專利名稱：年齡相關(guān)黃斑變性中的遺傳多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及人疾病的治療。更具體而言，本發(fā)明涉及濕性年齡相關(guān)黃斑變性、age_relatecl macular degeneration, AMD) 發(fā)明背景 AMD是老年人中嚴重的、不可逆的視カ損失(vision loss)的ー項主要原因。Bressler(2004)JAMA 291:1900-01。它以一大批臨床和病理發(fā)現(xiàn)為特征，包括稱為玻璃疣的淺黃色斑、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的破壞、脈絡(luò)膜新血管化(CNV)、和盤狀黃斑變性。該疾病分類成兩種形式非滲出性(干性)和滲出性(濕性或新血管性)。最近，已經(jīng)開發(fā)出幾種用于治療濕性AMD的療法使用維替泊芬(verteporfin) (Visudyne )的光動力學(xué)療法；一種VEGF結(jié)合適體，即哌加他尼(pegaptanib) (Macugen );和ー種抗VEGF抗體片段，即雷尼珠單抗(ranibizumab) (Lucentis ⑩)。在特定基因中的不同等位基因?qū)е虏煌硇?，包括疾病形成或進展和對治療性藥物的響應(yīng)時，群體中發(fā)生遺傳多態(tài)性。已經(jīng)鑒定出與AMD形成或進展有關(guān)的多種多態(tài)性(例如，Despriet 等(2007) Arch. Ophthalmol. 125:1270-71; Seddon 等(2007) JAMA297:1793-99，2585;Boon 等(2008)Am. J. Human Genet. 82:516-23)。先前的工作已經(jīng)顯示了補體因子H(CFH)基因的氨基酸第402位的特定多態(tài)性與對針對AMD的用維替泊芬的I3DT或核準(zhǔn)標(biāo)示外使用的貝伐單抗(bevacizumab)療法的響應(yīng)有關(guān)(Brantley等(2008)Eye 2月 22 日在線發(fā)表，第 I 頁-第 6 頁；Brantley 等(2007)Ophthalmologyl 14:2168-73)?？梢允褂门c疾病形成有關(guān)的和/或預(yù)測特定療法的效カ或安全性的其它多態(tài)性的鑒定結(jié)果來為會最好地受益于它們的那些患者調(diào)整療法。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于預(yù)測AMD風(fēng)險或用高親和カ抗VEGF抗體治療會使AMD患者受益的可能性升高的遺傳多肽性的鑒定。在一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用高親和カ抗VEGF抗體治療的可能性的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選基質(zhì)金屬蛋白酶25基因(MMP25)等位基因中與rsl064875對應(yīng)的基因組多態(tài)性，其中若對應(yīng)的基因型包含AA或AG，則所述患者具有升高的受益于所述治療的可能性。在一些實施方案中，基因型包含AA。在一些實施方案中，基因型包含AG。在另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗體治療的可能性的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選盤基菌蛋白(discoidin)域受體家族成員2基因(DDR2)等位基因中與rsl0917583對應(yīng)的基因組多態(tài)性，其中若對應(yīng)的基因型包含AA或AC，則所述患者具有升高的受益于所述治療的可能性。在一些實施方案中，基因型包含AA。在一些實施方案中，基因型包含AC。在另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗體治療的可能性的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子ATF樣(BATF)等位基因中與rsl75714對應(yīng)的基因組多態(tài)性，其中若對應(yīng)的基因型包含AA或AG，則所述患者具有升高的受益于所述治療的可能性。在一些實施方案中，基因型包含AA。在一些實施方案中，基因型包含AG。在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體與由雜交瘤ATCC HB 10709生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. I結(jié)合相同表位。在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體具有重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含下列重鏈互補決定區(qū)(CDR)氨基酸序列CDRHl(GYDFTHYGMN;SEQ ID NO: I)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQ ID NO:2)和raRH3(YPYYYGTSHWYFDV;SEQ ID N0:3)，所述輕鏈可變域包含下列輕鏈⑶R氨基酸序列 CDRLl(SASQDISNYLN;SEQ ID N0:4)、CDRL2(FTSSLHS;SEQ ID NO:5)和CDRL3(QQYSTVPWT;SEQID NO:6) o在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體具有Y0317的重鏈可變域和輕鏈可變域。