斷結(jié)腸直腸癌成為可能，并允許對(duì)多基因進(jìn)行甲基化分析(profiling),以及鑒定用于治療性干預(yù)的新靶標(biāo)。此外，根據(jù)本發(fā)明的甲基化數(shù)據(jù)可與其他非甲基化相關(guān)的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法聯(lián)合使用，以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)腸直腸癌診斷體系。根據(jù)本發(fā)明的方法，通過確定來自樣品的一個(gè)或多個(gè)核酸生物標(biāo)志物的甲基化階段，可以診斷不同階段或時(shí)期的結(jié)腸直腸癌的進(jìn)展。通過將分離自處于結(jié)腸直腸癌各階段的樣品的核酸的甲基化階段與分離自無結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常的樣品中的一個(gè)或多個(gè)核酸的甲基化階段進(jìn)行比較，能夠檢測(cè)所述樣品中結(jié)腸直腸癌的特定階段。這里，所述甲基化階段可以是高度甲基化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸可以在基因調(diào)控區(qū)域被甲基化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過檢測(cè)基因調(diào)控區(qū)域外的甲基化，可以早期診斷與細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，因?yàn)榧谆菑幕蛲獠肯騼?nèi)部發(fā)展的。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，利用甲基化標(biāo)志物基因能夠早期診斷有可能形成結(jié)腸直腸癌的細(xì)胞。當(dāng)證實(shí)為在癌細(xì)胞中被甲基化的基因在臨床上或形態(tài)上看似正常的細(xì)胞中被甲基化時(shí)，這就表明所述看似正常的細(xì)胞在向癌癥發(fā)展。因此，通過檢測(cè)看似正常的細(xì)胞中的結(jié)腸直腸癌特異性基因的甲基化，可以在早期診斷結(jié)腸直腸癌。使用本發(fā)明的甲基化標(biāo)志物基因允許檢測(cè)樣品中結(jié)腸直腸組織的細(xì)胞增殖異常(發(fā)育異常)。所述檢測(cè)方法包括將包含至少一種分離自對(duì)象的核酸與至少一種能夠測(cè)定所述核酸甲基化狀態(tài)的試劑接觸。所述方法包括檢測(cè)至少一種核酸中的至少一個(gè)區(qū)域的甲基化，其中所述核酸的甲基化不同于無異常生長(發(fā)育異常的進(jìn)程)的結(jié)腸直腸細(xì)胞樣品中的相同核酸區(qū)域的甲基化狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，組織發(fā)展成結(jié)腸直腸癌的可能性可以通過檢查在結(jié)腸直腸癌中被特異性甲基化的基因的甲基化，以及測(cè)定有可能發(fā)展成結(jié)腸直腸癌的組織的甲基化頻率來評(píng)估。因此，另一方面，本發(fā)明致力于一種用于檢測(cè)結(jié)腸直腸癌診斷用的結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物基因的甲基化的方法，所述方法包含步驟(a)制備包含DNA的臨床樣品；以及(b)檢測(cè)所述臨床樣品DNA中的至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或者所述至少一個(gè)基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)在本發(fā)明中，步驟(b)可以通過檢測(cè)所述基因內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)的CpG島的甲基化來實(shí)施。這里，所述SDC2基因的內(nèi)含子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+681到+1800核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ ID N0:1的核苷酸序列。另外，所述S0RCS3基因的內(nèi)含子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+851到+2000核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。此外，所述CpG島可位于所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域。這里，所述SMl基因的啟動(dòng)子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-1500到-501核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列。在本發(fā)明中，步驟(b)可以通過選自由PCR、甲基化特異性PCR、實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR、利用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白的PCR試驗(yàn)、定量PCR、基于DNA芯片的試驗(yàn)、焦磷酸測(cè)序以及亞硫酸鹽測(cè)序組成的組中的方法來實(shí)施。另外，所述臨床樣品可選自由來自疑似癌癥患者或待診斷對(duì)象的組織、細(xì)胞、血液、血漿、糞便以及尿液組成的組，但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于檢測(cè)基因的甲基化的方法包含(a)制備包含DNA的臨床樣品；(b)從所述臨床樣品中分離DNA ; (c)利用能夠擴(kuò)增包含SDC2，SIMl和S0RCS3基因中任何一個(gè)或多個(gè)的啟動(dòng)子或內(nèi)含子的CpG島片段的引物來擴(kuò)增所述分離的DNA;以及(d)基于所述DNA在步驟(c)中是否被擴(kuò)增，確定所述內(nèi)含子是否被甲基化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，樣品中結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常(發(fā)育異常)可利用試劑盒通過檢測(cè)如下基因的甲基化狀態(tài)來診斷(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。 