專利名稱：控制植物深根特征的基因Dro1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制植物根的形態(tài)的新基因，以及使用該基因控制植物根形態(tài)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種與植物深根性有關(guān)的新基因，以及使用該基因控制植物深根性的方法。
背景技術(shù)：
目前，世界人口在持續(xù)增加，主要是在發(fā)展中國(guó)家，因此提高糧食生產(chǎn)以供養(yǎng)人口是至關(guān)重要的。然而，由于近年來氣候變遷，例如全球變暖和沙漠化，很難使農(nóng)田獲得穩(wěn)定的降雨。結(jié)果，由于降雨量減少導(dǎo)致的干旱在全球范圍內(nèi)給作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損害。特別是谷物，例如水稻、小麥和玉米，這些幾乎完全靠雨水種植的作物，受干旱損害更加嚴(yán)重。因此，作物育種的一個(gè)重要目標(biāo)是使作物具有抗旱性。
對(duì)于作物，根是一個(gè)關(guān)鍵的表型，與取決于水和養(yǎng)分的吸收等的產(chǎn)量、以及地上部植物體的抗倒伏性、和避旱性相關(guān)。水稻是一種單子葉植物，其根系具有大量的冠根(crown root),在種子根發(fā)育后從節(jié)間伸出。水稻根系統(tǒng)的分布由冠根長(zhǎng)度和其生長(zhǎng)方向決定(Shigenori Morita, Ne no Dezain (Root design)，107 頁(yè)，2003 (非專利文獻(xiàn) I))。在這兩者中，冠根生長(zhǎng)的方向在根系分布中尤其重要。具體地講，冠根的側(cè)向生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致淺根性，而垂直生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致深根性。與淺根植物相比，深根植物有更多的根向土層更深處分布。因此，當(dāng)植物暴露于干旱條件時(shí)，植物可以通過從更深的土層吸收水分而避免干旱。所以，深根性是一種重要的性狀(Yoshida and Hasegawa, Drought resistance in cropswith emphasis on rice,第 97-114 頁(yè)· 1982 (非專利文獻(xiàn) 2) ; Shigenori Morita, Ne noHatsuikugaku (根發(fā)育研究)第132頁(yè)，2000 (非專利文獻(xiàn)3))。因此，可以預(yù)期，通過將淺根型作物深根化，可提高避旱性，從而賦予作物抗旱性。作物有三種抗旱類型逃旱型(drought escape)、避旱型(drought avoidance)和耐旱型(drought tolerance)。一般地，作物在幼穗形成期(panicle formation)和出穗期(ear emergence)之間最容易受干旱損傷。逃旱型可以通過使作物早熟化，從而使少雨期與從成穗到出穗的時(shí)期不重疊來實(shí)現(xiàn)。這是最常用的開發(fā)抗旱栽培種的方法。有多種分離的基因可以用于控制出穗的時(shí)間(W001/032881(專利文獻(xiàn)I);日本專利申請(qǐng)Kokai Publication No. (JP-A) 2002-153283 (未經(jīng)審查公開的日文專利申請(qǐng))(專利文獻(xiàn) 2) ; JP-A (Kokai) 2003-339382(專利文獻(xiàn) 3) ; JP-A (Kokai) 2004-089036 (專利文獻(xiàn)4) ; JP-A(Kokai) 2004-290190(專利文獻(xiàn) 5) ; JP-A(Kokai) 2005-110579 (專利文獻(xiàn) 6))。然而，出穗期對(duì)于每種栽培種而言是確定的，如果每年在栽培期間降雨的變化都是恒定的話，它是有效的?？墒菃栴}在于，如果氣候變化導(dǎo)致成穗期和出穗期之間發(fā)生干旱，植物將受到干旱的影響。耐旱型是在暴露于干旱時(shí)，通過控制細(xì)胞滲透壓等而耐受干旱的性質(zhì)。耐旱型可以簡(jiǎn)單地通過不給植物澆水加以評(píng)估。因此，通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)分離了大量與耐旱型相關(guān)的基因(JP-A(Kokai) 2007-222129(專利文獻(xiàn)7);綜述見Tran et al. ,Methodsin Enzymology 428:109-28. 2007 (非專利文獻(xiàn)4))。然而,在大田條件下篩選耐旱型則并不簡(jiǎn)單，因?yàn)殡y以控制環(huán)境條件，例如土壤的水分含量。因此，耐旱型栽培種的育種較為滯后。而且，盡管耐旱型具有耐旱的能力，但是當(dāng)干旱條件延長(zhǎng)時(shí)，因?yàn)橹参锊荒軓耐寥乐形账趾蜖I(yíng)養(yǎng)，植物生長(zhǎng)會(huì)受到抑制并且最終會(huì)被殺死。當(dāng)最終的產(chǎn)品是谷粒時(shí)，重要的是使谷物產(chǎn)量最大化而不是使植物不死，因此這在糧食生產(chǎn)中成為了一個(gè)問題。避旱型的特征是通過避免干旱脅迫而獲得抗旱性。上述的深根就是這樣一種特征。在大田中，干旱一般從地表向深層土壤逐漸發(fā)展。在通常的農(nóng)田中，深層土壤含有水分。因此，深根植物在干旱條件下可以通過利用深層土壤的水分而避免損傷。在日本，在旱稻栽培中已經(jīng)開發(fā)出了具有深根的栽培種，從而避免由于雨季結(jié)束后由少雨/日曬導(dǎo)致的干旱的損傷。深根栽培種“ Yumenohatamochi ”已經(jīng)作為一種高度抗旱的旱稻品種被開發(fā)出來,其具有優(yōu)良的風(fēng)味(Hideo Hirasawa et al. , Breeding Science 48:415-419. 1998 (非專利文獻(xiàn) 5))。然而，旨在提聞深根的基因分尚尚未見報(bào)道。趨向性是控制根生長(zhǎng)方向的重要因素，通過分子生物學(xué)技術(shù)使用突變體等已經(jīng)分離了多種與趨向性有關(guān)的基因。趨向性是指根響應(yīng)外界環(huán)境刺激彎曲延伸生長(zhǎng)。趨向性包括向地性、向光性、向水性、向觸性、向電性、向磁性和向化性。已經(jīng)鑒定的擬南芥基因包括多種向地性基因(綜述見 Morita and Tasaka Current Opinion in Plant Biology7(6) :712-718. 2004(非專利文獻(xiàn) 6))，以及向水性基因 MIZl (Kobayashi et al. , Proc.·Natl. Acad. Sci. USA 104 (11): 4724-4729. 2007 (非專利文獻(xiàn) 8))和 MIZ2 (Miyazawa etal. ,Plant Physiologyl49 (2) :835-840. 2009(非專利文獻(xiàn) 9))。關(guān)于稻類植物，只有少量報(bào)道公開了與根的趨向性相關(guān)的基因。向光性基因CPTl(Haga et al.，Plant Cell17(1) :103-115. 2005(非專利文獻(xiàn) 7))和冠根形成基因 Crlldnukai et al. , PlantCelll7 (5) :1387-1396. 2005 (非專利文獻(xiàn)10))已經(jīng)被報(bào)道與向地性相關(guān)。許多基因用失功能突變體或類似的方法分離。尚沒有通過改變這些基因可賦予作物深根性質(zhì)的報(bào)道。已經(jīng)有旨在避旱的關(guān)于玉米和稻類植物深根的遺傳學(xué)研究報(bào)道。關(guān)于玉米，Tuberosa等和Trachsel等發(fā)現(xiàn)了與根長(zhǎng)有關(guān)的數(shù)量性狀座位(QTL) (Tuberosaet al. , Plant Molecular Biology 48:697-712. 2002 (非專利文獻(xiàn) 11) ; Trachsel etal. , Theoretical and Applied Genetics D0I10. 1007/s00122-009-1144-9. 2009(非專利文獻(xiàn)12))。在水稻栽培種之間，在深根性、根長(zhǎng)或根粗度等性狀上存在廣泛的自發(fā)突變(Uga Trachsel et al. , Breeding Science 59:87-93. 2009 (非專利文獻(xiàn) 13))。通過使用分子標(biāo)記的遺傳分析，已經(jīng)鑒定了與栽培種之間觀察到的根形態(tài)突變有關(guān)的多種數(shù)量性狀座位(QTL)(綜述見 Price et al. , Journal of Experimental Botany53:989-1004. 2002(非專利文獻(xiàn)14))。深根由兩個(gè)性質(zhì)決定根長(zhǎng)度和根生長(zhǎng)方向(角度)。大多數(shù)涉及深根的QTL的報(bào)道與根的長(zhǎng)度有關(guān)(綜述見Price et al.，Journal ofExperimental Botany 53:989-1004· 2002 (非專利文獻(xiàn) 14) ；Courtois et al. , Euphytica134:335-345. 2003 (非專利文獻(xiàn) 15) ; Zheng et al. , Theoretical and Applied Genetics107:1505-1515. 2003 (非專利文獻(xiàn) 16) ; Li et al. , Theoretical and Applied Genetics110:1244-1252. 2005 (非專利文獻(xiàn)17))。只有一個(gè)玉米中的QTL被報(bào)道涉及根生長(zhǎng)的角度；然而，它只是簡(jiǎn)單地通過統(tǒng)計(jì)學(xué)程序進(jìn)行了預(yù)測(cè)，基因尚沒有被鑒定/分離(Omori F. andMano Y. Plant Root 1:57-65. 2007 (非專利文獻(xiàn)18))。如上所述，尚沒有關(guān)于基于自發(fā)突變成功地為根相關(guān)QTL鑒定/分離出基因的報(bào)道。一個(gè)似乎合理的解釋是，與地上部分的性狀不同，根系形態(tài)的表型難以精確而可重復(fù)地評(píng)估。而且，另一個(gè)問題是，大田條件下的實(shí)驗(yàn)研究需要付出高強(qiáng)度的努力(Yadav et al. , Theoretical and Applied Genetics95:619-632. 1997 (非專利文獻(xiàn) 19))。用于評(píng)估植物深根的已知方法包括塹壕法(trench method)、土柱法(monolithmethod)和抽芯取樣法(core sampling method)。這些方法適合于在大田中評(píng)估深根(Nemoto et al. , Breeding Science 48:321-324. 1998 (非專利文獻(xiàn) 20) ; MasakataHirayama et al. , Nihon Sakumotsu Gakkai Kiji(Japanese Journal of CropScience) 76:245-252. 2007(非專利文獻(xiàn)21))。塹壕法是一種測(cè)定每個(gè)深度處的根的粗度和數(shù)量的方法，在栽培植物后，從田地移除土壤。然而，塹壕法需要大量的勞力用于除去土壤，因此不適合評(píng)估大量的植物。在土柱法中，將兩個(gè)鐵框架插入栽培植物腳下的土壤內(nèi)。挖取由此形成的方土柱(例如30cm寬x5cm厚x30cm深)，在每個(gè)深度處切出土壤塊來評(píng)估根的長(zhǎng)度和數(shù)量。在抽芯取樣法中，將直徑5-8cm、長(zhǎng)度30-50cm的金屬圓柱管插入到植物腳下或植物之間的土壤內(nèi)；通過沖洗所得的土壤樣品暴露出根，然后評(píng)估根的長(zhǎng)度和數(shù)量。 這兩種方法的采樣均比塹壕法更簡(jiǎn)單，然而，由于插入部位不同而存在采樣誤差，這些方法不能精確地評(píng)估土壤中根的條件。作為在人工環(huán)境下(例如在溫室中)評(píng)估大量植物的方法，已經(jīng)開發(fā)出了一種用于評(píng)估在干旱脅迫條件下的深根性的方法，其中將植物種植并栽培在充滿培養(yǎng)基的圓柱形培養(yǎng)容器內(nèi)(直徑5-10cm) (W0 2006/123392(專利文獻(xiàn)8))。這種方法顯示，當(dāng)植物暴露于通過在栽培期間逐步降低水量造成的干旱脅迫時(shí)，深根性的栽培種與淺根性的栽培種相比，葉子衰老的程度較小。從上述結(jié)果可以看出，這種方法不是直接評(píng)估深根性，而是根據(jù)地上部分的衰老來評(píng)估深根性。這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是評(píng)估簡(jiǎn)單，評(píng)估深根性時(shí)不需要洗去根上的土壤的步驟。然而，當(dāng)栽培種的根系較長(zhǎng)并且水平伸展時(shí)，栽培種會(huì)被錯(cuò)誤地評(píng)估為具有深根性，因?yàn)樗鼈兊母鶗?huì)在到達(dá)圓柱邊緣后會(huì)沿著圓錐體向下延伸。因此，盡管這種方法可以用于評(píng)估根的長(zhǎng)度，這是構(gòu)成深根性的一個(gè)特征，但是難以使用這種方法評(píng)估根生長(zhǎng)的方向。還開發(fā)出了用于評(píng)估小麥的提籃法(basket method) (Oyanagi et al. , NihonSakumotsu Gakkai Kiji (Japanese Journal of Crop Science)62:565-570. 1993(非專利文獻(xiàn)22))，作為一種僅評(píng)估根生長(zhǎng)方向的簡(jiǎn)單定量方法。而且，先前有描述使用提籃法評(píng)估稻類植物的深根性的報(bào)道(Kato et al. ,Plant Soil 287:117-129. 2006 (非專利文獻(xiàn)23))。在這種方法中，將網(wǎng)格狀籃(mesh basket)用土填滿并置于大田或花盆中。經(jīng)過一段時(shí)期的栽培，通過測(cè)量延伸通過提籃的根相對(duì)于地表的生長(zhǎng)角度評(píng)估深根性。這種方法能夠簡(jiǎn)單地評(píng)估生長(zhǎng)角度；然而當(dāng)出于基因分離的目的要一次評(píng)估大量的樣品時(shí)，它需要更多的空間和大量的水分控制。