在一些實施方案中，所述抗VEGF抗體是雷尼珠單抗(ranibizumab)。在另一方面，本發(fā)明提供了ー種用于預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠單抗治療的可能性的試劑盒，其包含對MMP25等位基因中與rsl064875對應(yīng)的A/G多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在一些實施方案中，可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸來擴增包含MMP25等位基因中與rsl064875對應(yīng)的A/G多態(tài)性的部分MMP25基因。在另一方面，本發(fā)明提供了ー種用于預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠單抗治療的可能性的試劑盒，其包含對DDR2等位基因中與rsl0917583對應(yīng)的A/C多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在一些實施方案中，可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸來擴增包含DDR2等位基因中與rsl0917583對應(yīng)的A/C多態(tài)性的部分DDR2基因。在另一方面，本發(fā)明提供了ー種用于預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠單抗治療的可能性的試劑盒，其包含對BATF等位基因中與rsl75714對應(yīng)的A/G多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在一些實施方案中，可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸來擴增包含BATF等位基因中與rsl75714對應(yīng)的A/G多態(tài)性的部分BATF基因。在另一方面，本發(fā)明提供了用于測定患者是否有升高的形成濕性AMD的風(fēng)險的方法，包括對自患者分離的樣品篩選表4或表5中所顯示的ー種或多種等位變體,其中表4或表5中所顯示的ー種或多種等位變體的存在指示所述患者有升高的形成濕性AMD的風(fēng)險。附圖
簡述圖I顯示了根據(jù)來自MMP25、DDR2、和BATF基因的風(fēng)險等位基因總和分層，12個月的Lucentis療法后視敏度的均值變化。發(fā)明詳述除非另有指示，本發(fā)明的實踐會采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)、和免疫學(xué)的常規(guī)技木。此類技術(shù)在下列文獻中完整解釋，諸如“ Molecular Cloning: A LaboratoryManual ”，第二版(Sambrook 等,1989); “Oligonucleotide Synthesis”(Μ· J.Gait 編,1984); “AnimalCell Culture，，(R. I. Freshney 編，1987); “Methods in Enzymology”(AcademicPress, Inc.) ; “Current Protocols in Molecular Biology”(F. M. Ausubel 等編，1987，及周期性更新)；iiPCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mull is 等編，1994)。除非另有定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。Singleton等，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology 第 2 版，J. Wiley&Sons(New York, N. Y. 1994),及 March, Advanced OrganicChemistry Reactions, Mechanisms and Structure第 4版，John ffiley&Sons(New York, N.Y. 1992)給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請中所使用的許多術(shù)語的一般指導(dǎo)。通過提及而完整收錄本文中所引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物。