因此，另一方面，本發(fā)明致力于一種用于診斷結(jié)腸直腸癌的試劑盒，所述試劑盒包含用于擴(kuò)增包含至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島的片段的PCR引物對(duì)；以及用于對(duì)通過所述引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的測(cè)序引物(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMl (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。本發(fā)明中，所述PCR引物對(duì)可選自由SEQ ID NO: 12和13引物對(duì)、SEQID NO: 14和15引物對(duì)以及SEQ ID NO: 16和17引物對(duì)所組成的組。本發(fā)明中，所述測(cè)序引物可選自由SEQ ID NO:22到24的引物組成的組。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，樣品中結(jié)腸直腸組織細(xì)胞的細(xì)胞增殖異常(發(fā)育異常)可利用核酸芯片通過檢測(cè)如下基因的甲基化狀態(tài)來診斷。因此，另一方面，本發(fā)明致力于一種用于診斷結(jié)腸直腸癌的核酸芯片，所述芯片上固定有探針，所述探針能夠與包含至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島的片段在嚴(yán)格的條件下雜交(i) SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖 2);(ii) SIMI (NM_05068,單意同源物 I)(果蠅);以及(iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。在本發(fā)明中，所述CpG島可位于所述基因的內(nèi)含子區(qū)域。這里，所述SDC2基因的內(nèi)含子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+681到+1800核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ IDNO: I的核苷酸序列。另外，所述S0RCS3基因的內(nèi)含子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+851到+2000核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ IDN0:3的核苷酸序列。而且，所述CpG可位于所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域。這里，所述SMl基因的啟動(dòng)子區(qū)域可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-1500到-501核苷酸(nt)之間，并可包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列。本發(fā)明中，所述探針可選自由SEQ ID NO: 33到44所示的堿基序列組成的組，其中特定的例子如下SDC2I)5’-tgggtcgggc ccgcgaggga acggc-3’ (SEQ ID NO:33)
2) 5，-ggggggagcc tgggtcgggc ccgcgaggga acggctccac-3，(SEQ ID NO :34)3)5' -tcgccctcgg cgggtcttgc tgcgtggtct gggaaggacg gaggggaaag-3' (SEQ IDNO :35)4) 5' -ggggtccctt cctccgcaca ccatcccccc cgcgccagct ttcctgtttgactgcatgcaagttctgggg agatgggggc cagatttaag agacccgcga-3' (SEQ ID NO:36)SIMlI) 5，-gatgggcgcc cccgaaacct ctgcc-3，(SEQ ID NO:37)2) 5' -gccccgcgcc cgcccagcag ccccgcagct ccgcggtggt-3' (SEQ ID NO :38)3) 5' -gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga-3' (SEQIDNO:39)4)5' -gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga acagttaagagatgggcgcc cccgaaacct ctgccgcttg tggggactga-3’ (SEQ ID NO :40)S0RCS3I)5’-cgagaggtgg cgtcgttgag cccgg-3’ (SEQ ID NO:41)2)5，-cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3， (SEQ ID NO:42)3)5'-cgagaggtgg cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3' (SEQ IDNO :43)4) 5' -cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac tgggcgcccgactgagcatcgcgcctgcct ggcagctgca gcggcccgca gcgcgtgccc ggaggggctc-3' (SEQ IDNO :44)使用本發(fā)明的診斷試劑盒或核酸芯片使得確定樣品中結(jié)腸直腸組織細(xì)胞的異常生長(發(fā)育異常進(jìn)程)成為可能。所述方法包括確定分離自樣品中的至少一種核酸的甲基化狀態(tài)，其中所述至少一種核酸的甲基化狀態(tài)與分離自無異常生長(發(fā)育異常進(jìn)程)的結(jié)腸直腸細(xì)胞的樣品中的核酸分子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞可利用所述試劑盒或核酸芯片通過檢查所述標(biāo)志物基因的甲基化來檢測(cè)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)腸直腸癌可利用所述試劑盒或核酸芯片通過檢查所述標(biāo)志物基因的甲基化來診斷。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式中，所述發(fā)展成結(jié)腸直腸癌的可能性可利用所述試劑盒或核酸芯片通過檢查表現(xiàn)出正常表型的樣品中的標(biāo)志物基因的甲基化來診斷。