在上述環(huán)境下，用天然變異體分離與深根性相關(guān)的基因，并闡明這些基因的避旱效果，對(duì)于有效地開發(fā)具有更高避旱能力的栽培種是至關(guān)重要的。Drol (Deeper Rooting I)是一個(gè)與深根性相關(guān)的QTL,通過用秈型雜交水稻栽培種IR64作為輪回親本回交熱帶粳稻旱稻栽培種Kinandang Patong,對(duì)其產(chǎn)生的后代株系(BC2F2)進(jìn)行QTL分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)預(yù)測(cè)它位于染色體9的長(zhǎng)臂上(Uga et al.，The 2ndInternational Conference on Plant Molecular Breeding. 2007 (非專利文獻(xiàn) 24) ; Ugaet al. , Nihon Ikusyu Gakkai Dai 112 Kai Kouenkai Youshisyu(112nd Meeting ofThe Japanese Society of Breeding, Program and Abstracts) PP. 188，2007 (非專利文獻(xiàn)25);Uga et al. , Dai 27Kai Ne Kenkyu Syukai (27th Research Meeting of The JapaneseSociety for Root Research)，2007 (非專利文獻(xiàn) 26) ; Uga et al. The 5th InternationalCrop Science Congress Abstracts 243p. 2008 (非專利文獻(xiàn)))。IR64 是一個(gè)難以通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因的栽培種。目前，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法被普遍用于稻類植物(日本專利No. 2649287(專利文獻(xiàn)9))，其中使用去分化的培養(yǎng)組織(例如愈傷組織)作為植物樣品。然而對(duì)于IR64，使用愈傷組織的方法僅能夠獲得非常低的轉(zhuǎn)化效率。因此，還沒有建立起用于IR64的基于愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法(Hiei and Komarij Nature Protocols3:824-834. 2008(非專利文獻(xiàn)28))。Hiei和Komari報(bào)道了一種方法，使用不成熟的胚代替愈傷組織作為植物樣品，從而實(shí)現(xiàn)IR64的轉(zhuǎn)化。然而，因?yàn)椴怀墒炫叻椒ㄐ枰ㄆ诤蟮牟怀墒炫?，因此必須一直在稻田或者溫室中?zhǔn)備植物，以便在需要時(shí)可以立即獲得不成熟的胚。例如，可以每?jī)芍懿シN一次，以便總是可以獲得不成熟的胚；因此，必須有廣闊的栽培面積和大量的勞動(dòng)力用于維持植物。所以，建立基于愈傷組織的將基因轉(zhuǎn)入IR64的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)分子育種的實(shí)際使用是非常重要的。 先前技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)[專利文獻(xiàn) 1]W0 01/032881 (Plant photosensitive gene Hdl and use thereof)[專利文獻(xiàn) 2] JP-A(Kokai) 2002-153283 (Plant anthesis-inducing gene Hd3aand use thereof)[專利文獻(xiàn) 3] JP-A(Kokai) 2003-339382 (Plant anthesis-enhancing gene Ehdland use thereof)[專利文獻(xiàn) 4] JP-A(Kokai) 2004-089036 (Plant anthesis-enhancing gene RFTland methods for predicting the time of bloom)[專利文獻(xiàn) 5]JP-A(Kokai)2004-290190(Plant anthesis-controlling geneLhd4 and use thereof)[專利文獻(xiàn) 6] JP-A(Kokai) 2005-110579 (Plant photosensitive gene Hd5anduse thereof)[專利文獻(xiàn) 7]JP-A(Kokai)2007-222129(Methods for producing plantsresistant to environmental stress)[專利文獻(xiàn) 8]W0 2006/123392 (Methods for assessing deep rooting ofplants)[專利文獻(xiàn) 9] Japanese Patent No. 2649287[非專利文獻(xiàn)][非專利文獻(xiàn) IjMorita S·，(2003) Ne no Dezain (Rootdesign)，pp. 107，Yokendo.[非專利文獻(xiàn) 2] Yoshida S. and Hasegawa S. 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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明待解決的問題本發(fā)明是通過考慮上述情形實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于改變植物根形態(tài)，以通過提高避旱能力賦予植物抗旱性的方法。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與植物深根性有關(guān)的新型基因，具有深根性性狀的轉(zhuǎn)化植物，用于產(chǎn)生這種植物的方法，和用于評(píng)估植物是否具有深根性性狀的方法。解決問題的手段Drol的候選區(qū)域位于插入-缺失(InDel)標(biāo)記ID0714和ID0717之間1，443kbp的染色體區(qū)域內(nèi)(根據(jù)Nipponbare中的核苷酸序列)。根據(jù)RAP-DB預(yù)測(cè)，這個(gè)區(qū)域含有166個(gè)基因。尚未證明這些基因中包括任何先前報(bào)道與水稻和其它植物的深根性有關(guān)的基因或其同源物。因此，根據(jù)假定基因的功能來預(yù)測(cè)候選基因是不可能的。而且，因?yàn)閮蓚€(gè)栽培種IR64和Kinandang Patong的核苷酸序列尚未確定，因此也難以根據(jù)這些基因的核苷酸序列差異來預(yù)測(cè)基因。在上述情況下，本發(fā)明人嘗試了鑒定和分離Drol基因。首先，本發(fā)明人使用大約4，500株植物的大規(guī)模分離群體，對(duì)在淺根水稻栽培種IR64和深根水稻栽培種Kinandang Patong的雜交植物中檢測(cè)到的決定深根性的座位(Drol座位)進(jìn)行高分辨率連鎖分析。，為了能夠一次測(cè)試數(shù)百株植物的深根率(穿出提籃底部區(qū)域的根數(shù)相對(duì)于穿出提籃的總根數(shù)的百分比)，對(duì)傳統(tǒng)的提籃方法進(jìn)行了改進(jìn)。使得可以一次檢查500株植物。然而，由于不可能一次檢測(cè)比上數(shù)更大數(shù)目的植物。從一組從大規(guī)模群體中選出的雜交系中選出了數(shù)個(gè)株系，使用每個(gè)株系40株植物的表型/基因型數(shù)據(jù)逐步縮小候選區(qū)域。將候選區(qū)域從1，443kbp縮小到大約IOOkbp之后,發(fā)明人構(gòu)建了 IR64和Kinandang Patong的細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)，并篩選了含有100-kbp候選區(qū)域的BAC0為了考慮是否有可能通過核苷酸序列比較縮小候選基因范圍，對(duì)兩 個(gè)栽培種的RAP-DB預(yù)測(cè)的基因的核苷酸序列進(jìn)行了比較。然而，許多基因在其外顯子核苷酸序列中都具有突變，因此不可能縮小候選基因。然后，本發(fā)明人總共進(jìn)行了 5次連鎖分析，同時(shí)根據(jù)候選區(qū)域核苷酸序列的突變產(chǎn)生了 DNA標(biāo)記。結(jié)果，Drol基因區(qū)域被縮小到一個(gè)6. Okbp的區(qū)域，其位于插入-缺失(InDel)標(biāo)記 Drol_INDEL09 (引物 5’-GCAGACGCTCGTAACACGTA-3’ (SEQID NO:4)和引物 5’ -GTGGCAGCTCCATCAACTCT-3’ (SEQ ID NO: 5))和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記 Drol-CAPS05(引物 5’-GCACAAGATGGGAGGAGAGT-3’ (SEQ ID NO:6)和引物5’-CATGGGTGAGAATCGTGTTG-3’ (SEQ ID NO: 7)擴(kuò)增的 DNA 用限制酶 Hinf I 進(jìn)行處理)之間。該區(qū)域僅含有一個(gè)在RAP-DB中預(yù)測(cè)的假定基因。這個(gè)假定基因被推定編碼一種功能未知的蛋白質(zhì)。因?yàn)榉浅ｋy以轉(zhuǎn)化IR64，所以在用轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)之前，對(duì)預(yù)測(cè)基因是否與深根性真實(shí)相關(guān)進(jìn)行了評(píng)估。首先，評(píng)估該基因是否具有與深根相關(guān)的功能，該功能預(yù)測(cè)是根據(jù)假定基因的氨基酸序列在如下的幾個(gè)網(wǎng)址進(jìn)行功能搜索“SALAD數(shù)據(jù)庫(kù)”基因組范圍比較植物蛋白序列的數(shù)據(jù)庫(kù)(salad, dna. affrc.go.jp/salad/)“Pfam” :蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(pfam. janeIia. org/)“PSORT” 預(yù)測(cè)蛋白疏水性和定位的網(wǎng)址(www.psort.org/)“InterPro”蛋白家族、結(jié)構(gòu)域、功能位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ebi.ac.uk/interpro/)然而，使用任何這些網(wǎng)址都不能發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。然后，對(duì)基因進(jìn)行檢查，以顯示它的外顯子在IR64和Kinandang Patong之間是否有核苷酸序列變異。結(jié)果顯示，IR64在外顯子4具有一個(gè)Ib缺失,而Kinandang Patong在相同位置具有一個(gè)腺嘌呤。這個(gè)Ib缺失造成移框，產(chǎn)生一個(gè)提前終止密碼子。本發(fā)明人懷疑該缺失降低了 IR64中候選基因的表達(dá)水平。因此，用萌發(fā)6天和12天時(shí)IR64和Kinandang Patong的葉片、葉鞘上部、葉鞘基部和冠根對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。從這三種類型組織中提取總RNA，通過實(shí)時(shí)PCR確定基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在這兩個(gè)栽培種中，基因在葉鞘的基部表達(dá)，而在冠根和葉片/葉鞘的上部則幾乎不表達(dá)。比較IR64和Kinandang Patong之間的表達(dá)水平。樣品顯示，在第6和12天，兩個(gè)栽培種之間的差異均僅小于2倍。該預(yù)測(cè)的基因是否是真實(shí)的Drol基因不能夠通過表達(dá)水平上的結(jié)果來判斷。然而，該基因仍然是一個(gè)候選基因，因?yàn)槿~鞘基部包含冠根原基，這是冠根的雛形，或者因?yàn)樵摶虻墓δ茉诎被崴缴显谶@兩個(gè)栽培種之間潛在地不同。接著，根據(jù)深根率和外顯子4中Ib缺失之間的相關(guān)性評(píng)估該基因是否與深根性有關(guān)。對(duì)64個(gè)栽培種進(jìn)行分析，包括IR64和Kinandang Patong, 22個(gè)由國(guó)家水稻研究所(Los Banos, Philippines; IR64也是由這個(gè)研究所開發(fā)的品種)開發(fā)的IR栽培系,和20個(gè)野生型品系(7 個(gè) Oryza nivara 品系，12 個(gè) O. rufipogon 品系，和 I 個(gè) O. meridionalis 品系)，考察其在Ib缺失位點(diǎn)周圍的核苷酸序列。核苷酸序列比較顯示，僅IR64中在外顯子4含有這個(gè)Ib缺失。因此，無法根據(jù)Ib缺失與深根率之間的相關(guān)性來判斷該預(yù)測(cè)的基因是否是真實(shí)的Drol基因。對(duì)包括Kinandang Patong在內(nèi)的14個(gè)粳稻品種的Drol互補(bǔ)DNA(cDNA)的核苷酸序列進(jìn)行完全分析。核苷酸序列在所有這些品種之間均相同。同時(shí)，通過提籃法確定的深根率變化很大，從最低的Tupa729的15. 9%到最高的Kinandang Patong的83. 1%。這可能可以用存在其它負(fù)責(zé)深根的QTL加以解釋，或者啟動(dòng)子區(qū)核苷酸序列的一些差異可能影響基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。因此，在Kinandang Patong和Nipponbare之間對(duì)上游大約2. 2kb的核苷酸序列(到候選區(qū)域的5’上游末端為止)進(jìn)行了比較。在兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了突變。一個(gè)位于5’ -非翻譯區(qū)1，250bp上游；該位置的核苷酸在Nipponbare的核苷酸序列中是胸腺嘧啶，而在Kinandang Patong中被鳥嘌呤代替。在PLACE (植物順式作用調(diào)節(jié)DNA元件數(shù)據(jù)庫(kù).'訓(xùn)ι dna. affrc. go. jp/PLACE/)上對(duì)該突變相鄰的序列進(jìn)行了分析，這是一個(gè)用于搜索啟動(dòng)子區(qū)的順式元件的網(wǎng)址。該分析顯示，在稱作“GATA box”的模體中，胸腺嘧啶被鳥嘌呤代替。另一個(gè)突變是Kinandang Patong在5’非翻譯區(qū)的上游1，189bp-l, 218bp缺失30bp。這些核苷酸序列的突變是造成栽培種之間深根突變的潛在原因。