定義如本文中所使用的，除非上下文另有明確規(guī)定，単數(shù)形式“ー個”、“ー種”和“所述/該”包括復(fù)數(shù)。例如，ー個/種細胞還會包括“多個/種細胞”。術(shù)語“包含”意圖指組合物和方法包括列舉的元件，但不排除其它的。術(shù)語“ VEGF ”和“ VEGF-A ”可互換使用，指165個氨基酸的血管內(nèi)皮細胞生長因子和/或相關(guān)的121、189、和206個氨基酸的血管內(nèi)皮細胞生長因子，如由Leung等Science, 246:1306 (1989)，及 Houck 等 Mol. Endocrin.，5:1806 (1991)所描述的，以及其天然存在的等位和加工形式?！翱筕EGF抗體”指以足夠的親和カ和特異性結(jié)合VEGF的抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗VEGF抗體可以作為治療劑在靶向和干擾牽涉VEGF活性的疾病或狀況中使用?？筕EGF抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同系物諸如VEGF-B或VEGF-C，或其它生長因子諸如P1GF、PDGF或bFGF。ー種優(yōu)選的抗VEGF抗體是如下的單克隆抗體，其與由雜交瘤ATCC HB 10709生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. I結(jié)合相同表位，并且是一種高親和カ抗VEGF抗體?！案哂H和カ抗VEGF抗體”比單克隆抗VEGF抗體A4. 6. I具有好至少10倍的對VEGF的親和カ。優(yōu)選地，抗VEGF抗體是依照WO 98/45331生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體片段，包括包含Y0317的⑶R和/或可變區(qū)的抗體。更優(yōu)選地，抗VEGF抗體是稱為雷尼珠單抗(Lucentis )的抗體片段。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，并且包括單克隆抗體(包括全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?！爸委?處理”指治療性處理和防范性或預(yù)防性措施兩者。需要治療的對象包括已經(jīng)患有病癥的對象及要預(yù)防或延遲病癥的對象。術(shù)語“多態(tài)性”指基因序列中在群體內(nèi)變化的位置。多態(tài)性由不同“等位基因”構(gòu)成?？梢酝ㄟ^其在基因中的位置和那里找到的不同氨基酸或堿基來鑒定此類多態(tài)性的位置。例如，Y402H CFH指示CFH基因中的氨基酸第402位存在著酪氨酸(Y)和組氨酸(H)間的變化。此氨基酸變化是兩種可能的變體堿基C和T (它們是兩種不同等位基因)的結(jié)果。因為基因型由兩個分開的等位基因構(gòu)成，所以可以在任何ー個個體中觀察到幾種可能的變體之任一(例如,對于此例子，CC、CT、_TT)。還給個別多態(tài)性分配本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并在例如NCBI網(wǎng)站可獲得的核苷酸序列變異單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)中使用的獨特標(biāo)識符(“參照 SNP”、“refSNP” 或“rs#”)。術(shù)語“基因型”指細胞或組織樣品中的某種基因的特定等位基因。在上述例子中，CC、CT、或TT是Y402H CFH多態(tài)性方面可能的基因型。術(shù)語“樣品”包括自患者采集的細胞或組織樣品。例如，樣品可以包括皮膚樣品、頰細胞樣品、或血細胞。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方法之任一來實施樣品中的特定基因型的
鑒定。例如，可以通過使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)克隆等位基因并對其測序來實現(xiàn)多態(tài)性的鑒定?；蛘撸梢岳缡褂肞CR來自基因組DNA擴增基因序列，并對產(chǎn)物測序。下文描述了用于對患者的DNA分析給定遺傳基因座處的突變的幾種非限制性方法?？梢允褂肈NA微陣列技術(shù)，例如，供高通量篩選應(yīng)用的DNA芯片裝置和高密度微陣列和較低密度微陣列。用于微陣列制作的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且包括各種噴墨(inkjet)和微噴(microjet)沉積或點樣(spotting)技術(shù)和方法、原位或芯片上(on-chip)光刻寡核苷酸合成方法、和電子DNA探針尋址方法。已經(jīng)在基因表達分析和點突變的基因型分型、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、和短串聯(lián)重復(fù)(STR)領(lǐng)域中成功應(yīng)用DNA微陣列雜交應(yīng)用。別的方法包括干擾RNA微陣列及微陣列與其它方法諸如激光捕獲顯微解剖(laser capture microdissection, LCM)、比較基因組雜交(CGH)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChiP)的組合。見例如，He 等(2007) Adv. Exp. Med. Biol. 593:117-133 及 Heller (2002) Annu. Rev.Biomed. Eng. 4:129-153。其它方法包括 PCR、xMAP、侵入物測定法(invader assay)、質(zhì)譜術(shù)、和焦憐酸測序(pyrosequencing) (Wang 等(2007)Microarray Technology and CancerGene Profiling 叢書 Advances in Experimental Medicine and Biology, pub. SpringerNew York 的第 593 卷)。