用于本發(fā)明的樣品可以是固體或液體組織、細(xì)胞、糞便、尿液、血清或血漿。本文所用的主要術(shù)語定義如下。如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞轉(zhuǎn)化”指細(xì)胞特征從一種形式到另一種形式的改變，例如從正常變成異常，非腫瘤性的變成腫瘤性的，未分化的變成分化的，干細(xì)胞變成非干細(xì)胞。另外，所述轉(zhuǎn)化可通過細(xì)胞形態(tài)、表型、生化特征以及類似特征的來識(shí)別。如本文所用，術(shù)語癌癥的“早期檢測(cè)”指在轉(zhuǎn)移之前發(fā)現(xiàn)癌癥的可能性，優(yōu)選是在觀察到組織或細(xì)胞中的形態(tài)改變之前。另外，術(shù)語細(xì)胞轉(zhuǎn)化的“早期診斷”指在細(xì)胞被形態(tài)學(xué)認(rèn)定為轉(zhuǎn)化之前的早期所述細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的高度可能性。如本文所用，術(shù)語“高度甲基化”指CpG島的甲基化。
如本文所用，術(shù)語“樣品”或“臨床樣品”指其最廣泛的含義，并包括獲自個(gè)體、體液、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物的任何生物樣品，這取決于所要實(shí)施的試驗(yàn)類型。從哺乳動(dòng)物中獲取組織切片和體液的方法為本領(lǐng)域所公知。結(jié)腸直腸組織的切片(biospy)是優(yōu)選來源。結(jié)腸肓腸癌生物標(biāo)志物一癌細(xì)胞中與IH常細(xì)胞中比較的應(yīng)用本發(fā)明中，“正?！奔?xì)胞指未表現(xiàn)出任何異常形態(tài)學(xué)或細(xì)胞學(xué)變化的細(xì)胞。“腫瘤”細(xì)胞是癌細(xì)胞。“非腫瘤”細(xì)胞是病變組織的一部分，但并不認(rèn)為是腫瘤部分的那些細(xì)胞。一方面，本發(fā)明是基于對(duì)結(jié)腸直腸癌與SDC2(NM_002998，多配體蛋白聚糖2), SIMl (NM_05068,單意同源物I)(果蠅)以及S0RCS3 (NM_014978，分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)基因的高度甲基化之間的關(guān)系的發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，利用本發(fā)明的試劑盒或核酸芯片通過確定來自對(duì)象的至少一種核酸的甲基化階段，可早期診斷結(jié)腸直腸組織細(xì)胞的細(xì)胞增殖異常。這里，所述至少一種核酸的甲基化階段可與分離自不含結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常的對(duì)象的至少 一種核酸的甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較。所述核酸優(yōu)選是包含CpG例如CpG島的核酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常可利用本發(fā)明的試劑盒或核酸探針，通過確定來自對(duì)象的至少一種核酸的甲基化來診斷。這里，所述核酸可以是選自SDC2 (NM_002998，多配體蛋白聚糖2)基因，SMl (NM_05068，單意同源物I)(果蠅)基因，S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)基因，以及上述基因的組合，中的至少一種。在該實(shí)施方式中，所述至少一種核酸的甲基化可與分離自不具有結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常傾向的對(duì)象的至少一種核酸的甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較。如本文所使用，“傾向”指容易發(fā)生細(xì)胞增殖異常的特性。具有細(xì)胞增殖異常傾向的對(duì)象還沒有細(xì)胞增殖異常，但該對(duì)象發(fā)生細(xì)胞增殖異常的可能性較高。另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常的方法，所述方法包括將包含核酸的樣品與能夠確定所述樣品的甲基化狀態(tài)的試劑相接觸，并確定所述至少一種核酸的至少一個(gè)區(qū)域的甲基化。這里，所述至少一種核酸的至少一個(gè)區(qū)域的甲基化不同于無異常生長細(xì)胞的對(duì)象中存在的相同核酸區(qū)域的甲基化階段。本發(fā)明的方法包含確定分離自對(duì)象的至少一種核酸的至少一個(gè)區(qū)域的甲基化的步驟。本文所使用的術(shù)語“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸，核苷酸或多核苷酸，或它們的片段，或者基因組或合成來源的單鏈或雙聯(lián)DNA或RNA，基因組或合成來源的正義鏈或反義鏈DNA或RNA，肽核酸(PNA)，或任何天然或合成來源的類DNA或類RNA材料。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，當(dāng)所述核酸是RNA時(shí)，脫氧核糖核苷酸A，G，C和T分別被核糖核苷酸A，G，C和U替代。任何核酸均可用于本發(fā)明，只要其中差別化甲基化的CpG島的存在可被檢測(cè)到。所述CpG島是核酸序列中富含CpG的區(qū)域。甲基化本發(fā)明中，任何核酸樣品，純化或非純化形式的，均可使用，只要其包含或疑似包含含有靶位點(diǎn)的核酸序列(例如包含CpG的核酸)。一種能夠被差別化甲基化的核酸區(qū)域是CpG島，即一種相對(duì)于其他核酸區(qū)域來說CpG 二核苷酸的密度較高的核酸序列。所述CpG 二核苷酸在脊椎動(dòng)物DNA中的出現(xiàn)機(jī)率僅為由G*C堿基對(duì)的比例預(yù)測(cè)得到的機(jī)率的大約20%。在某些區(qū)域中，CpG 二核苷酸的密度達(dá)到預(yù)測(cè)值；相對(duì)于所述基因組的其他區(qū)域，密度增加了十倍。與主體DNA (bulk DNA)中40%的平均G*C含量相比，CpG島的平均G*C含量約為60%。所述CpG島采取典型地約1-2千個(gè)堿基長度的DNA延伸(stretches)形式。人類基因組中約有45，000個(gè)CpG島。許多基因中，所述CpG島始于啟動(dòng)子的緊上游，并向下游延伸至轉(zhuǎn)錄區(qū)域。啟動(dòng)子處的CpG島的甲基化通常抑制了所述基因的表達(dá)。所述CpG島也可位于所述基因的編碼區(qū)域的5’區(qū)域以及3’區(qū)域附近。因此，CpG島可見諸于核酸序列的多個(gè)區(qū)域，包括在處于包含啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控區(qū)域內(nèi)的編碼序列的上游，在編碼區(qū)域中(例如外顯子)，在處于例如增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的編碼區(qū)域的下游，，以及在內(nèi)含子中。典型地，所述包含CpG的核酸是DNA。然而，本發(fā)明的方法可采用，例如包含DNA的樣品，或者含mRNA的DNA和RNA樣品，其中DNA或者RNA可為單鏈或雙鏈，或者所述樣品可包括DNA-RNA雜交體。