·
6. Ο-kbp區(qū)域中的預(yù)測(cè)Nipponbare基因的全長(zhǎng)cDNA已經(jīng)被提交，登錄號(hào)為AK068870。因此，在 FOX 搜尋系統(tǒng)(FOX hunting system)(全長(zhǎng) cDNAOver-eXpressing 基因搜尋系統(tǒng))中搜索Nipponbare基因。結(jié)果，搜索顯示了 2個(gè)Tl代株系和2個(gè)T2代株系。然后，每個(gè)株系用5株植物確定這四個(gè)株系的深根率。多個(gè)植物被證明與作為對(duì)照的Nipponbare (野生型)相比具有顯著更高的深根率。這個(gè)結(jié)果增加了被預(yù)測(cè)基因是真實(shí)的Drol基因的可能性。為了確認(rèn)預(yù)測(cè)基因絕對(duì)是真實(shí)的Drol基因，本發(fā)明人通過將攜帶預(yù)測(cè)的基因(Kinandang Patong型Drol基因)的載體導(dǎo)入到IR64愈傷組織中產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化體。該轉(zhuǎn)化效率是便于轉(zhuǎn)化的栽培種例如Nipponbare的1/10或者更低。因此，本發(fā)明人在制備了超過10倍的用于轉(zhuǎn)化的愈傷組織之后，進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)移。對(duì)所得植物轉(zhuǎn)化體的深根率進(jìn)行了評(píng)估。用預(yù)測(cè)基因轉(zhuǎn)化的植物被證明具有更高的深根率。上述的這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示，6. Okbp候選區(qū)域中的預(yù)測(cè)基因是真實(shí)的Drol。因此，本發(fā)明人第一次成功地鑒定并分離出深根基因Drol。進(jìn)一步,本發(fā)明人使用IR64和近等基因系(Drol-NIL)評(píng)估由于Drol造成的深根是否與抗旱性提高相關(guān)，其中該近等基因系具有和IR64相同的遺傳背景，只是Drol的相鄰區(qū)域被Kinandang Patong的區(qū)域所代替。結(jié)果證明,Drol-NIL由于深根化而變得抗旱,在產(chǎn)量上與IR64相比有顯著增加。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 [I],下面(a)-(e)中任一項(xiàng)的 DNA :(a)包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列的DNA ；(b)包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含SEQ ID NO:3，13和15中的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA ；(d)在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA雜交，并且具有賦予植物深根性表型的活性的DNA ;或者
(e)編碼包含與SEQ ID NO:3, 13和15中的任一氨基酸序列相比有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、刪除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有賦予植物深根性表型的活性的DNA。[2], [I]的DNA，其中所述植物是單子葉植物。[3], [2]的DNA，其中所述單子葉植物是禾本科植物。[4], [3]的DNA，其中所述禾本科植物選自下組稻、麥類(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗、貓尾草、草地早熟禾、鴨茅、意大利黑麥草、多年生黑麥草、葦狀羊茅和百喜草。[5], [3]的DNA，其中所述禾本科植物選自下組水稻、高粱和玉米。[6], 一種載體，包含[1]-[5]中任一項(xiàng)的DNA。
·
[8], 一種用[1]_[5]中任一項(xiàng)的DNA轉(zhuǎn)化的植物，其具有深根性表型。[9], 一種通過將[1]_[5]中任一項(xiàng)的DNA或[6]的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，其具有深根性表型。[10]. —種轉(zhuǎn)化植物，其是通過如下的步驟(a)-(d)獲得的(a)將[1]-[5]中任一項(xiàng)的DNA或6的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中；(b)確定步驟(a)中的植物細(xì)胞內(nèi)的[1]_[5]中任一項(xiàng)的DNA的拷貝數(shù)；(c)選擇含有單拷貝的被導(dǎo)入的DNA或載體的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(d)從步驟(C)中選擇的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物， 并且其具有深根性表型。[11], 8-[10]中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物是單子葉植物。[12]. [11]的植物，其中所述單子葉植物是禾本科植物。[13]. [12]的植物，其中所述禾本科植物選自下組水稻、麥類(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗、貓尾草、草地早熟禾、鴨茅、意大利黑麥草、多年生黑麥草、葦狀羊茅和百喜草。[14]. [12]的植物，其中所述禾本科植物選自下組水稻、高粱和玉米。[15]. —種轉(zhuǎn)化植物，其是[8]_[14]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的后代或克隆。[16].從[8]_[15]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物分離的細(xì)胞。[17]· [8]-[15]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的繁殖材料。[18].從[8]_[15]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物分離的器官。[19].從[16]的細(xì)胞、[17]的繁殖材料和[18]的器官中的至少一個(gè)制備的加工食品。[20]. —種用于產(chǎn)生[8]和[11]_[13]中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括下述步驟將[1]-[5]中任一項(xiàng)的DNA或[6]的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，以及從該植物細(xì)胞再生植物。[21]. [20]的方法，其進(jìn)一步包括選擇具有單拷貝的[1]_[5]中任一項(xiàng)的DNA的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)化植物的步驟。[22]. —種用于評(píng)估植物是否具有深根性表型的方法，其中當(dāng)分子量或核苷酸序列相同時(shí)則判定測(cè)試植物具有深根性表型，該方法包括下面的步驟(a)-(c)
(a)從測(cè)試植物制備DNA樣品；(b)從該DNA樣品擴(kuò)增包含[1]-[5]中任一項(xiàng)的DNA的區(qū)域；和(c)將擴(kuò)增的DNA片段的分子量或核苷酸序列與[1]_[5]中任一項(xiàng)的DNA進(jìn)行比較。[23]. —種用于評(píng)估植物是否具有深根性表型的方法，其中當(dāng)獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)則判定測(cè)試植物具有深根性表型，該方法包括使用包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0:9的核苷酸序列的引物并使用從該測(cè)試植物制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR的步驟。[24]. —種用于評(píng)估植物是否具有深根性表型的方法，其中當(dāng)獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)則判斷測(cè)試植物不具有深根性表型，該方法包括使用包含SEQ ID N0:10的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的引物并使用從該測(cè)試植物制備的基因組DNA作為 模板進(jìn)行PCR的步驟。[25]. —種用于選擇具有深根性表型的植物的方法，其包括如下的步驟(a)和
(b)(a)通過將任意植物與具有深根性表型的植物進(jìn)行雜交產(chǎn)生栽培種；和(b)通過[22]_[24]中任一項(xiàng)的方法評(píng)估步驟(a)中獲得的植物是否具有深根性表型。[26]· —種蛋白質(zhì)，其由[1]-[5]中任一項(xiàng)的DNA編碼。[27]. —種抗體，其結(jié)合[26]的蛋白質(zhì)。[28]· —種DNA，其包含至少15個(gè)與[1]-[5]中任一項(xiàng)的DNA或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸。[29]· —種DNA，其包含SEQ ID NO:4-11中任一項(xiàng)的核苷酸序列。發(fā)明效果本發(fā)明提供了控制植物例如稻的深根性的Drol基因，和用該基因轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明的基因可用于操作植物根系形態(tài)，從淺根性向深根性改變，或者從深根性向淺根性改變。具體地，通過例如操縱Drol基因?qū)\根性植物變成深根性植物從而提高避旱能力可以賦予抗旱性。干旱導(dǎo)致世界糧食產(chǎn)量嚴(yán)重減產(chǎn)。主要的海外企業(yè)已經(jīng)集中于開發(fā)抗旱作物。另一方面，通過操縱Drol基因?qū)⑸罡灾参镒兂蓽\根性植物可以賦予耐濕性。在日本，農(nóng)業(yè)政策改變，推薦在休耕水稻田進(jìn)行旱栽培。然而，因?yàn)榈咎锏呐潘ЯΣ?，?duì)于沒有耐濕性的大豆和玉米而言濕害成為了問題。因此，為了提高耐濕性，對(duì)作物的淺根化也進(jìn)行了研究。在這些國(guó)際和國(guó)內(nèi)環(huán)境下，通過使用控制植物根形態(tài)的基因開發(fā)抗旱或抗?jié)窈Φ淖魑锲贩N是非常重要的。附圖簡(jiǎn)述圖I的圖片顯示了使用改良提籃法對(duì)每個(gè)譜系的深根性進(jìn)行的評(píng)估。不銹鋼提籃上安置有環(huán)。這個(gè)環(huán)被布置在如下的位置，使得當(dāng)根相對(duì)于地表以50度角或者更深的角度延伸時(shí)，判定該根是深根。在每個(gè)圖例中，第一和第二個(gè)縮寫分別是指譜系名稱和代數(shù)。圖2的曲線圖顯示了在導(dǎo)入了攜帶有Drol的載體或單獨(dú)的載體的TO代IR64轉(zhuǎn)化體中深根率的分布。圖3的曲線圖顯示了在導(dǎo)入了攜帶有Drol的載體或單獨(dú)的載體的Tl代IR64轉(zhuǎn)化體中，深根率與對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)化載體的拷貝數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度(實(shí)時(shí)PCR)之間的關(guān)系。單拷貝是指在TO代被導(dǎo)入只有單一拷貝的Drol的譜系，而多拷貝是指在TO代被導(dǎo)入多個(gè)Drol拷貝的譜系。單拷貝譜系在Tl代中分離成缺失型(O拷貝)、雜合型(I個(gè)拷貝)和純合型(2個(gè)拷貝)，并且根據(jù)拷貝數(shù)將信號(hào)強(qiáng)度分成3種類型。然而，與Southern分析不同，實(shí)時(shí)PCR由于其原理即使植物間的拷貝數(shù)相同也不一定總是給出相同的信號(hào)強(qiáng)度。每個(gè)曲線圖中的縮寫表示各個(gè)克隆的譜系編號(hào)。圖4的曲線圖顯示了深根率在Fox譜系和Nipponbare中的分布。圖5的圖形顯示了高粱和玉米直系同源物的分析結(jié)果。Drol,水稻(KinandangPatong) ;SbDrolLl,Drol在高粱中的直系同源物；ZmDrolLl,Drol在玉米中的直系同源物。圖6的照片顯示了大田中Drol-NIL的深根與IR64和Kinandang Patong的深根的比較結(jié)果。白色數(shù)字顯示了地表以下的土壤深度。白色虛線指示根系分布區(qū)域的輪廓。
圖7的曲線圖顯示了在抗旱試驗(yàn)中試驗(yàn)田里土壤水勢(shì)的時(shí)間進(jìn)程?！敖?jīng)灌溉的”和“干旱的”分別指示灌溉區(qū)域和干旱脅迫區(qū)域。圓括號(hào)中顯示了監(jiān)視水勢(shì)的土壤深度。在干旱脅迫區(qū)域中，在25cm 土壤深度下，播種大約70天后，觀察到土壤干燥的快速進(jìn)展。圖8的照片顯示了在干旱脅迫條件下IR64和Drol-NIL的抗卷葉性的時(shí)間依賴性差異。植物照片從正上方拍攝。圖片頂部顯示的天數(shù)是在干旱脅迫區(qū)域中終止灌溉之后脅迫處理的天數(shù)。圖9的曲線圖和圖片顯示了 IR64和Drol-NIL在干旱脅迫條件下葉片溫度、氣孔導(dǎo)度和光合速率的差異。A顯示了水稻植物在終止灌溉35天后的視圖。右起第一和第二列是IR64 ;第三和第四列是Drol-NIL。B顯示了終止灌溉35天后水稻植物的溫度分布的圖像(從圖A所述的相同植物獲取的紅外熱成像圖像)。右起第一和第二列是IR64 ;第三和第四列是Drol-NIL。顏色差異提示如下顏色越暖，溫度越高；顏色越冷，溫度越低。該圖片提示IR64和Drol-NIL的葉片溫度之間存在差異(Drol-NIL的葉片溫度平均比IR64低O. 7° C)。冷色在Drol-NIL中的分布更加廣泛，提示Drol-NIL的葉片溫度低于IR64。C顯示了在干旱脅迫區(qū)域中終止灌溉之后Drol-NIL的葉片溫度變化。數(shù)值是相對(duì)于IR64的葉片溫度，是用Drol-NIL的平均葉片溫度減去IR64的平均葉片溫度而確定的?？梢园l(fā)現(xiàn)，DioI-NIL的葉片溫度在每個(gè)測(cè)量日期均低于IR64。D顯示了在干旱脅迫區(qū)域中終止灌溉之后IR64和Drol-NIL之間氣孔導(dǎo)度的差異。*表示Drol-NIL的氣孔導(dǎo)度以5%的水平顯著大于IR64。E顯示了在干旱脅迫區(qū)域中終止灌溉之后IR64和Drol-NIL之間光合速率的差異。*表示Drol-NIL的光合速率以5%的水平顯著大于IR64。