另ー種檢測方法是使用交疊多態(tài)性位點并且在多態(tài)性區(qū)周圍具有約5，或備選地10，或備選地20，或備選地25，或備選地30個核苷酸的探針來進行等位基因特異性雜交。例如，將能夠與等位變體特異性雜交的幾種探針附著于固相支持物，例如“芯片”。可以通過多種方法，包括石印術(shù)(lithography)來將寡核苷酸結(jié)合至固體支持物。使用這些包含寡核苷酸的芯片(又稱作“ DNA探針陣列”)的突變檢測分析記載于例如Cronin等(1996) HumanMutation 7:244。在其它檢測方法中，有必要首先至少擴增基因的一部分，之后鑒定等位變體?？梢岳缤ㄟ^PCR和/或LCR或本領(lǐng)域中公知的其它方法來實施擴增。在一些情況中，可以通過限制酶分析來顯示來自受試者的DNA中特定等位基因的存在。例如，特定的核苷酸多態(tài)性可以導(dǎo)致包含另ー等位變體的核苷酸序列缺乏的限制性位點的核苷酸序列。在又一個實施方案中，可以使用免于切割劑(諸如核酸酶、羥胺或四氧化鋨及用哌啶)的保護來檢測RNA/RNA、DNA/DNA、或RNA/DNA異雙鏈體中的錯配堿基(見例如，Myersm (1985) Science 230:1242)。一般地，通過提供異雙鏈體開始“錯配切割”技術(shù)，所述異雙鏈體通過雜交任選地標(biāo)記的包含基因等位變體的核苷酸序列的對照核酸(例如RNA或DNA)與自組織樣品獲得的樣品核酸(例如RNA或DNA)形成。用切割雙鏈體諸如基于對照與樣品鏈間的堿基對錯配形成的雙鏈體的單鏈區(qū)的試劑處理雙鏈雙鏈體。例如，可以用RNA酶處理RNA/DNA雙鏈體，及用S I核酸酶處理DNA/DNA雜合物以酶促消化錯配區(qū)?；蛘?，可以用羥胺或四氧化鋨及用哌啶處理DNA/DNA或RNA/DNA雙鏈體以消化錯配區(qū)。在消化錯配區(qū)后，然后將所得的材料在變性聚丙烯酰胺凝膠上根據(jù)大小分開以測定對照和樣品核酸是否具有相同的核苷酸序列或者它們在哪些核苷酸中不同。見例如美國專利 No. 6，455，249;Cotton 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397;Saleeba 等(1992)Meth. Enzymol. 217:286-295。也可以使用電泳遷移率的變化來鑒定特定的等位變體。例如，可以使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)來檢測突變型與野生型核酸間電泳遷移率的差異(Orita等(1989)ProcNatl. Acad. Sci USA 86:2766;Cotton(1993)Mutat. Res. 285:125-144 及 Hayashi (1992)Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79)。將樣品和對照核酸的單鏈DNA片段變性，并容許復(fù)性。單鏈核酸的ニ級結(jié)構(gòu)隨序列而有所變化，所得的電泳遷移率變化實現(xiàn)甚至單個堿基變化的檢出?？梢詫NA片段標(biāo)記或者用經(jīng)標(biāo)記的探針檢測?？梢酝ㄟ^使用RNA(而不是DNA)(其中二級結(jié)構(gòu)對序列變化更敏感)來增強測定法的靈敏性。在另ー個優(yōu)選的實施方案中，主題 方法利用異雙鏈體分析來分離雙鏈異雙鏈體分子，其基于電泳遷移率的變化進行(Keen等(1991) Trends Genet. 7:5)。也可以通過分析包含多態(tài)性區(qū)的核酸在含有變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中的移動來獲得等位變體的身份，其使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測定(Myers等(1985)Nature 313:495)。在使用DGGE作為分析方法時，會將DNA修飾以確保它不完全變性，例如通過PCR添加約40bp高溶點富含GC的DNA的GC夾來實現(xiàn)。在又一個實施方案中，使用溫度梯度來替換變性劑梯度以鑒定對照和樣品DNA的遷移率差異(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys. Chem. 265:1275)。用于檢測2種核酸間的至少ー個核苷酸的差異的技術(shù)的例子包括但不限于選擇性寡核苷酸雜交、選擇性擴增、或選擇性引物延伸。例如，可以制備如下的寡核苷酸探針，其中將已知的多態(tài)性核苷酸放置在中央(等位基因特異性探針)，然后在只有找到完全匹配時才容許雜交的條件下與靶DNA雜交(Saiki等(1986)Nature 324:163) ; Saiki等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230)?？梢允褂么祟惖任换蛱禺愋怨押塑账犭s交技術(shù)來檢測基因多態(tài)性區(qū)中的核苷酸變化。例如，將具有特定等位變體的核苷酸序列的寡核苷酸附著于雜交膜，然后將此膜與經(jīng)標(biāo)記的樣品核酸雜交。然后，對雜交信號的分析會掲示樣品核酸的核苷酸的身份?；蛘撸梢耘c本發(fā)明一起使用依賴于選擇性PCR擴增的等位基因特異性擴增技木。作為引物用于特異性擴增的寡核苷酸可以在分子中央(使得擴增依賴于差別的雜交)(Gibbs等(1989) Nucl. Acids Res. 17:2437-2448)或在一條引物的3’端末端(在那里，在合適的條件下，錯配可以阻止或降低聚合酶延伸)(Prossner (1993) Tibtech 11:238及Newton等(1989) Nucl. Acids Res. 17:2503)攜帶感興趣等位變體。