還可使用核酸混合物。待檢測(cè)的特異性核酸序列可以是較大分子的片段，或者可以最初以不連續(xù)的分子存在，由此所述特異性序列構(gòu)成了完整的核酸。待研究的序列最初不必以純的形式存在；所述核酸可以是復(fù)雜混合物的較小片段，例如包含在整個(gè)人類DNA中。包含在用來檢測(cè)甲基化CpG島的樣品中的核酸可通過不同的技術(shù)提取，例如由 Sambrook 等人描述的方法(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, N. Y.，1989)。分離自對(duì)象的核酸從所述對(duì)象的生物樣品中獲得。如果希望檢測(cè)結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸癌的進(jìn)展階段，可通過刮取或切片方式從結(jié)腸直腸組織中分離所述核酸。這種樣品可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種醫(yī)療程序獲取。在本發(fā)明的一方面中，獲自對(duì)象的樣品中的核酸的甲基化狀態(tài)與沒有結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常的對(duì)象中的相同核酸區(qū)域相比較，發(fā)生了高度甲基化。如本文所使用的高度甲基化是指在一種或多種核酸中甲基化等位基因的存在。當(dāng)檢查相同的核酸時(shí)，來自沒有結(jié)腸直腸組織細(xì)胞增殖異常的對(duì)象的核酸中不含可檢測(cè)到的甲基化等位基因。單個(gè)基因和基因組合可以理解，本發(fā)明的實(shí)踐可以分別將每個(gè)基因作為診斷或預(yù)后標(biāo)志物，也可以將幾個(gè)標(biāo)志物基因組合成基因組合顯示的形式，以便可以檢測(cè)數(shù)個(gè)標(biāo)志物基因而獲得甲基化基因的總覽圖或列表，從而增加可靠性和效率。另外，本發(fā)明中鑒定的任何基因都可單獨(dú)使用，或者作為一組基因，與本文所引用的任何其他基因以任意的組合使用?；蛘撸筛鶕?jù)基因的重要性排位和加權(quán)，并結(jié)合發(fā)生甲基化的基因的數(shù)量，指定癌癥發(fā)展的可能性水平。這種算法處于本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。檢測(cè)甲基化的方法甲基化特異件PCR當(dāng)基因組DNA經(jīng)亞硫酸鹽處理時(shí)，如果被甲基化，5’ -CpG’ _3區(qū)域的胞嘧啶保持完整，但如果未被甲基化，胞嘧啶就轉(zhuǎn)變成尿嘧啶。據(jù)此，基于亞硫酸鹽處理后轉(zhuǎn)變的堿基序列，構(gòu)建與具有5’-CpG-3’堿基序列的區(qū)域?qū)?yīng)的PCR引物組。這里，所構(gòu)建的引物組有兩種引物組對(duì)應(yīng)于甲基化堿基序列的引物組，以及對(duì)應(yīng)于非甲基化堿基序列的引物組。當(dāng)基因組DNA經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變，然后使用上述兩種引物組通過PCR擴(kuò)增時(shí)，如果所述基因組DNA被甲基化，則使用對(duì)應(yīng)于甲基化堿基序列的引物的PCR混合物中可以檢測(cè)到所述PCR產(chǎn)物，但如果所述基因組DNA未被甲基化，則使用對(duì)應(yīng)于非甲基化堿基序列的引物的PCR混合物中可以檢測(cè)到所述基因組DNA。該甲基化可通過瓊脂糖凝膠電泳定量分析。實(shí)時(shí)甲某化特異件PCR實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR是一種由甲基化特異性PCR方法改良得到的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，包括用亞硫酸鹽處理基因組DNA，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于所述甲基化堿基序列的PCR引物，以及使用該引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。檢測(cè)基因組DNA甲基化的方法包括兩種一種是使用與擴(kuò)增的堿基序列互補(bǔ)的Tanman探針來檢測(cè)的方法；以及另一種是使用Sybergreen檢測(cè)的方法。因此，所述實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR允許對(duì)甲基化的DNA進(jìn)行選擇性定量分析。這里，使用體外甲基化的DNA樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且還擴(kuò)增了堿基序列中不含5’ -CpG-3’序列的基因，作為陰性對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)用于定量分析所述甲基化程度。焦磷酸測(cè)序 所述焦磷酸測(cè)序法是一種由亞硫酸鹽測(cè)序法改良而來的定量實(shí)時(shí)測(cè)序方法。與亞硫酸鹽測(cè)序法類似，基因組DNA經(jīng)亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化，接著構(gòu)建與不含5’ -CpG-3’堿基序列的區(qū)域?qū)?yīng)的PCR引物。具體地，所述基因組DNA經(jīng)亞硫酸鹽處理，使用所述PCR引物擴(kuò)增，然后使用測(cè)序引物進(jìn)行實(shí)時(shí)堿基序列分析。通過分析5’-CpG-3’區(qū)域中的胞嘧啶和胸腺嘧啶含量，來表示甲基化的程度以作為甲基化指數(shù)。使用甲基化DNA特異件結(jié)合蛋白的PCR,定量PCR,以及DNA芯片試驗(yàn)當(dāng)僅特異性結(jié)合甲基化DNA的蛋白與DNA混合時(shí)，所述蛋白僅特異性結(jié)合所述甲基化DNA。