圖10的示意圖和照片顯示了在干旱脅迫條件下栽培的IR64和Drol-NIL的產(chǎn)量確定結(jié)果。A顯示了在干旱脅迫區(qū)域中種植收獲的IR64和Drol-NIL之間的各種表型差異。縱向的棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。*、**、或***表示Drol-NIL分別以5%，1%,或O. 1%水平顯著大于IR64。B的照片顯示了在干旱脅迫區(qū)域收獲的IR64和Drol-NIL的平均穗。圖11的圖片顯示了用于測(cè)試抗旱的實(shí)驗(yàn)田解剖后的側(cè)面，可見干旱脅迫區(qū)域內(nèi)IR64和Drol-NIL之間根系分布的差異。每個(gè)譜系的上圖顯示了試驗(yàn)田的剖視圖，下圖顯示了沖洗掉額外的表層土之后獲得放大圖片，用于觀察根是否穿過砂礫層(gravelstratum)。箭頭指示穿過了砂碌層的Drol-NIL的根。圖中顯示,在IR64中，沒有根穿過砂礫層到達(dá)更深層，但是在Drol-NIL中，有很多根穿過砂礫層并到達(dá)更深層。
圖12的曲線圖顯示了大田土壤中水勢(shì)的時(shí)間進(jìn)程。圖13的照片顯示了在施肥或未施肥田地中播種120天后植物的外觀。上圖顯示了包括各個(gè)區(qū)域的整體圖。下圖是從上獲得的各個(gè)區(qū)域的放大圖。在IR64中，在施肥和未施肥區(qū)域中均觀察到了卷葉。同時(shí)，Drol-NIL則沒有顯示卷葉。圖14的照片顯示了用于評(píng)估Drol基因缺失的PCR標(biāo)記。在每個(gè)退火溫度下，左右泳道分別顯示了 IR64和Kinandang Patong的結(jié)果。實(shí)施本發(fā)明的模式 本發(fā)明提供了下面(a)-(e)中任一個(gè)的DNA :(a)包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列的DNA ；(b)包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA ；(c)編碼包含SEQ ID NO:3，13和15中的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA ；(d)在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA雜交，并且具有賦予植物深根性表型的活性的DNA ;或者(e)編碼如下蛋白質(zhì)，并且具有賦予植物深根性表型的活性的DNA，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID N0:3，13和15中任一個(gè)的氨基酸序列相比有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、刪除、添加和/或插入的氨基酸序列。在下文中，上述DNA也偶爾地稱作“本發(fā)明的DNA”或“Drol基因”。同時(shí)，由本發(fā)明DNA編碼的蛋白質(zhì)有時(shí)被稱作“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”或“Drol蛋白”。這里，“包含”既指“包括”也指“由…組成”。同時(shí)，上面(e)的DNA也可以稱為(e)編碼如下蛋白質(zhì)，并且能夠賦予植物深根性性狀的DNA，所述蛋白質(zhì)在SEQ IDNO:3, 13和15中任一個(gè)的氨基酸中具有至少一個(gè)突變，所述突變選自一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、刪除、添加和/或插入。而且，本發(fā)明的DNA可以稱作“分離的DNA”。水稻栽培種Kinandang Patong的Drol基因的基因組DNA核苷酸序列在SEQ IDNO: I中顯示；cDNA的核苷酸序列在SEQ ID NO: 2中顯示；由該核苷酸序列編碼區(qū)編碼的蛋白的氨基酸序列(Drol蛋白)在SEQ ID NO:3中顯示。SEQ ID NO: I核苷酸序列中的蛋白編碼區(qū)由264_2，685位核苷酸組成。同時(shí)，SEQ ID N0:2核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)由264-1019位核苷酸組成。而且，SEQ ID NO: 17顯示了 Kinandang Patong的Drol基因和其上游的包括啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。與Nipponbare中對(duì)應(yīng)的區(qū)域的序列(SEQ IDNO: 18)比較，KinandangPatong的序列(SEQ ID NO: 17)在Drol基因上游大約I. 2kb處有一個(gè)單核苷酸替換和一個(gè)30個(gè)核苷酸的缺失。具體地，Nipponbare中“GATA”基序的“T”(SEQ ID NO: 18核苷酸序列第6位的核苷酸)在Kinandang Patong中被“G”替換(SEQ ID NO: 17核苷酸序列第6位的核苷酸)。此外，SEQ ID NO: 18中第7-36位的30個(gè)核苷酸在Kinandang Patong的相應(yīng)區(qū)域中缺失。SEQ ID NO: 12顯示了高粱來源中的Drol基因的編碼序列(OTS)的核苷酸序列，同時(shí)SEQ ID NO: 13顯示了由該核苷酸序列編碼區(qū)編碼的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 12的核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)(⑶S序列)由第1-789位核苷酸組成。
SEQ ID NO: 14顯示了玉米來源的Drol基因中的CDS的核苷酸序列，同時(shí)，SEQ IDNO: 15顯示了由該核苷酸序列編碼區(qū)編碼的蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO: 14的核苷酸序列的蛋白編碼區(qū)(⑶S序列)由第1_768位核苷酸組成。本發(fā)明的Drol基因具有賦予植物深根性性狀的活性。這里“深根性性狀”是指作為植物地下器官的根相對(duì)于地表以一個(gè)深角度在土壤中延伸的性質(zhì)。這里，“深角度”的意思是根相對(duì)于地表的角度至少為50°，優(yōu)選地60°，更優(yōu)選地70°，再更優(yōu)選地80°或者更大。DNA是否具有賦予植物深根性性狀的活性可以通過制備用Drol基因轉(zhuǎn)化的植物并確定該植物相對(duì)于地表的角度加以確認(rèn)。植物相對(duì)于地表的角度可以通過多種方法加以評(píng)估，例如提籃法和本文實(shí)施例中介紹的改良提籃法，以及塹壕法、土柱法和抽芯取樣法；然而這些方法并不僅限于此。 編碼本發(fā)明Drol蛋白的DNA包括基因組DNA、cDNA和化學(xué)合成的DNA。這些基因組DNA和cDNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法加以制備。基因組DNA可以例如如下制備。從具有深根性的水稻栽培種(例如Kinandang Patong)、高粱或玉米提取基因組DNA制備基因組文庫(kù)(可以使用載體如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒，BAC和Pl人工染色體(PAC)，但不限于此)；擴(kuò)增文庫(kù)，并通過使用從編碼Drol蛋白的DNA(例如具有SEQ ID NO: I, 2, 12, 14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA)制備的探針進(jìn)行菌落或噬菌斑雜交進(jìn)行文庫(kù)篩選。作為另一選擇，這些基因組DNA的制備可以通過使用制備成特異針對(duì)編碼Drol蛋白的DNA(例如包括SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA)的引物進(jìn)行PCR來實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，cDNA可以例如如下制備。使用從具有深根性的水稻栽培種(例如KinandangPatong)植物提取的mRNA合成cDNA，并插入到載體(例如λ ZAP)內(nèi)以構(gòu)建cDNA文庫(kù)；然后擴(kuò)增文庫(kù)，并通過菌落或噬菌斑雜交進(jìn)行文庫(kù)篩選。作為另一選擇，cDNA可以用如上所述的相同方式通過PCR加以制備。另一方面，可以制備化學(xué)合成的DNA，例如通過使用市場(chǎng)上可以獲得的寡核苷酸合成儀來制備。作為另一選擇，編碼本發(fā)明Drol蛋白的DNA可以通過從具有深根性的高粱(例如葉片和葉鞘)或玉米(例如葉片和葉鞘)提取基因組DNA或mRNA加以制備。0025本發(fā)明包括編碼在功能上與SEQ ID NO:3，13和15中任一個(gè)的Drol蛋白等價(jià)的蛋白的DNA。這里，“功能上與Drol蛋白等價(jià)”的意思是感興趣的蛋白具有賦予植物深根性性狀的功能。優(yōu)選的DNA是單子葉植物來源的DNA，更優(yōu)選地是來源于禾本科(Gramineae)、百合科(Liliaceae)、鳳梨科(Bromeliaceae)、掠桐科(Palmae)、天南星科(Araceae)、姜科(Zingiberaceae)和蘭科(Orchidaceae)的DNA,更優(yōu)選地是來自水稻、麥類(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏該(Job’ s tears)(薏米))、玉米、黍(millet)、粟(foxtail millet)、稗(Japanese millet)、高梁(sorghum)、龍山稷(finger millet)、珍珠粟(pearl millet)、埃塞俄比亞畫眉草(teff)、甘鹿、貓尾草(timothy)、草地早熟禾(Kentucky bluegrass)、鴨茅(orchardgrass)、意大利黑麥草(Italian ryegrass)、多年生黑麥草(perennial ryegrass)、華狀羊茅(tall fescue)和百喜草(Bahia grass)的 DNA,特別優(yōu)選地是水稻、高粱和玉米來源的DNA。這些DNA包括例如編碼如下蛋白質(zhì)的突變體、衍生物、等位基因、變異體和同源體該蛋白質(zhì)具有賦予植物深根性性狀的功能，并且在氨基酸序列上與SEQ ID NO:3，13和15中任一個(gè)的氨基酸序列相比具有一個(gè)或多個(gè)(例如2，3，4，5，10，20，30，40，50，或100個(gè)
殘基)氨基酸替換、刪除、添加和/或插入。本領(lǐng)域眾所周知的用于制備編碼具有被改變氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA的方法包括定點(diǎn)突變法(Kramer, ff. and Fritz, H. -J. (1987) Oligonucleotide-directedconstruct ion of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods inEnzymology, 154:350-367)。在自然界中，核苷酸序列突變也會(huì)導(dǎo)致其所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列突變。如上所述，編碼與自然發(fā)生Drol蛋白的氨基酸序列相比在氨基酸序列上有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、刪除或添加的蛋白質(zhì)的DNA包含在本發(fā)明的DNA之內(nèi)，只要它們編碼的蛋白質(zhì)具有與天然存在的Drol蛋白(SEQ ID NO:3, 13和15中任一個(gè)的氨基酸序列)等價(jià)的功能即可。這些DNA包括例如包含SEQ ID NO: 16的核苷酸 序列的DNA。包含SEQ IDNO: 16的核苷酸序列的DNA與包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的DNA相比，在核苷酸序列上在每個(gè)5’和3’端具有一個(gè)Ι-bp添加。DNA還在自5’端起373位bp處(在SEQ ID NO: 2為自5’端起372位bp處)具有一個(gè)G代替A的替換。因?yàn)樵摵塑账崽鎿Q，由這種包含SEQID NO: 16核苷酸序列的DNA編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 3的氨基酸序列相比，在第37位處具有一個(gè)由谷氨酸取代賴氨酸的非同義氨基酸替換。本發(fā)明還提供了這樣的蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID N0:3的氨基酸序列的第37位的賴氨酸被谷氨酸代替的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼這種蛋白質(zhì)的DNA(例如包括SEQ ID NO: 16的核苷酸序列的DNA)。即使核苷酸序列具有突變，在某些情況下，該突變也不會(huì)對(duì)蛋白的氨基酸序列造成任何突變(突變簡(jiǎn)并性)(mutation degeneracy)。這種突變體(簡(jiǎn)并突變體)也包含本發(fā)明的DNA之內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它用于制備編碼與SEQ ID N0:3，13和15中任一個(gè)的Drol蛋白在功能上等價(jià)的蛋白質(zhì)的DNA的方法包括使用雜交技術(shù)(Southern, E.Μ. (1975) Journal of Molecular Biology, 98，503)或PCR技術(shù)(Saiki, R. K. et al. , (1985)Science, 230，1350-1354; Saiki, R. K. et al. , (1988) Science, 239，487-491)的方法。