此技術(shù)又稱作“PR0BE”，代表探針寡堿基延伸(PRobe Oligo Base Extension)。另外,可以期望在突變區(qū)中引入新的限制性位點以創(chuàng)建基于切割的檢測(Gasparini等(1992)Mol. Cell. Probes 6:1)。在另ー個實施方案中，使用寡核苷酸連接測定法(OLA)來實施等位變體的鑒定，如記載于例如，美國專利 No. 4，998，617 及 Laridegren, U.等 Science241:1077-1080 (1988)的。OLA方案使用兩種寡核苷酸，其設(shè)計為能夠與靶物的単一鏈的鄰接序列雜交。ー種寡核苷酸與分離標(biāo)志物連接，例如生物素化的，而另一種是可檢測標(biāo)記的。若在靶分子中找到精確的互補序列，則寡核苷酸會雜交，從而其末端鄰接，并創(chuàng)建連接底物。然后，連接容許使用親合素，或另ー種生物素配體來回收經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸。Nickerson，D.A.等已經(jīng)描述了一種組合PCR和OLA屬性的核酸檢測測定法(Nickerson, D. A.等(1990) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87:8923-8927)。在此方法中，使用PCR來實現(xiàn)靶DNA的指數(shù)式擴增，然后使用OLA來檢測。本發(fā)明提供了用于檢測MMP25、DDR2和BATF中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法。因為單核苷酸多態(tài)性側(cè)翼有不變序列區(qū)，所以其分析僅僅需要測定單個變體核苷酸的身份，并且不必測定每名患者的完整基因序列。已經(jīng)開發(fā)出幾種方法來便于分析SNP?？梢酝ㄟ^使用專門化的外切核酸酶抗性核苷酸來檢測單堿基多態(tài)性，如披露于例如美國專利No. 4，656，127的。依照該方法，容許與剛剛在多態(tài)性位點3’的等位序列互補的引物與自特定動物或人獲得的靶分子雜交。若靶分子上的多態(tài)性位點含有與存在的特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互補的核苷酸，則所述衍生物會被摻入雜交引物末端上。此 類摻入使引物對外切核酸酶有抗性，并且由此容許其檢出。因為樣品的外切核酸酶抗性衍生物的身份是已知的，所以引物已經(jīng)變?yōu)閷ν馇泻怂崦赣锌剐缘陌l(fā)現(xiàn)掲示了存在于靶分子的多態(tài)性位點中的核苷酸與反應(yīng)中使用的核苷酸衍生物的核苷酸互補。此方法具有如下的優(yōu)點，即它不需要測定大量的無關(guān)序列數(shù)據(jù)。也可以使用基于溶液的方法來測定多態(tài)性位點的核苷酸的身份(W091/02087)。如上述的，采用與剛剛在多態(tài)性位點3’的等位序列互補的引物。該方法使用經(jīng)標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物來測定該位點的核苷酸的身份，若與多態(tài)性位點的核苷酸互補，則所述經(jīng)標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物會被摻入弓I物的末端上。一種備選的方法記載于WO 92/15712。此方法使用經(jīng)標(biāo)記的終止物與引物的混合物，所述引物與多態(tài)性位點3’的序列互補。如此，摻入的經(jīng)標(biāo)記的終止物通過所評估的靶分子的多態(tài)性位點中存在的核苷酸確定，并且與所述核苷酸互補。該方法通常是ー種異質(zhì)相測定法，其中將引物或靶分子固定化于固相。已經(jīng)描述了用于測定DNA中的多態(tài)性位點的多種其它引物引導(dǎo)的核苷酸摻入規(guī)程(Komher, J. S.等(1989) Nucl. Acids. Res. 17: 7779-7784; Sokolov, B. P. (1990) Nucl.Acids Res. 18:3671;Syvanen, A. -C.,等(1990)Genomics 8:684-692;Kuppuswamy, M.N.等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :1143-1147 ;Prezant, T. R.等(1992)Hum.Mutat. 1:159-164;Ugozzoli, L.等(1992)GATA 9:107-112;Nyren, P.等(1993)Anal.Biochem. 208:171-175)。這些方法均依賴于經(jīng)標(biāo)記的脫氧核苷酸的摻入以區(qū)別多態(tài)性位點處的喊基。此外，應(yīng)當(dāng)理解，可以使用用于檢測基因或基因產(chǎn)物或多態(tài)性變體中的變化的任何上述方法來監(jiān)測治療或療法過程。可以例如通過利用預(yù)包裝的診斷試劑盒，諸如那些在下文所描述的試劑盒來實施本文中所描述的方法，所述試劑盒包含至少ー種探針或引物核酸，其可以方便地使用，例如以測定個體是否具有升高的形成AMD的可能性或者濕性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗體治療的可能性。