因此，使用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白的PCR或者使用DNA芯片試驗(yàn)都允許僅選擇性地分離甲基化DNA。將基因組DNA與甲基化特異性結(jié)合蛋白混合，然后僅有甲基化DNA被選擇性分離出來。所述分離的DNA利用與所述啟動(dòng)子區(qū)域?qū)?yīng)的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，接著通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所述DNA的甲基化。另外，DNA甲基化還能通過定量PCR方法檢測(cè)，通過甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白分離出來的甲基化DNA能被熒光探針標(biāo)記，并能與包含互補(bǔ)探針的DNA芯片雜交，從而測(cè)量所述DNA的甲基化。這里，所述甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白可以是，但不限于McrBt。差別化甲基化檢測(cè)一甲基化敏感的限制件內(nèi)切酶差別化甲基化的檢測(cè)可通過將核酸樣品與僅切割非甲基化CpG位點(diǎn)的甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶相接觸而進(jìn)行。在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，將所述樣品進(jìn)一步與所述甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的同切酶(isoschizomer)相接觸,所述同切酶對(duì)甲基化和非甲基化CpG位點(diǎn)都切割，從而切割甲基化核酸。將特異性引物添加至所述核酸樣品，并通過任意常規(guī)方法擴(kuò)增所述核酸。經(jīng)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶處理的樣品中存在擴(kuò)增產(chǎn)物，但經(jīng)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的同切酶處理的樣品中不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，這表明被試的核酸區(qū)域發(fā)生了甲基化。然而，經(jīng)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶處理的樣品中不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，與此同時(shí)經(jīng)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的同切酶處理的樣品中也不存在擴(kuò)增產(chǎn)物，這表明被試的核酸區(qū)域未發(fā)生甲基化。如本文所使用，術(shù)語“甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶”指一種限制性內(nèi)切酶(例如Smal)，所述酶包括CG作為其識(shí)別位點(diǎn)的一部分，并且當(dāng)C被甲基化時(shí)，與C不被甲基化的情況相比，所述酶具有活性。所述甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的非限制性例子包括MspI, HpaII, BssHII, BstUI以及Notl。這類酶可以單獨(dú)或組合使用。其他甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的例子包括，但不限于SacII及EagI。所述甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的同切酶是一種與所述甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶識(shí)別相同識(shí)別位點(diǎn)，但對(duì)甲基化和非甲基化CG都切割的限制性內(nèi)切酶。所述甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶的同切酶的例子包括MspI。本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)成與待擴(kuò)增位點(diǎn)的每個(gè)鏈“實(shí)質(zhì)性”互補(bǔ)，并如上所討論包括適當(dāng)?shù)腉或C核苷酸。這意味著所述引物在聚合反應(yīng)條件下必須與其各自鏈實(shí)質(zhì)性互補(bǔ)以便雜交。本發(fā)明的引物用于所述擴(kuò)增過程，這是一種酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如PCR)，其中通過若干反應(yīng)步驟使靶位點(diǎn)呈指數(shù)級(jí)增加。典型地，一條引物與所述位點(diǎn)的負(fù)(_)鏈同源(反義引物)，另一條引物與正(+ )鏈同源(正義引物)。當(dāng)所述引物退火以使核酸變性后，所述核酸鏈通過酶例如DNA聚合酶I (Klenow)和反應(yīng)物例如核苷酸進(jìn)行延伸，結(jié)果,新合成了包含所述靶位點(diǎn)序列的正鏈和負(fù)鏈。當(dāng)所述新合成的靶位點(diǎn)用作模板并經(jīng)過變性、引物退火以及延伸的重復(fù)循環(huán)時(shí)，所述靶位點(diǎn)序列發(fā)生了指數(shù)級(jí)的合成。所得到的反應(yīng)產(chǎn)物是不連續(xù)的核酸雙鏈，該核酸雙鏈的末端對(duì)應(yīng)于所使用的特異性引物的末端。所述擴(kuò)增反應(yīng)為本領(lǐng)域所通用的PCR。然而，也可使用替代性方法，例如實(shí)時(shí)PCR或利用等溫酶的線性擴(kuò)增。另外，也可使用多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。差別化甲基化檢測(cè)-亞硫酸鹽測(cè)序法另一種用于檢測(cè)包含甲基化CpG的核酸的方法包括步驟將包含核酸的樣品與修飾非甲基化胞嘧啶的試劑相接觸；使用CpG特異性寡核苷酸引物擴(kuò)增樣品中包含CpG的核酸，其中所述寡核苷酸引物可區(qū)分經(jīng)修飾的甲基化核酸和非甲基化核酸，并可檢測(cè)到甲基化核酸。所述擴(kuò)增步驟是可選的且可取的，但并不必需。所述方法依靠所述PCR反應(yīng)以區(qū)分經(jīng)修飾(例如化學(xué)修飾)的甲基化DNA和非甲基化DNA。