具體地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地使用Drol基因的核苷酸序列(SEQ ID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列)或其一部分作為探針，或者使用與Drol基因(SEQ IDNO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列)特異雜交的寡核苷酸作為引物，從水稻或其它植物分離與Drol基因高度同源的DNA。本發(fā)明的DNA還包括此類編碼在功能上與Drol蛋白等價(jià)的蛋白質(zhì)，可以通過使用雜交或PCR技術(shù)加以分離的DNA。為了分離這種DNA，雜交反應(yīng)優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)剡x擇嚴(yán)格雜交條件。例如，可以在含有25%甲酰胺，或者在更嚴(yán)格條件下含有50%甲酸胺，和 4x SSC, 50mM Hepes (pH 7· O)，IOxDenhardt ’ s 溶液，和 20 μ g/ml 變性鮭魚精子DNA的雜交溶液中在42° C過夜進(jìn)行預(yù)雜交；然后添加標(biāo)記探針，并通過在42° C過夜溫育進(jìn)行雜交。雜交后的清洗可以用如下條件的清洗溶液和溫度進(jìn)行例如大約“2xSSC, O. 1%SDS, 50° C”，“2x SSC, O. 1%SDS, 42。C”, “Ix SSC, 0. 1%SDS, 37。C”;更嚴(yán)格的條件為大約 “2x SSC, O. 1%SDS, 65。C”，“0. 5x SSC, 0. 1%SDS, 42。C” ；再更嚴(yán)格的條件為大約“0. 2x SSC，0. 1%SDS，65° C”。隨著雜交嚴(yán)格度的提高，預(yù)期可以分離與探針序列相似度更高的DNA。然而，上述的SSC、SDS和溫度條件組合僅僅是舉例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過合適地組合上述和其它決定雜交強(qiáng)度的元素(例如探針濃度、探針長(zhǎng)度或雜交反應(yīng)時(shí)間)可以實(shí)現(xiàn)相似的強(qiáng)度。因此，由這種分離的DNA編碼的蛋白質(zhì)可預(yù)期在氨基酸水平上與Drol蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 3，13或15)高度相似。而且，該DNA預(yù)期在核苷酸序列水平上與編碼Drol蛋白的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: I, 2，12，14，16或17)高度相似。高度相似是指在整個(gè)氨基酸或核苷酸序列上的序列同一性為至少50%或更高，優(yōu)選地70%或更高，更優(yōu)選地90%或更高(例如91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或更高)。這種氨基酸序列或核苷酸序列相同度可以用Karin and Altschul的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:2264-2268，1990; Proc Natl Acad Sci USA 90:5873，1993)加以確定。根據(jù) BLAST算法已經(jīng)開發(fā)出了被稱作BLASTN和BLASTX的程序(Altschul SF, et al. , J Mol Biol215:403, 1990)。當(dāng)用BLASTN分析核苷酸序列時(shí)，參數(shù)可以設(shè)定為例如得分(score)=100，字長(zhǎng)(wordlength)=12?；蛘撸?dāng)用BLASTX分析氨基酸序列時(shí),參數(shù)可以設(shè)定為例如得分=50和字長(zhǎng)=3。當(dāng)使用BLAST和間隙BLAST程序時(shí)，可以使用每個(gè)程序的默認(rèn)參數(shù)。具體的程序是這些分析方法已知的。
本發(fā)明的DNA可以用于例如制備重組蛋白和產(chǎn)生具有深根性性狀的植物轉(zhuǎn)化體。重組蛋白的制備通常是通過將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入到合適的表達(dá)載體中，將載體導(dǎo)入到合適的細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，和純化表達(dá)的蛋白。重組蛋白可以作為和其它蛋白的融合蛋白加以表達(dá)，以便使純化更容易，例如作為與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白，使用大腸桿菌作為宿主(New England Biolabs，USA，pMAL載體系列)，作為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白(Amersham Pharmacia Biotech, pGEX載體系列)，或者加組氨酸標(biāo)簽(Novagen，pET series)。宿主細(xì)胞沒有特別限制,只要該細(xì)胞適合于表達(dá)重組蛋白即可。除了上述的大腸桿菌之外，可能使用例如酵母、各種植物或動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。載體可以通過各種領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。例如，使用鈣離子的導(dǎo)入方法可以用于導(dǎo)入到大腸桿菌中(MandeI, M. &Higa, A. (1970) Journal of MolecularBiology,53,158-162;Hanahan, D. (1983)Journal of Molecular Biology, 166，557-580)。在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)物上清純化和回收。當(dāng)作為與上述的麥芽糖結(jié)合蛋白等的融合蛋白表達(dá)時(shí)，重組蛋白可以容易地利用親和力來純化。作為另一選擇，可以通過如下文所述的技術(shù)來產(chǎn)生導(dǎo)入了本發(fā)明DNA的植物轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以從這類植物制備。因此，本發(fā)明的植物轉(zhuǎn)化體不但包括導(dǎo)入了本發(fā)明DNA來賦予植物深根性性狀的植物，還包括導(dǎo)入了本發(fā)明DNA以便制備本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物。它們?cè)谙挛挠忻枋?。所得的重組蛋白可用于制備與該蛋白結(jié)合的抗體。多克隆抗體可以例如如下地加以制備。將用于免疫的動(dòng)物例如家兔用本發(fā)明的純化蛋白或其部分肽進(jìn)行免疫；一定時(shí)期后，采集它們的血液，并除去血凝塊。同時(shí)，單克隆抗體可如下制備。使骨髓瘤細(xì)胞與來自用上述蛋白或肽免疫的動(dòng)物的產(chǎn)抗體細(xì)胞融合；分離產(chǎn)生感興趣抗體的單克隆細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)；并從該細(xì)胞獲得抗體。所得的抗體可用于純化或檢測(cè)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。本發(fā)明包括可與本發(fā)明蛋白結(jié)合的抗體。這些抗體可用于檢測(cè)植物中Drol蛋白的表達(dá)位點(diǎn)，或者評(píng)估植物物種是否表達(dá)Drol蛋白。例如,Kinandang Patong型Drol蛋白的第227-251位的氨基酸序列是具有深根性性狀的栽培種的特征序列。因此，特異識(shí)別該整個(gè)序列或其部分的抗體可用于評(píng)估植物物種是否表達(dá)Kinandang Patong型Drol蛋白(其是否具有深根性性狀)。本發(fā)明還提供了包括Drol基因的載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞。關(guān)于本發(fā)明的載體，例如，當(dāng)宿主是大腸桿菌時(shí)，只要載體具有用于在大腸桿菌中擴(kuò)增的“ori”從而使載體能夠在大腸桿菌(例如JM109、DH5 a、HBlOl和XLlBlue)等宿主中大量擴(kuò)增和制備，并且進(jìn)一步具有選擇基因用于篩選轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(例如藥物耐受基因，可允許用藥物(氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等)加以區(qū)分)即可，載體沒有限制。這些載體包括例如Μ13載體，pUC載體，pBR322, pBluescript和pCR-Script。除了上述載體之外，也可以使用例如pGEM-T，pDIRECT和pT7進(jìn)行亞克隆和cDNA切取。當(dāng)使用載體產(chǎn)生Drol蛋白時(shí)，表達(dá)載體是特別有用的。當(dāng)表達(dá)載體在例如大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，它應(yīng)當(dāng)具有上述特征以便能夠在大腸桿菌中擴(kuò)增。此外，當(dāng)使用大腸桿菌例如JM109，DH5 α，ΗΒ101,或XLl-Blue作為宿主時(shí)，載體必須具有允許其在大腸桿 菌中高效表達(dá)的啟動(dòng)子，例如IacZ啟動(dòng)子(Ward etal. Nature 341:544-546，1989;FASEBJ. 6:2422-2427, 1992)，araB 啟動(dòng)子(Better et al. Science 240:1041-1043，1988)，或 T7啟動(dòng)子。其它載體實(shí)例包括 PGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress 系統(tǒng)” (QIAGEN)，pEGFP,和 pET。進(jìn)一步，載體可以包含用于多肽分泌的信號(hào)序列。當(dāng)希望使產(chǎn)生的多肽進(jìn)入大腸桿菌的外周質(zhì)時(shí)，可以使用PelB信號(hào)序列(Lei, S. P. etal. J. Bacteriol. 169:4379(1987))作為多肽分泌的信號(hào)序列。例如，可以使用氯化鈣或電穿孔方法將載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。用于在植物體表達(dá)的載體包括pMHl，pMH2, pCAMBIA
坐寸ο除了大腸桿菌之外，也可以使用其它來源的表達(dá)載體作為產(chǎn)生Drol蛋白的載體，例如哺乳動(dòng)物來源(例如 pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic AcidsRes. 18(17) :5322 (1990))，pEF，和 pCDM8)，昆蟲細(xì)胞來源(例如 “Bac-to-BAC 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(GIBC0-BRL)和pBacPAK8)，植物來源(例如pMHl和pMH2)，動(dòng)物病毒來源(例如pHSV, pMV,和pAdexLcw)，逆轉(zhuǎn)錄病毒來源(例如pZIPneo)，酵母來源(例如“Pichia表達(dá)試劑盒” (Invitrogen)，pNVll和SP-QOI)，和枯草桿菌來源(例如pPL608和pKTH50)。例如在動(dòng)物細(xì)胞如CH0、COS和ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞中，載體必須具有一個(gè)在這些細(xì)胞內(nèi)表達(dá)必需的啟動(dòng)子，例如 SV40 啟動(dòng)子(Mulligan et al. Nature277:108 (1979)), MMLV-LTR啟動(dòng)子，EFla 啟動(dòng)子(Mizushima et al. Nucleic Acids Res. 18:5322 (1990))，或CMV啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，載體包括一個(gè)用于選擇轉(zhuǎn)化體的基因(例如能夠通過藥物(例如新霉素或G418)加以區(qū)分的抗藥性基因)。具有這些特征的載體的實(shí)例包括pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 和 p0P13。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以用作例如表達(dá)或生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)。這些蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)包括體外和體內(nèi)系統(tǒng)。當(dāng)使用真核細(xì)胞時(shí)，可以使用例如動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞，作為宿主細(xì)胞。已知的動(dòng)物細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(除了上述的CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞之夕卜，還有其它細(xì)胞例如3T3，myeloma細(xì)胞，BHK (幼倉(cāng)鼠腎)，HeLa和Vero)，兩棲動(dòng)物細(xì)胞(例如非洲爪蛙卵母細(xì)胞(Valle, et al.，Nature (1981) 291，358-340))，和昆蟲細(xì)胞(例如sf9, sf21,和 Tn5 細(xì)胞)。在 CHO 細(xì)胞中，DHFR 基因缺失的 CHO 細(xì)胞 dhfr-CHO (Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1980) 77，4216-4220)和 CHO K-I (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60，1275)可以優(yōu)選地用在本發(fā)明中。