在上文所描述的診斷和預(yù)后方法中使用的樣品核酸可以自受試者的任何細胞類型或組織獲得。例如，可以通過已知的技術(shù)獲得受試者的體液(例如，血液)。或者，可以對干樣品(例如，毛發(fā)或皮膚)實施核酸測試。本文中所描述的發(fā)明涉及用于測定并鑒定存在于數(shù)種等位基因，包括MMP25、DDR2和BATF等位基因處，分別于rsl064875、rsl0917583和rsl75714處的等位基因的方法和組合物。可以使用探針來直接測定樣品的基因型，或者可以與擴增同時或者在擴增后使用探針。術(shù)語“探針”包括天然存在的或重組的單或雙鏈核酸或化學(xué)合成的核酸。它們可以通過切ロ平移(nick translation)、Klenow填充反應(yīng)、PCR或本領(lǐng)域中已知的其它方法來標(biāo)記。本發(fā)明的探針、其制備和/或標(biāo)記記載于SambiOOk等(1989)見上文。探針可以是適合干與含有本發(fā)明多態(tài)性區(qū)的核酸選擇性雜交的任何長度的多核苷酸。所使用的探針的長度會部分取決于所使用測定法的性質(zhì)和所采用的雜交條件。也可以與多態(tài)性擴增一起使用經(jīng)標(biāo)記的探針。(Holland等(1991)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88:7276-7280)。美國專利No. 5，210，015描述了基于熒光的方法來在PCR期間提供擴增產(chǎn)物的實時測量。此類方法或是已經(jīng)采用插入染料(諸如溴化こ啶)來指示存在的雙鏈DNA的量，或是它們已經(jīng)采用含有熒光-淬滅劑對的探針(又稱為“TaqMan ”方法)，其中在擴增期間切割探針以釋放熒光分子，該熒光分子的濃度與存在的雙鏈DNA的量成比例。在擴增期間，探針在與靶序列雜交時被聚合酶的核酸酶活性消化以引起熒光分子與淬滅劑分子分開，由此使來自報告物分子的熒光出現(xiàn)。TaqMan 方法使用含有報告物分子一淬滅劑分子對的探針，其與含有多態(tài)性的靶多核苷酸區(qū)特異性退火?？梢詫⑻结樃接诒砻嬉宰鳛椤盎蛐酒笔褂??？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)使用此類基因芯片來檢測遺傳變異。在一種技術(shù)中，將寡核苷酸在基因芯片上排列以通過雜交方法，諸如美國專利No. 6，025, 136和6，018, 041中概述的方法實現(xiàn)的測序來測定DNA序列。也可以使用本發(fā)明的探針來對遺傳序列進行熒光檢測。此類技術(shù)已 經(jīng)記載于例如美國專利No. 5，968，740和5，858，659。也可以將探針附于電極表面以電化學(xué)檢測核酸序列，諸如美國專利No. 5,952, 172中及由Kelley, S. O.等(1999)Nucl. AcidsRes. 27:4830-4837 所描述的。另外，作為探針或引物使用的分離的核酸可以修飾為變?yōu)楦€(wěn)定。修飾的例示性的核酸分子包括DNA的氨基磷酸酷、硫代磷酸酯(phosphothioate)和膦酸甲酯類似物(還可見美國專利 No. 5，176，996; 5, 264，564 和 5，256，775)。如本文中所列的，本發(fā)明還提供了用于測定存在于MMP25、DDR2或BATF中的多態(tài)性區(qū)的等位變體類型的診斷方法。在一些實施方案中，該方法使用包含與MMP25、DDR2或BATF的多態(tài)性區(qū)互補的核苷酸序列的探針或引物。因而，本發(fā)明提供了用于實施這些方法的試劑盒。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于測定濕性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗體，包括高親和カ抗VEGF抗體治療的可能性的試劑盒。此類試劑盒含有本文中所描述的ー種或多種組合物和使用說明書。僅舉例而言，本發(fā)明還提供了用于測定濕性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠單抗治療的可能性的試劑盒，其包含對MMP25rsl064875 SNP中的AG多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。對遺傳基因座“特異性”的寡核苷酸結(jié)合基因座的多態(tài)性區(qū)或者在基因座的多態(tài)性區(qū)附近結(jié)合。對于要作為擴增引物使用的寡核苷酸，若引物足夠接近，使得用于生成包含多態(tài)性區(qū)的多核苷酸，則它們是相鄰的。在一個實施方案中，若寡核苷酸在距離多態(tài)性約l_2kb內(nèi)，例如小于Ikb結(jié)合，則它們是相鄰的。特異性寡核苷酸能夠與序列雜交，并且在合適的條件下不會結(jié)合相差單個核苷酸的序列。試劑盒可以包含至少ー種能夠與MMP25、DDR2或BATF的多態(tài)性區(qū)特異性雜交的探針或引物和使用說明書。試劑盒通常包含至少ー種上文所描述的核酸。用于至少擴增MMP25、DDR2或BATF的一部分的試劑盒一般包含兩條引物，其中至少一條能夠與等位變體序列雜交。此類試劑盒適合于通過例如熒光檢測，通過電化學(xué)檢測，或者通過其它檢測來檢測基因型。可以將試劑盒中含有的寡核苷酸(無論作為探針還是引物使用)可檢測標(biāo)記。標(biāo)記物可以直接(例如對于熒光標(biāo)記物)或間接檢測。