這種方法在編號(hào)為No. 5，786，146，涉及用于檢測(cè)甲基化核酸的亞硫酸鹽測(cè)序的美國專利中有描述。試劑盒本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)對(duì)象中細(xì)胞增殖異常的試劑盒。本發(fā)明的所述試劑盒包括分區(qū)以在其中容納樣品的載體工具，一個(gè)或多個(gè)容器，所述容器包含容納用于擴(kuò)增5’-CpG-3’堿基序列的PCR引物的第二容器，和容納用于對(duì)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的測(cè)序引物的第三容器。載體工具適于容納一個(gè)或多個(gè)容器，例如瓶子、試管及類似物，每個(gè)所述容器包含所述方法中用到的一個(gè)單獨(dú)的成分?；诒疚奶峁┑膶?duì)該創(chuàng)造性方法的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定所述容器中配備的必要試劑?；|(zhì)在所述靶核酸區(qū)域擴(kuò)增后，所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物能與附著在固相支持體(基質(zhì))上的已知基因探針雜交，從而檢測(cè)所述核酸序列的存在。如這里所使用，術(shù)語“基質(zhì)”，當(dāng)涉及物質(zhì)、結(jié)構(gòu)、表面或材料時(shí)，是指包含非生物的、合成的、無生命的、平坦或圓形表面的合成物，所述合成物迄今為止尚不知道包含特異性結(jié)合、雜交或催化識(shí)別位點(diǎn)，或多個(gè)不同的識(shí)別位點(diǎn)或者超出構(gòu)成所述表面、結(jié)構(gòu)或材料的不同分子種類的數(shù)量的數(shù)個(gè)不同的識(shí)別位點(diǎn)。所述基質(zhì)的例子包括，但不限于半導(dǎo)體、合、成(有機(jī))金屬、合成半導(dǎo)體、絕緣體和摻雜劑；金屬、合金、單質(zhì)、化合物和礦物質(zhì)；合成、切害I]、蝕刻、印刷、打印、機(jī)器加工及微制造的載片、裝置、結(jié)構(gòu)和表面；工業(yè)聚合物、塑料、薄膜硅、硅酸鹽、玻璃、金屬和陶瓷；以及木頭、紙、硬紙板、棉、羊毛、布、紡織和非紡織纖維、材料和纖維織物；以及兩性表面。本領(lǐng)域知曉一些能附著核酸序列的膜類型。這些膜的特殊但非限制性例子包括硝酸纖維素膜或其他用于檢測(cè)基因表達(dá)的膜，例如聚氯乙烯、重氮化紙以及其他市場(chǎng)上可買到的膜，例如GENESCREEN 、ZETAPROBE (Biorad)以及NYTRAN 。還包括珠、玻璃、晶片以及金屬基質(zhì)。用于將核酸附著在這些物體上的方法是本領(lǐng)域周知的。或者，可以在液相中進(jìn)行篩選。雜奪備件在核酸雜交反應(yīng)中，用于實(shí)現(xiàn)特定嚴(yán)格水平的條件根據(jù)被雜交核酸的性質(zhì)而有所不同。例如，在選擇雜交條件時(shí)可考慮核酸雜交區(qū)域的長度、互補(bǔ)程度、核苷酸序列組成(例如，GC/AT含量)以及核酸類型(例如RNA/DNA)。另外的考慮因素是所述核酸之一是否固定， 例如固定在濾紙上。以下是漸趨嚴(yán)格的條件的例子2X SSC/0. 1%SDS,室溫(雜交條件)；0. 2XSSC/0. 1%SDS，室溫(低嚴(yán)格條件);0. 2X SSC/0. 1%SDS，42°C(中等嚴(yán)格條件);以及 0. IX SSC,680C (高嚴(yán)格條件)?？梢詢H用這些條件中的一種，例如高嚴(yán)格條件，進(jìn)行清洗，或可每種條件均使用，例如，按上述順序各清洗10-15分鐘，重復(fù)所列步驟中的任意或全部。然而，如上所述，優(yōu)化條件根據(jù)所涉及的特定雜交條件而有所不同，并可以憑經(jīng)驗(yàn)確定。通常，高嚴(yán)格條件用于目的探針的雜交。標(biāo)記所述目的探針可以被可檢測(cè)地標(biāo)記，例如用放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合物或酶可檢測(cè)地標(biāo)記。這些探針的適當(dāng)標(biāo)記為本領(lǐng)域周知，并能通過任意常規(guī)的方法實(shí)施。
實(shí)施例下文中將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的描述。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，顯而易見的是，這些實(shí)施例僅起說明的目的，不能理解成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例I :結(jié)腸直腸癌特異性甲基化基因的發(fā)現(xiàn)為了篩選在結(jié)腸直腸癌中特異性甲基化的生物標(biāo)志物，將來自2個(gè)正常人的基因組DNA和來自12名結(jié)腸直腸癌患者的癌組織和相鄰正常組織的基因組DNA各500ng進(jìn)行超聲處理(Vibra Cell, S0NICS)，由此構(gòu)建約200_300bp的基因組DNA片段。為了從所述基因組DNA中僅獲取甲基化DNA，使用已知能結(jié)合甲基化DNA的甲基結(jié)合域(MBD) (Fraga et al.，NucleicAcidRes.，31:1765，2003)。具體地，將 2iig6XHis標(biāo)記的MBD2bt與500ng大腸桿菌JMllO (No. 2638，生物資源中心，韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院(Biological Resource Center, Korea Research Instituteof Bioscience&Biotechnology))的基因組DNA預(yù)先溫育，然后結(jié)合到Ni-NTA磁珠(Qiagen，美國)上。將經(jīng)超聲處理的分離自正常人和結(jié)腸直腸癌患者的基因組DNA各 500ng，在結(jié)合緩沖液(IOmMTris-HCl (pH 7. 5)，50mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT, 3mMMgCl2, 0. l%Triton-X100, 5%甘油，25mg/ml BSA)存在的條件下與所述磁珠于4°C反應(yīng)20分鐘。接著，用500iiL包含700mM NaCl的結(jié)合緩沖液清洗所述磁珠三遍，然后用QiaQuickPCR純化試劑盒(Qiagen，美國)分離與MBD2bt結(jié)合的甲基化DNA。接下來，用基因組DNA擴(kuò)增試劑盒(Sigma，美國，Cat. No. WGA2)擴(kuò)增與MBD2bt結(jié)合的甲基化DNA,并用BioPrime全基因組標(biāo)記系統(tǒng)I (BioPrime Total Genomic Labelingsystem I, Invitrogen公司，美國)對(duì)4 ii g經(jīng)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行Cy4標(biāo)記。為了間接比較正常人和結(jié)腸直腸癌患者之間的甲基化程度，構(gòu)建參考DNA。這里，所述參考DNA這樣構(gòu)建，使相同數(shù)量的來自12個(gè)結(jié)腸直腸癌患者的基因組DNA彼此混合，用基因組DNA擴(kuò)增試劑盒(Sigma，美國，Cat. No. WGA2)擴(kuò)增所述基因組DNA混合物，并用BioPrime全基因組標(biāo)記系統(tǒng)