CHO細(xì)胞對(duì)于大規(guī)模表達(dá)是特別優(yōu)選的。植物細(xì)胞包括例如下述植物來源的細(xì)胞以及已知作為蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的煙草來源的細(xì)胞。有可能從細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織。同時(shí)，真菌細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，例如酵母屬細(xì)胞如釀酒酵母；絲狀真菌細(xì)胞，例如曲霉屬如黑曲霉，但并不僅限于此。本發(fā)明還提供了導(dǎo)入了本發(fā)明DNA或載體的上述細(xì)胞。而且，本發(fā)明涉及被Drol基因轉(zhuǎn)化的植物，其具有深根性性狀。 植物是否具有深根性性狀可以通過將其與對(duì)照進(jìn)行比較加以評(píng)估。這里，只要與對(duì)照相比，植物轉(zhuǎn)化體的根在土壤中相對(duì)于地表以更深的角度延伸，即使該角度差異非常小，轉(zhuǎn)化體就可被判定為“具有深根性性狀”。植物轉(zhuǎn)化體的根在土壤中相對(duì)于地表是否以更深的角度延伸可以通過上述的方法加以評(píng)估。這里，“對(duì)照”是指與本發(fā)明植物轉(zhuǎn)化體具有相同的類型，但是沒有人工導(dǎo)入本發(fā)明DNA或不具有任何本發(fā)明DNA的植物。這里，對(duì)照沒有特殊的限制，只要它是與本發(fā)明植物轉(zhuǎn)化體類型相同但沒有導(dǎo)入本發(fā)明DNA或不具有任何本發(fā)明DNA的植物即可。因此，本發(fā)明的“對(duì)照”還包括人工導(dǎo)入了非本發(fā)明DNA的植物。這些植物包括，但不僅限于，例如與本發(fā)明植物轉(zhuǎn)化體類型相同，但是用除本發(fā)明DNA之外的DNA、本發(fā)明DNA中導(dǎo)入了導(dǎo)致功能喪失的突變的DNA、對(duì)本發(fā)明DNA進(jìn)行改造變成抑制其功能的DNA、或者僅含有本發(fā)明DNA的不足以發(fā)揮該DNA功能的一部分的DNA片段轉(zhuǎn)化了的植物。用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物沒有特殊的限制，只要它們具有深根性性狀即可，并可以在任何其它部分含有修飾。這些位于任何其它部分中的修飾包括例如穗形改變，但不僅限于此。植物轉(zhuǎn)化體可以用本發(fā)明的DNA通過如下程序加以制備。將DNA或插入有DNA的載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞。然后，從所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物。在本發(fā)明中，優(yōu)選的載體是能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)所插入基因的載體，包括上述的載體(例如pMHl，pMH2和pCAMBIA載體);然而，載體并沒有特殊限制。本發(fā)明的載體可以包括例如啟動(dòng)子(例如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)，用于在植物細(xì)胞內(nèi)組成性基因表達(dá)。當(dāng)使用這種啟動(dòng)子時(shí)，設(shè)計(jì)本發(fā)明的DNA可操作地連接在啟動(dòng)子的下游的DNA。然后，將設(shè)計(jì)的包含該DNA的載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)。通過再生所得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以獲得表達(dá)本發(fā)明DNA的植物轉(zhuǎn)化體。因此，本發(fā)明還提供了將本發(fā)明DNA操作連接在啟動(dòng)子下游而得到的DNA。這里，“可操作地連接”的意思是啟動(dòng)子序列與本發(fā)明的DNA連接，從而當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子序列結(jié)合時(shí)可誘導(dǎo)DNA的表達(dá)。除了上述之外，有可能使用具有在受到外界刺激時(shí)能夠以可誘導(dǎo)的方式激活的啟動(dòng)子的載體?？蓪?dǎo)入前述DNA或載體的植物物種沒有特殊的限制，包括例如單子葉植物。單子葉植物包括但不僅限于屬于禾本科、百合科、鳳梨科、棕櫚科、天南星科、姜科和蘭科的植物。屬于禾本科的植物包括但不僅限于水稻、麥類品種(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗、貓尾草、草地早熟禾、鴨茅、意大利黑麥草、多年生黑麥草、葦狀羊茅和百喜草?？蓪?dǎo)入前述DNA或載體的植物細(xì)胞沒有特殊的限制，可以處于任何形式，只要它們能夠用于再生植物即可。例如，可以使用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉片切片、愈傷組織和萌發(fā)的種子。將前述DNA或載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行，例如聚乙二醇法、電穿孔、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法和基因槍方法。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法中，例如Nagel 等(Nagel, R. et al. FEMS Microbiol. Lett. 67，1990，325-328)的方法，可以通過將插入了 DNA的表達(dá)載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，并通過直接感染或葉盤方法用農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，從而將DNA導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)。上述載體包含表達(dá)啟動(dòng)子，從而例如使本發(fā)明的DNA在導(dǎo)入到植物體內(nèi)后能夠在植物體內(nèi)表達(dá)。一般地，本發(fā)明的DNA位于啟動(dòng)子的下游，而終止子進(jìn)一步位于該DNA的下游。用于本目的的重組載體由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)植物類型和導(dǎo)入的方法適當(dāng)?shù)丶右赃x擇。 上述啟動(dòng)子包括例如來自花椰菜花葉病毒的CaMV35S和來自玉米的遍在蛋白啟動(dòng)子(JP-A (Kokai) H02-79983)。上述終止子的實(shí)例可以是花椰菜花葉病毒來源的終止子和胭脂氨酸合酶基因的終止子；然而，啟動(dòng)子和終止子并沒有限制，只要它們?cè)谥参飪?nèi)發(fā)揮功能即可。從植物細(xì)胞再生植物可以根據(jù)植物的類型通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來進(jìn)行。實(shí)例包括如下的方法，但不僅限于對(duì)于水稻，F(xiàn)ujimura等的方法(Fujimura. et al. Tissue CultureLett. 2, 1995, 74);對(duì)于小麥，Harris等的方法(Harris, R. et al. Plant CellReports. 7, 1988, 337-340)和 Ozgen 等的方法(Ozgen,Μ· et al.Plant CellReports. 18, 1998, 331-335)對(duì)于大麥，Kihara和 Funatsuki 的方法(Kihara, M. and Funatsuki, H. BreedingSci. 44, 1994, 157-160)和 Lurs 和 Lorz 的方法(Lurs, R. and Lorz, H. Theor. Appl.Genet. 75，1987，16-25);對(duì)于玉米，Shillito等的方法(Shillito, R. D.，et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581-587)和 Gordon-Kamm 等的方法(Gordon-Kamm，ff. J. et al. PlantCell. 2(7), 1990，603—618);對(duì)于高梁，Wen等的方法(Wen, F. S. , et al. Euphytica. 52, 1991, 177-181)和Hagio 的方法(Hagiο, T. Breeding Sci. 44, 1994, 121-126);對(duì)于黑麥，Castillo等的方法(Castillo A. M. ,Vasil V. ,Vasil I. K. (1994)Nature Biotechnology 12:1366-1371.);對(duì)于燕麥，Cho等的方法(Cho M. J.，WEN J.，LEMAUX P. G.，(1999) Plant science148:9-17.);對(duì)于珍珠粟，0，Kennedy等的方法(O，Kennedy Μ. Μ. , Burger J. Τ. , BothaF.C. (2004)Plant Cell Reports 22:684-690.);對(duì)于草地早熟禾，Ha等的方法(Ha C. D. , Lemaux P. G. , Cho M. J. (2001) In VitroCellular&Developmental Biology-Plant 37:6-11·);
對(duì)于鴨茅，CHO等的方法(CHO M. J. , CHOI H. ff. , LEMAUX P. G. (2001)Plant cellreports 20:318-324.);對(duì)于意大利黑麥草，Ye等的方法(Ye X. , Wang Z. Y. , Wu X. , PotrykusI. , Spangenberg G. (1997)Plant Cell Reports 16:379-384.);對(duì)于黑麥草，Spangenberg等的方法(Spangenberg G. , Wang Z. Y. , Wu X. , NagelJ.,Potrykus I. (1995)Plant science 108:209-217.);對(duì)于華狀羊茅，Wang等的方法(Wang Z. Y. , Takamizo T. , Iglesias V. A. , OsuskyM. , Nagel J. , Potrykus I.,Spangenberg G. (1992)Nature BiotechnologylO:691-696.);和對(duì)于百喜草，Smith等的方法(Smith R. L. , Grando M. F. , Li Y. Y. , SeibJ. C. , Shatters R. G. (2002)Plant Cell Reports 20:1017-1021·)。 可以導(dǎo)入本發(fā)明DNA的植物可以是外植體，或者可以將DNA導(dǎo)入到從這些植物制備的培養(yǎng)細(xì)胞中。本發(fā)明中的“植物細(xì)胞”包括例如葉、根、莖、花、種子內(nèi)的胚子葉、不成熟的胚的植物細(xì)胞；愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞；和萌發(fā)的種子，但不僅限于此。為了高效地選擇出通過導(dǎo)入本發(fā)明DNA而被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選地將重組載體與合適的選擇標(biāo)記基因或包含選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒載體一起導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)。用于本目的的選擇標(biāo)記基因包括例如抵抗抗生素潮霉素的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，抵抗卡那霉素或慶大霉素的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，和抵抗除草劑草胺膦的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。將導(dǎo)入了重組載體的細(xì)胞置于含有合適的選擇劑(取決于所導(dǎo)入的選擇標(biāo)記基因的類型)的已知選擇培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)。這樣，可以獲得被轉(zhuǎn)化植物的培養(yǎng)細(xì)胞。接著,在馴化培養(yǎng)基(acclimation medium)中培養(yǎng)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植物體。然后使該馴化的再生植物在通常的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，以獲得具有深根性性狀的植物，在它們成熟并且結(jié)實(shí)之后便能夠獲得種子。具體地，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括如下的步驟(a)和(b)。本發(fā)明還提供了用于賦予植物深根性性狀的方法，其包括下面的步驟(a)和(b)(a)將本發(fā)明的DNA(Drc)I基因)或攜帶該DNA (Drol基因)的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞；和(b)從在步驟(a)中導(dǎo)入了該DNA或載體的植物細(xì)胞再生植物。上述用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法還可以包括步驟(c)選擇被賦予了深根性性狀的植物。在以這種方式再生和生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化植物中導(dǎo)入的外來DNA的存在可以通過已知的PCR方法或Southern雜交方法加以確認(rèn)，或者通過分析植物體中DNA的核苷酸序列來確認(rèn)。這種情況下，可以根據(jù)已知的方法從轉(zhuǎn)化植物提取DNA,例如通過J. Sambrook等(Molecular Cloning, the 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。