間接檢測可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何檢測方法，包括生物素-親合素相互作用、抗體結(jié)合等。經(jīng)熒光標(biāo)記的寡核苷酸還可以含有淬滅分子?？梢詫⒐押塑账峤Y(jié)合至表面。在一些實施方案中，表面是硅土(silica)或玻璃。在一些實施方案中，表面是金屬電極。本發(fā)明的其它試劑盒包含至少ー種對于實施測定法必需的試劑。例如，試劑盒可·以包含酶。或者，試劑盒可以包含緩沖液或任何其它必需的試劑。試劑盒可以包含本文中所描述的所有或ー些陽性對照、陰性對照、試劑、引物、測序標(biāo)志物、探針和抗體，用于測定受試者在MMP25、DDR2或BATF的多態(tài)性區(qū)中的基因型。以下實施例僅意圖例示本發(fā)明的實施，而并不作為限制提供。
實施例實施例I :遺傳多態(tài)性及其與AMD發(fā)生和治療結(jié)果的關(guān)聯(lián)樣品和基因型分型將來自Lucentis 樞要試驗(pivotal trial) (MAR I NA、ANCHOR、和 FOCUS)的 250名隱瞞身份(de-identified)的受試者的外周血樣品收集,并分離基因組DNA,所述受試者參與HORIZON延長試驗(extension trial)的DAWN遺傳子研究。分析中使用的所有樣品具有列為“白種人”的自身鑒定人種，并且具有新血管性AMD的確診。樣品由104名男性和146名女性組成，并且基線時的平均年齡是75. 7歲齡。從研究中的所有個體獲得書面知情同意，并且研究方案得到機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。在上文所描述的樣品外，收集102份樣品作為DAWN研究的一部分,產(chǎn)生總共352份總樣品。使用Illumina 550K人HapMap珠陣列來對352份樣品基因型分型。我們使用嚴格質(zhì)量控制(QC)標(biāo)準(zhǔn)來確保最終的分析中包括高質(zhì)量數(shù)據(jù)。具體地，我們a)排除具有大于5%遺漏數(shù)據(jù)的個體，并且b)基于隱性關(guān)聯(lián)性排除個體和基于IBS狀態(tài)(PI Hat>0. 15，在此數(shù)據(jù)集中無ー檢出)排除復(fù)制樣品。我們僅包括具有a)小于5%遺漏數(shù)據(jù)，b)HWEP-值 >lxl(T6，和 c)MAF>0. 01% 的 SNP。使用 PLINK 來實施所有 QC 測試(Purcell 等(2007)Am. J. Hum. Genet. 81, 559-75)。對Lucentis⑩療法響應(yīng)的全基因組關(guān)聯(lián)掃描在MARINA、ANCHOR和FO⑶S試驗期間基于處理狀態(tài)將DAWN樣品分成2組。Lucentis 處理組包括接受劑量 0. 3mg、0. 5mg 或 0. 5mg+PDT 的個體(N=242)。SHAM/PDT組由接受假注射(SHAM)或僅光動力學(xué)療法(TOT)的個體組成(N=IlO)。我們實施全基因組關(guān)聯(lián)掃描以鑒定與12個月的Lucentis 治療后視敏度(VA，以字母測量)變化顯著關(guān)聯(lián)的遺傳變體(表I)。從與VA的均值變化有關(guān)的頂部基因座列表看，我們鑒定出3個含有可能在傷ロ修復(fù)中發(fā)揮作用的基因的基因座(表2)，并且通過對來自MMP25 (rsl064875)、DDR2 (rsl0917583)和BATF (rsl75714)基因座的由每名個體攜帶的風(fēng)險等位基因數(shù)目求和來創(chuàng)建“基因得分”(圖I)。表I :與12個月的Lucentis⑧療法后視敏度變化最相關(guān)的變體的等級次序列表(P〈2xl(T5)。
染色體SNP染色體位置等位基因P值基因符號
(ΒΡ,基于NCBI 構(gòu)件(build) 36)
I rs 10917583160897518G 5.81E-06 DDR2
22 rs95654825867502A 7.10E-06 MIAT
I rs 10494373160885986C 7.98E-06 DDR2
19rs726054451313304C 8.24E-06 IGFL3
22rs960858025862474G 9.70E-06 MiAT
10 rs791309832014665A 1.22E-05 LQC646034
Irs 16843630160936667G 1.27E-05 DDR2
14rs 17571475051609A 1.63E-05 BATF
16rs 10648753042210A 1.68E-05 MMP25
Irs 191033974640705A 1.69E-05 PAPPA2表2 :根據(jù)MMP25、DDR2和BATF基因座處的基因型分層，12個月的Lucentis 治
療時視敏度的均值變化。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用高親和力抗VEGF抗體治療的可能性的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選基質(zhì)金屬蛋白酶25基因(MMP25)等位基因中與rsl064875對應(yīng)的基因組多態(tài)性，其中若對應(yīng)的基因型包含AA或AG，則所述患者具有升高的受益于所述治療的可能性。