I(Invitrogen公司，美國)對(duì)4 y g所述經(jīng)擴(kuò)增的基因組DNA進(jìn)行Cy3標(biāo)記。將參考DNA與正常人和結(jié)腸直腸癌患者的DNA分別混合，然后與244K人CpG微陣列(Agilent，美國)雜交(附圖I)。雜交后，將所述DNA混合物經(jīng)一系列清洗過程，然后用Agilent掃描儀掃描。利用特征抽取程序V. 9. 5. 3. I (Feature Extraction program,Agilent),通過計(jì)算正常人和結(jié)腸直腸癌患者樣品間的信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)差異，計(jì)算來自所述微陣列圖像的信號(hào)值。為了篩選具有可靠雜交信號(hào)的探針，使用GeneSpring 7. 3程序(Agilent，美國)，通過交叉基因誤差模型篩選了總共26個(gè)陣列之中的至少21個(gè)陣列中的64，325個(gè)Cy3信號(hào)值超過112. 8的探針。為了從上述探針中篩選在結(jié)腸直腸癌中高度甲基化的探針，實(shí)施兩種分析方法。在第一種分析方法中，將正常人的結(jié)腸直腸組織和與結(jié)腸直腸癌組織相鄰的看似正常的組織作為同一組，為了篩選與結(jié)腸直腸癌組織相比表現(xiàn)出差別化甲基化的探針，實(shí)施方差分析(ANOVA test)，從而篩選出4，498個(gè)探針(p〈0. 05)。從這些探針中，進(jìn)一步篩選出1，560個(gè)在結(jié)腸直腸癌組織中高度甲基化的探針，并從這些探針中選定4個(gè)生物標(biāo)志物候選基因(CHSTll, IRX5, KCNAI, SDC2和S0RCS3)，這4個(gè)候選基因在約400bp距離的范圍內(nèi)存在的兩個(gè)或多個(gè)相鄰探針中表現(xiàn)出高甲基化(附圖2)。在第二種分析方法中，為了發(fā)現(xiàn)適于早期診斷的生物標(biāo)志物，所述結(jié)腸直腸癌組織和相鄰與該結(jié)腸直腸癌組織的看似正常組織作為同一組，實(shí)施方差分析(ANOVA test)，從而篩選出3，242個(gè)與正常人結(jié)腸直腸組織相比表現(xiàn)出差別化甲基化的探針(P〈0. 01)。從這3，242個(gè)探針中，篩選出705個(gè)在結(jié)腸直腸癌組織和相鄰于結(jié)腸直腸癌組織的看似正常組織中表現(xiàn)出高度甲基化的探針。從這些篩選出的探針中，選定6個(gè)生物標(biāo)志物候選基因(CHST11，IRXl, IRX5, KCNA1, SMl和S0RCS3)，這6個(gè)候選基因在約400bp距離范圍內(nèi)存在的兩個(gè)或多個(gè)相鄰探針中表現(xiàn)出高甲基化(附圖2)。在使用上述兩種分析方法選定的生物標(biāo)志物候選基因中，有4個(gè)確定為共同的基因，因此，總共得到7個(gè)生物標(biāo)志物候選基因(表I)。另外，利用MethPrimer (http://itsa.ucsf. edu/ urolab/methprimer/indexl. html)分析與在CpG微陣列中表現(xiàn)出高度甲基化的7個(gè)基因中的每個(gè)探針對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，從而確定所述探針中的CpG島。[表I]用于結(jié)腸直腸癌診斷的甲基化生物標(biāo)志物候選基因列表
候選基因探針位置aIGenBank編| M
號(hào)
CHSTll +501,+605_NM—018413糖(軟骨蛋白4)磺基轉(zhuǎn)移酶11IRXl +809，+956, +1,021, NM 024337 易洛魁同源框蛋白 Kiroquois+1,097homeobox I)
IRX5 +2,647, +2,724 NM 005853 易洛魁同源框蛋白 5(iroquois
homeobox 5)
KCNAl -1,853,-1,612 NM—000217鉀電壓門控型通道，混合器
相關(guān)亞家族成員I (帶肌纖維 ___顫搐的陣發(fā)性共濟(jì)失調(diào))
SDC2 +1,168，+1,282 NM 002998 多配體蛋丨:..j 聚糖 2SIMl -1,242,-1,178 NM 005068 單意同源物 I (果蠅)_SORC.S3 +1,478, +1,519 NM 014978 分揀蛋白相關(guān)的含 VPS10 域___的受體3_a’距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)的堿基對(duì)(bp)實(shí)施例2 :檢測(cè)癌細(xì)胞系中生物標(biāo)志物基因的甲基化為了進(jìn)一步證實(shí)實(shí)施例I中選定的生物標(biāo)志物候選基因的甲基化狀態(tài)，對(duì)每個(gè)基因的啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。為了用亞硫酸鹽將非甲基化的胞嘧啶修飾成尿嘧啶，從結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系Caco-2 (KCLB No. 30037. I)和 HCT116(KCLB No. 10247)中分離總基因組 DNA，并采用 EZ DNA甲基化-金標(biāo)試劑盒(Zymo Research,美國)用亞硫酸鹽處理200ng所述基因組DNA。當(dāng)所述DNA用亞硫酸鹽處理時(shí)，非甲基化的胞嘧啶修飾成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。將亞硫酸鹽處理后的DNA在20 Ul無菌蒸餾水中洗提，并進(jìn)行焦硫酸測(cè)序。使用PSQ試驗(yàn)設(shè)計(jì)程序(Biotage，美國)對(duì)所述7個(gè)基因設(shè)計(jì)PCR引物以及用于焦磷酸測(cè)序的測(cè)序引物。用于檢測(cè)各基因甲基化的PCR引物和測(cè)序引物如下表2和3所示。[表2] PCR 引物