在使用PCR方法分析再生植物體中存在的包含本發(fā)明的DNA外來基因時(shí)，用從上述的再生植物體中提取的DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)還可以在含有合成寡核苷酸引物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行，該合成的寡核苷酸包括根據(jù)本發(fā)明DNA的核苷酸序列適當(dāng)?shù)剡x擇的核苷酸序列。在擴(kuò)增反應(yīng)中，DNA的變性、退火和延伸反應(yīng)可以重復(fù)數(shù)十次，以獲得含有本發(fā)明DNA序列的DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物。通過對(duì)含有擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)混合物進(jìn)行例如瓊脂糖凝膠電泳，可以分離各種種類的DNA片段，借此能夠確認(rèn)是否有某個(gè)DNA片段與本發(fā)明的DNA相對(duì)應(yīng)。本發(fā)明還涉及通過將Drol基因或攜帶Drol基因的載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的具有深根性性狀的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括將Drol基因或攜帶Drol基因的載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)的步驟。進(jìn)一步，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化植物包括通過下面的步驟(a)-(d)產(chǎn)生的，并具有深根性性狀的 轉(zhuǎn)化植物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法包括如下步驟(a)將Drol基因或攜帶Drol基因的載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中；(b)確定步驟(a)中的植物細(xì)胞內(nèi)人工導(dǎo)入的Drol基因或攜帶Drol基因的載體的拷貝數(shù)；(c)選擇人工導(dǎo)入的Drol基因或攜帶Drol基因的載體的拷貝數(shù)為1(含有單拷貝的基因或載體)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(d)從步驟(C)中選擇的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物。在上述方法中，在植物從包含Drol基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生之后，可以確定植物體內(nèi)人工導(dǎo)入的Drol基因或攜帶Drol基因的載體的拷貝數(shù)，以選擇拷貝數(shù)為I的植物。因此，本發(fā)明涉及通過下面的步驟(a)-(c)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，其具有深根性性狀。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括如下步驟(a)將Drol基因或攜帶Drol基因的載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，并從該植物細(xì)胞再生植物；(b)確定步驟(a)中植物內(nèi)人工導(dǎo)入的Drol基因或攜帶Drol基因的載體的拷貝數(shù)；和(c)選擇人工導(dǎo)入的Drol基因或攜帶Drol基因的載體的拷貝數(shù)為I的轉(zhuǎn)化植物；將Drol基因或攜帶Drol基因的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞并從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物可以通過上述的方法實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)化植物中Drol基因或攜帶Drol基因的載體的拷貝數(shù)可以通過例如Southern印跡分析、實(shí)時(shí)PCR方法、核苷酸序列分析等加以確定。然而，這些方法并不僅限于這些實(shí)例。這里，“拷貝數(shù)”是指通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到植物體內(nèi)的Drol基因或攜帶該基因的載體的數(shù)目。具體地，這里，“拷貝數(shù)”不包括植物中內(nèi)源Drol基因(內(nèi)源基因)的數(shù)目。如這里的實(shí)施例中所述，本發(fā)明人從其中人工導(dǎo)入的Drol基因的拷貝數(shù)為I的轉(zhuǎn)化植物(TO代)產(chǎn)生了 Tl代植物，并檢查了深根率與估算的Tl中Drol基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果證明，在Tl代中，純合型植物(人工導(dǎo)入的Drol基因的拷貝數(shù)2)的深根率比缺失型植物(人工導(dǎo)入的Drol基因的拷貝數(shù)0)和雜合型植物(人工導(dǎo)入的Drol基因的拷貝數(shù)1)的深根率更大。因此，本發(fā)明特別優(yōu)選的植物包括人工導(dǎo)入的Drol基因的拷貝數(shù)為2 (純合型)的Tl代轉(zhuǎn)化植物，其從人工導(dǎo)入的Drol基因的拷貝數(shù)為I的TO代轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生。具體地，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用如下方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，該方法除了包括上述步驟(a)-(d)或(a)-(c)之外還包括下述的步驟。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，其除了包括上述步驟(a)-(d)或(a)-(c)之外還包括下述的步驟-通過使在步驟(d)或(C)中獲得的植物轉(zhuǎn)化體雜交產(chǎn)生植物；和-從上述步驟獲得的植物中選擇對(duì)Drol基因而言為純合的植物。通過雜交從TO代植物產(chǎn)生Tl代植物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通過雜交產(chǎn)生的植物中Drol基因的拷貝數(shù)(缺失型、雜合型和純合型)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以確定，例如Southern印跡分析和實(shí)時(shí)PCR方法。一旦生成了在染色體中導(dǎo)入了本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化植物，可以通過從該植物進(jìn)行有性和無性繁殖獲得其后代。作為另一選擇，可以從該植物、其后代或克隆分離的細(xì)胞、器官或繁殖材料(例如種子、果實(shí)、切穗、塊莖、塊根、插枝(Stock)、愈傷組織和原生質(zhì)體)大規(guī)模產(chǎn)生植物。本發(fā)明包括人工導(dǎo)入了本發(fā)明DNA的植物細(xì)胞；包含該細(xì)胞的植物；該植物的器官(例如花、葉、根、莖等)；該植物的后代和克?。缓驮撝参锖推浜蟠涂寺〉姆敝巢?料。這些植物細(xì)胞、包含該細(xì)胞的植物、該植物的器官、該植物的后代和克隆、和該植物和其后代和克隆的繁殖材料可以用于賦予植物深根性性狀。同時(shí)，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物包括例如單子葉植物。單子葉植物包括，但不僅限于，屬于禾本科、百合科、鳳梨科、棕櫚科、天南星科、姜科和蘭科的植物。屬于禾本科的植物包括，但不僅限于，稻和麥類(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗、貓尾草、草地早熟禾、鴨茅、意大利黑麥草、多年生黑麥草、葦狀羊茅和百喜草。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及從下述的至少一種獲得的加工食品本發(fā)明的細(xì)胞、繁殖材料和器官。這里，加工食品是指可供人類食用的形式的產(chǎn)品，其通過對(duì)植物，例如稻、和麥類(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗和貓尾草，或其部分(細(xì)胞、繁殖材料、器官等)進(jìn)行人工加工而產(chǎn)生。在本發(fā)明中，加工包括如下處理，例如煮、煨、煸炒、蒸、油炸和粉碎，但不僅限于?！胺鬯椤卑摿：湍朊住１景l(fā)明的加工食品包括由上述處理中的至少一種產(chǎn)生的加工食品。本發(fā)明優(yōu)選加工食品的一個(gè)實(shí)例是通過對(duì)水稻種子進(jìn)行脫粒和碾米，隨后加熱獲得的加工食品。具體地，本發(fā)明的加工食品包括，但不僅限于，通過碾米獲得的烹飪好的大米產(chǎn)品(包括冷凍米飯和無菌米飯)，米粉、米餅、米線、日式碎塊小年糕、日本米餅、小甜餅、味噌(發(fā)酵的大豆糊)、醬油、豆腐(發(fā)酵的大豆凝乳)、面包、蕎麥面、小麥面條、面團(tuán)、面條例如中國(guó)面條(生面條(raw noodle)、干面條、煮面條等)、谷類食品和玉米片。作為商業(yè)產(chǎn)品的本發(fā)明加工食品的外觀沒有特殊限制。外觀的實(shí)例包括在環(huán)境溫度或低溫下銷售流通，并且在食用/飲用時(shí)用加熱廚具例如微波爐加熱到室溫或更高溫度的產(chǎn)品形態(tài)。具體地，作為商業(yè)產(chǎn)品的配置包括，但不僅限于可以在便利店、超市、熟食店等出售的便當(dāng)、飯團(tuán)和熟面條。本發(fā)明的加工食品可以處于容器包裝形式。例如，食物可以包裝在模壓塑料容器中，或者包裝在蒸煮袋等中，在密封后滅菌。本發(fā)明的“從細(xì)胞、繁殖材料或器官的至少一種獲得的加工食品”還可以稱為“從細(xì)胞、繁殖材料或器官的至少一種產(chǎn)生的加工食品”，“包含細(xì)胞、繁殖材料或器官中至少一種的加工食品”，或者“通過對(duì)細(xì)胞、繁殖材料或器官中的至少一種進(jìn)行加工獲得的加工食
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進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用于評(píng)估植物是否具有深根性性狀的方法，其包括如下所述的步驟(a)-(c)，其中當(dāng)分子量或核苷酸序列相同時(shí)則判定測(cè)試植物具有深根性性狀或者潛在具有深根性性狀(a)從測(cè)試植物制備DNA樣品；(b)從DNA樣品擴(kuò)增本發(fā)明DNA(Drol基因)的全部或一部分區(qū)域；和(c)將擴(kuò)增的DNA片段與本發(fā)明DNA(Drc)I基因)的分子量或核苷酸序列進(jìn)行比 較。這種優(yōu)選的Drol基因部分是包括Drol基因的第4外顯子，更優(yōu)選從Drol基因第4外顯子的5’端起第116位bp的核苷酸(SEQ ID NO: 2核苷酸序列第943位的核苷酸)的區(qū)域(例如包括SEQ ID NO: 2核苷酸序列第943位核苷酸的由至少100，50，40，30，20，10,9，8，7，6，5，4，3，2或I個(gè)核苷酸構(gòu)成的區(qū)域)，但不僅限于此。本發(fā)明人揭示,在KinandangPatong中，從Drol基因外顯子4的5’端開始第116位bp的核苷酸(SEQ ID NO: 2核苷酸序列第943位的核苷酸)是腺嘌呤，而在IR64中該核苷酸被刪除。因此，測(cè)試植物是否具有深根性性狀可以通過檢查這一核苷酸的存在與否加以評(píng)估。具體地，本發(fā)明提供了用于評(píng)估植物是否具有深根性性狀的方法，其包括檢測(cè)在SEQID NO: 2核苷酸序列第943位核苷酸是否存在的步驟，其中當(dāng)檢測(cè)到該核苷酸時(shí)，則判定測(cè)試植物具有深根性性狀。單核苷酸缺失可以通過比較包含全部或部分Drol基因的區(qū)域的核苷酸序列或分子量來檢測(cè)。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用于評(píng)估植物是否具有深根性性狀的方法，其包括用包含SEQID N0:8和9核苷酸序列的引物并以從測(cè)試植物制備的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR的步驟。在這些方法中，當(dāng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物具有深根性性狀。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用于評(píng)估植物是否具有深根性性狀的方法，其包括用包含SEQID NO: 10和11核苷酸序列的引物并以從測(cè)試植物制備的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR的步驟。在這些方法中，當(dāng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物具有深根性性狀。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用于在評(píng)估植物是否具有深根性性狀時(shí)使用的引物。這種引物包括，但不僅限于，包含SEQ ID NO:8-11中的任一核苷酸序列的DNA。這里，“評(píng)估植物是否具有深根性性狀”不僅意味著評(píng)估迄今已經(jīng)在栽培的栽培種是否具有深根性性狀，還意味著評(píng)估通過雜交或使用遺傳工程技術(shù)新近開發(fā)出的栽培種是否具有深根性性狀。在本發(fā)明用于評(píng)估植物是否具有深根性性狀的方法中，通過測(cè)試植物是否具有編碼功能Kinandang Patong型Drol蛋白的DNA對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。可以通過檢查基因組DNA的與Drol相當(dāng)?shù)膮^(qū)域的分子量的差異，或者核苷酸序列的差異來評(píng)估植物是否具有編碼功能性(Kinandang Patong 型)Drol 蛋白的 DNA。在本發(fā)明的評(píng)估方法中，首先，制備(提取)DNA樣品，然后從DNA樣品擴(kuò)增相應(yīng)于Drol基因的DNA區(qū)域。