2.一種預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗體治療的可能性的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選盤基菌蛋白域受體家族成員2基因(DDR2)等位基因中與rsl0917583對應(yīng)的基因組多態(tài)性，其中若對應(yīng)的基因型包含AA或AC，則所述患者具有升高的受益于所述治療的可能性。
3.一種預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用抗VEGF抗體治療的可能性的方法，包括對自所述患者分離的樣品篩選堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子ATF樣(BATF)等位基因中與rsl75714對應(yīng)的基因組多態(tài)性，其中若對應(yīng)的基因型包含AA或AG，則所述患者具有升高的受益于所述治療的可能性。
4.權(quán)利要求I至3中任一項的方法，其中所述抗VEGF抗體與由雜交瘤ATCC HB10709生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. I結(jié)合相同表位。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗VEGF抗體具有重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含下列重鏈互補決定區(qū)(⑶幻氨基酸序列⑶RH1(GYDFTHYGMN;SEQ ID NO: I)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR;SEQ ID NO:2)和 CDRH3(YPYYYGTSHWYFDV ;SEQ ID NO:3)，所述輕鏈可變域包含下列輕鏈CDR氨基酸序列CDRL1 (SASQDISNYLN; SEQ ID NO: 4),CDRL2(FTSSLHS;SEQ ID NO:5)和 CDRL3(QQYSTVPWT;SEQ ID NO:6)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗VEGF抗體具有Y0317的重鏈可變域和輕鏈可變域。
7.權(quán)利要求I至3中任一項的方法，其中所述抗VEGF抗體是雷尼珠單抗。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述對應(yīng)的基因型包含AA。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述對應(yīng)的基因型包含AG。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述對應(yīng)的基因型包含AA。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述對應(yīng)的基因型包含AC。
12.權(quán)利要求3的方法，其中所述對應(yīng)的基因型包含AA。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所述對應(yīng)的基因型包含AG。
14.一種用于預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠單抗治療的可能性的試劑盒，其包含對MMP25等位基因中與rsl064875對應(yīng)的A/G多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸來擴增包含MMP25等位基因中與rsl064875對應(yīng)的A/G多態(tài)性的部分MMP25基因。
16.一種用于預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠單抗治療的可能性的試劑盒，其包含對DDR2等位基因中與rsl0917583對應(yīng)的A/C多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸來擴增包含DDR2等位基因中與rsl0917583對應(yīng)的A/C多態(tài)性的部分DDR2基因。
18.一種用于預(yù)測濕性AMD患者是否具有升高的受益于用雷尼珠單抗治療的可能性的試劑盒，其包含對BATF等位基因中與rsl75714對應(yīng)的A/G多態(tài)性特異性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中可以使用所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸來擴增包含BATF等位基因中與rsl75714對應(yīng)的A/G多態(tài)性的部分BATF基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測定患者是否有升高的形成濕性AMD的風(fēng)險或者患者是否具有升高的受益于用高親和力抗VEGF抗體治療的可能性的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102686743SQ201080056334
公開日2012年9月19日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日
發(fā)明者R.格雷厄姆 申請人:基因泰克公司