權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)用于結(jié)腸直腸癌診斷的結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物基因的甲基化的方法，所述方法包括步驟 Ca)制備包含DNA的臨床樣品；以及 (b)檢測(cè)所述臨床樣品DNA中至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子CpG島的甲基化 (i)SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖2); (ii)SIMl(NM_05068,單意同源物1(果蠅)；以及 (iii)S0RCS3 (NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。
2.權(quán)利要求I的所述方法，其中步驟(b)通過檢測(cè)所述基因的內(nèi)含子區(qū)域中CpG島的甲基化來實(shí)施。
3.權(quán)利要求I的所述方法，其中步驟(b)通過檢測(cè)包含SEQID NO :1核苷酸序列的SDC2基因的內(nèi)含子區(qū)域中CpG島的甲基化來實(shí)施。
4.權(quán)利要求I的所述方法，其中步驟(b)通過檢測(cè)包含SEQID NO :2核苷酸序列的SIMl基因的啟動(dòng)子區(qū)域中CpG島的甲基化來實(shí)施。
5.權(quán)利要求I的所述方法，其中步驟(b)通過檢測(cè)包含SEQID NO :3核苷酸序列的SORCS3基因的內(nèi)含子區(qū)域中CpG島的甲基化來實(shí)施。
6.權(quán)利要求I的所述方法，其中步驟(b)通過選自由PCR、甲基化特異性PCR、實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR、利用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白的PCR試驗(yàn)、定量PCR、基于DNA芯片的試驗(yàn)、焦磷酸測(cè)序以及亞硫酸鹽測(cè)序組成的組中的方法來實(shí)施。
7.權(quán)利要求I的所述方法，其中所述臨床樣品選自由來自疑似癌癥患者或待診斷對(duì)象的組織、細(xì)胞、血液、血漿、糞便以及尿液組成的組。
8.一種用于診斷結(jié)腸直腸癌的組合物，所述組合物包含至少一個(gè)如下基因的CpG島或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子的CpG島 (i)SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖2); (ii)SIMl(NM_05068,單意同源物1(果蠅)；以及 (iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。
9.權(quán)利要求8的所述組合物，其中所述CpG島位于所述基因的內(nèi)含子區(qū)域中。
10.權(quán)利要求8的所述組合物，其中所述CpG島位于包含SEQID NO :1核苷酸序列的SDC2基因的所述內(nèi)含子區(qū)域中。
11.權(quán)利要求8的所述組合物，其中所述CpG島位于包含SEQID NO :2核苷酸序列的SIMl基因的所述啟動(dòng)子區(qū)域中。
12.權(quán)利要求8的所述組合物，其中所述CpG島位于包含SEQID NO :3核苷酸序列的SORCS3基因的所述內(nèi)含子區(qū)域中。
13.用于診斷結(jié)腸直腸癌的試劑盒，所述試劑盒包含 用于擴(kuò)增包含至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子的CpG島的片段的PCR引物對(duì)；以及 用于對(duì)通過所述引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的測(cè)序引物 (i)SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖2); (ii)SIMl(NM_05068,單意同源物1(果蠅)；以及(iii) S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。
14.權(quán)利要求13的所述試劑盒，其中所述PCR引物對(duì)選自由SEQID NO:12和13引物對(duì)、SEQ ID NO: 14和15引物對(duì)以及SEQ ID NO: 16和17引物對(duì)組成的組。
15.權(quán)利要求13的所述試劑盒，其中所述測(cè)序引物選自由SEQID NO:22到24的引物組成的組。
16.用于診斷結(jié)腸直腸癌的核酸芯片，所述芯片上固定有探針，所述探針能與包含至少一個(gè)如下基因的CpG島的、或所述至少一個(gè)基因的啟動(dòng)子的CpG島的片段在嚴(yán)格條件下雜交 (i)SDC2 (NM_002998,多配體蛋白聚糖2); (ii)SIMl (NM_05068,單意同源物I)(果蠅);以及 (iii)S0RCS3(NM_014978,分揀蛋白相關(guān)的含VPSlO域的受體3)。
17.權(quán)利要求16的所述核酸芯片，其中所述探針選自由SEQID NO:33到44所示的堿基序列組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)結(jié)腸直腸癌診斷用的結(jié)腸直腸癌特異性甲基化標(biāo)志物基因的甲基化的方法，尤其涉及檢測(cè)結(jié)腸直腸癌特異性標(biāo)志物基因的方法，該基因在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中被特異性地甲基化，從而為診斷結(jié)腸直腸癌提供信息。用于檢測(cè)甲基化的所述創(chuàng)造性方法和用于診斷結(jié)腸直腸癌的所述創(chuàng)造性組合物、試劑盒以及核酸芯片的應(yīng)用，使得在轉(zhuǎn)化早期診斷結(jié)腸直腸癌成為可能，從而能夠在早期診斷結(jié)腸直腸癌。另外，所述創(chuàng)造性方法使結(jié)腸直腸癌能以與傳統(tǒng)方法相比更準(zhǔn)確而快速的方式有效地診斷。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102686744SQ201080056594
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者吳泰禎, 安城皖, 文永鎬, 鄭賢哲 申請(qǐng)人:基因特力株式會(huì)社