接著，將從具有深根性性狀的栽培種Drol基因的DNA區(qū)域擴(kuò)增的DNA片段的分子量與從測(cè)試植物DNA樣品擴(kuò)增的DNA片段的分子量進(jìn)行比較。當(dāng)分子量相同時(shí)，則判定測(cè)試植物具有深根性性狀。作為另一選擇，將從具有深根性性狀的栽培種Drol基因的DNA區(qū)域擴(kuò)增的DNA片段的核苷酸序列與從測(cè)試植物DNA樣品擴(kuò)增的DNA片段的核苷酸序列進(jìn)行比較。當(dāng)核苷酸序列相同時(shí)，則判定測(cè)試植物具有深根性性狀。DNA樣品可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以制備(提取)。這些優(yōu)選的制備方法包括例如通過CTAB方法提取DNA的方法。待通過本發(fā)明評(píng)估方法評(píng)估的DNA樣品沒有特別限制。一般地，將從測(cè)試植物提取的基因組DNA用作DNA樣品。而且，待收集的基因組DNA的來源沒有特別限制，它們可以從任何植物組織中提取，例如穗、葉、根、莖、種子、胚乳、麩或胚芽。然而，來源并不僅限于這些實(shí)例。在本發(fā)明的評(píng)估方法中，通過PCR等方法擴(kuò)增本發(fā)明Drol基因的DNA區(qū)域。本發(fā)明“Drol基因的DNA區(qū)域”是指相應(yīng)于Drol基因基因組DNA區(qū)域的一部分(例如SEQ IDNO: I的DNA區(qū)域)。待擴(kuò)增的區(qū)域可以是整個(gè)基因組DNA或基因組DNA的一部分(例如編碼蛋白質(zhì)的ORF區(qū)域或其一部分)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠通過合適地選擇反應(yīng)條件等進(jìn)行PCR。在進(jìn)行PCR時(shí)，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物可以用同位素如32P、熒光染料、生物素等標(biāo)記的引物加以標(biāo)記。作為另一選擇，在進(jìn)行PCR時(shí)，可以通過向PCR混合物添加用同位素如32P、熒光染料、生物素等標(biāo)記的核苷酸底物來標(biāo)記擴(kuò)增出的DNA產(chǎn)物。而且，也可以在PCR之后通過使用Klenow酶等與用同位素32P、熒光染料、生物素等標(biāo)記的核苷酸底物連接來標(biāo)記擴(kuò)增出的DNA片段。 將用這種方法獲得標(biāo)記DNA片段通過加熱等方法變性，并在含有變性劑如尿素或SDS的聚丙烯酰胺凝膠中電泳。使用SDS作為變性劑的SDS-PAGE是本發(fā)明中有利的分級(jí)技術(shù)。SDS-PAGE 可以根據(jù) Laemmli 的方法(Laemmli (1970)Nature 227, 680-685)進(jìn)行。在電泳之后，通過用X-射線膠片放射自顯影、熒光探測(cè)掃描儀等檢測(cè)DNA片段的活動(dòng)性并進(jìn)行分析。當(dāng)不使用被標(biāo)記的DNA時(shí)，DNA片段可以通過在電泳之后用溴化乙錠、銀染等對(duì)凝膠進(jìn)行染色加以檢測(cè)。例如，使用包含SEQ ID N0:8和9核苷酸序列的引物從具有深根性性狀的栽培種(例如Kinandang Patong)和測(cè)試植物擴(kuò)增DNA片段。通過比較它們的分子量評(píng)估可以評(píng)價(jià)植物是否具有深根性性狀。當(dāng)分子量相同時(shí)，則判定測(cè)試植物具有深根性性狀。作為另一選擇，可以通過直接確定測(cè)試植物中相應(yīng)于本發(fā)明DNA的DNA區(qū)域的核苷酸序列，并與具有深根性性狀的栽培種的核苷酸序列進(jìn)行比較，評(píng)估植物是否具有深根性性狀。當(dāng)核苷酸序列相同時(shí)，則判定測(cè)試植物具有深根性性狀。這里，“相同”意味著，對(duì)于兩個(gè)等位基因，基因的分子量或其核苷酸序列或氨基酸序列與具有深根性性狀的植物都相同。因此，“相同”不包括如下情況，即等位基因其中一個(gè)的分子量、核苷酸序列或氨基酸序列與具有深根性性狀的植物相同，但是另一個(gè)與具有深根性性狀的植物不同。上述電泳分析可以根據(jù)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行。例如，通過在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上施加電壓進(jìn)行電泳，然后對(duì)分離的DNA圖譜進(jìn)行分析。同時(shí)，核苷酸序列可以用例如市場(chǎng)上可以獲得的DNA測(cè)序儀加以確定。而且，被鑒定具有深根性性狀的植物可以通過本發(fā)明的評(píng)估方法早期選出。具體地，本發(fā)明提供了用于篩選具有深根性性狀的植物的方法，其包括如下所述的步驟(a)和(b)(a)通過將任意植物與具有深根性性狀的植物進(jìn)行雜交產(chǎn)生栽培種；和(b)通過這里所述的用于評(píng)估測(cè)試植物是否具有深根性性狀的方法評(píng)估步驟(a)中獲得的植物是否具有深根性性狀。
本發(fā)明的篩選方法可以額外地包括如下步驟(C)選擇在步驟(b)被判斷具有深根性性狀的植物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將具有深根性性狀的植物和任意植物雜交。被判斷具有深根性性狀的植物可以通過本發(fā)明的篩選方法早期選出。本發(fā)明還提供了用于早期選擇被判斷具有深根性性狀的植物的方法。這里，“早期”是指例如抽穗之前的階段，優(yōu)選地在緊接萌發(fā)之后的階段。通過使用本發(fā)明的篩選方法，具有深根性性狀的植物品種的育種可以在比過去更短的時(shí)間周期內(nèi)實(shí)現(xiàn)?？捎糜诒景l(fā)明評(píng)估或篩選方法的植物包括例如單子葉植物，但并不僅限于此。單子葉植物包括，但不僅限于，屬于如下科屬的植物禾本科、百合科、鳳梨科、棕櫚科、天南星科、姜科和蘭科。屬于禾本科的植物包括，但不僅限于，水稻、麥類品種(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗、貓尾草、草地早熟禾、鴨茅、意大利黑麥草、多年生黑麥草、葦狀羊茅和百喜草。 本發(fā)明還提供了如下的DNA (寡核苷酸)，其包含至少15個(gè)(例如16，17，18，19，20，21，22，23，24，或25個(gè))與本發(fā)明的Drol基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸。這里，“互補(bǔ)序列”是指相對(duì)于由堿基對(duì)[A:T]和[G:C]構(gòu)成的雙鏈DNA中一條鏈序列的相對(duì)鏈的序列。而且，“互補(bǔ)”的意思不僅包括與至少15個(gè)核苷酸的連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列，還包括在核苷酸序列水平上有至少70%的同一性，優(yōu)選地至少80%，更優(yōu)選地90%，再優(yōu)選地95%或者更多(95%, 96%, 97%, 98%,或99%)的同一性。這些DNA可以用作檢測(cè)或分離本發(fā)明DNA的探針，或者作為用于擴(kuò)增DNA的引物。這些引物包括，但不僅限于，如下所述的引物系列由包含SEQ ID NO: 4和5的核苷酸序列的引物組成的引物系列，用于擴(kuò)增Dro 1-INDEL09，Dro 1-INDEL0 是一個(gè)在 IR64 和 Kinandang Patong 之間具有多態(tài)性的 InDel標(biāo)記；由包含SEQ ID NO: 6和7的核苷酸序列的引物組成的引物系列，用于擴(kuò)增Dro 1-CAPS05，Dro 1-CAPS05 是一個(gè)在 IR64 和 Kinandang Patong 之間具有多態(tài)性的 CAPS 標(biāo)記；由包含SEQ ID NO:8和9的核苷酸序列的引物組成的引物系列，其用于擴(kuò)增SNP02-KP, SNP02-KP 是一個(gè) Kinandang Patong 基因組 DNA 特異的標(biāo)記；由包含SEQ ID NO: 10和11的核苷酸序列的引物組成的引物系列，其用于擴(kuò)增SNP02-IR64, SNP02-IR64是一個(gè)IR64來源的基因組DNA特異的標(biāo)記；進(jìn)一步，本發(fā)明涉及來自Drol基因的20-100個(gè)連續(xù)核苷酸，其包括用植物(例如水稻)來源的基因組DNA作為模板用上述引物擴(kuò)增的完整或部分DNA片段。這些DNA可以用于評(píng)估測(cè)試植物具有深根性還是淺根性。當(dāng)使用本發(fā)明的寡核苷酸作為探針時(shí)，它們優(yōu)選地在適當(dāng)標(biāo)記之后使用。標(biāo)記方法包括例如使用T4多核苷酸激酶用32P磷酸化寡核苷酸的5’端的方法，和通過DNA聚合酶例如Klenow酶使用隨機(jī)引物六聚體寡核苷酸等作為引物將用同位素如32P、熒光染料、生物素等標(biāo)記的底物核苷酸摻入到寡核苷酸中的方法(隨機(jī)引發(fā)方法等)。本發(fā)明的寡核苷酸可以例如用市售的寡核苷酸合成儀來制作。也可以制備限制酶處理等獲得的雙鏈DNA片段作為探針。
進(jìn)一步，本發(fā)明涉及賦予植物深根性性狀的藥劑，其以可表達(dá)的方式包含Drol基因或攜帶該基因的載體。在本發(fā)明藥劑中使用的DNA的類型沒有特別限制，DNA可以是cDNA或基因組DNA。此外，有可能不僅使用編碼水稻來源Drol蛋白的DNA，還使用編碼與該蛋白結(jié)構(gòu)相似的蛋白的DNA(例如突變體、衍生物、等位基因、變異體和同源體)，只要它們?cè)诒粚?dǎo)入到植物體內(nèi)時(shí)能夠賦予植物深根性性狀即可。包含在本發(fā)明藥物試劑的DNA可以被插入在載體內(nèi)。載體沒有限制，只要它們能夠允許被導(dǎo)入的基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)即可。例如，有可能使用含有允許在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)基因表達(dá)的啟動(dòng)子(例如馬鈴薯SK2幾丁質(zhì)酶基因的啟動(dòng)子，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子等)的載體，或者含有可以被外界刺激誘導(dǎo)活化的啟動(dòng)子的載體。本發(fā)明的藥劑可以是上述的DNA或者插入了上述DNA的載體，它們可以和其它用于向植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的成分混合。例如，上述的DNA、插入了上述DNA的載體、導(dǎo)入了上 述DNA的農(nóng)桿菌和包含它們的生化試劑和溶液也包含在本發(fā)明的藥劑內(nèi)。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物，其具有抗旱性。本發(fā)明還涉及從上述植物分離的細(xì)胞、繁殖材料和器官。此外，本發(fā)明涉及從上述細(xì)胞、繁殖材料和器官的至少一種獲得的加工食品。而且，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生抗旱的轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括將本發(fā)明的DNA或載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，并從該植物細(xì)胞再生植物的步驟。本發(fā)明還涉及評(píng)估植物是否抗旱的方法，其包括如下所述的步驟(a)-(c)，當(dāng)分子量或核苷酸序列相同時(shí)，則判定測(cè)試植物是抗旱的。(a)從測(cè)試植物制備DNA樣品；(b)從DNA樣品擴(kuò)增包含本發(fā)明DNA的區(qū)域；和(c)將本發(fā)明DNA的分子量或核苷酸序列與擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行比較。本發(fā)明還涉及用于評(píng)估植物是否抗旱的方法，其包括用包括SEQ ID N0:8和9的核苷酸序列的引物以從測(cè)試植物制備的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR的步驟，其中當(dāng)PCR產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物是抗旱的。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用于評(píng)估植物是否抗旱的方法，其包括用包括SEQID NO: 10和11的核苷酸序列的引物以從測(cè)試植物制備的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR的步驟，其中當(dāng)PCR產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物是不抗旱的。此外，本發(fā)明涉及用于選擇抗旱植物的方法，其包括如下步驟(a)通過將任意植物與抗旱植物雜交產(chǎn)生栽培種；和(b)通過上述用于評(píng)估植物是否抗旱的方法評(píng)估在步驟(a)中產(chǎn)生的植物是否抗旱。根據(jù)本文的描述，可以實(shí)現(xiàn)抗旱轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)生，植物抗旱性的評(píng)估，和抗旱植物的選擇。植物是否抗旱可以通過測(cè)量葉片溫度加以評(píng)估。這里，只要植物轉(zhuǎn)化體的葉片溫度在人工干旱脅迫條件下(在干燥環(huán)境下)與對(duì)照相比降低，即使溫度下降非常小，則判定植物“抗旱”。這里，葉片溫度是指植物葉片表面的溫度。植物通過氣孔吸收二氧化碳用于光合作用。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水分通過氣孔蒸發(fā)到大氣中。結(jié)果導(dǎo)致水分損失。這種現(xiàn)象稱作蒸騰作用。關(guān)于這些聯(lián)系，Takai等已經(jīng)報(bào)道，葉片溫度與光合速率和氣孔擴(kuò)張程度(氣孔導(dǎo)度)負(fù)相關(guān)(Takai et al. , Field Crops Research doi : 10. 1016/j. fcr. 2009. 10. 019. 2009) 氣孔開放越大，蒸騰作用越活躍。蒸騰作用從葉表面帶走熱量，導(dǎo)致葉片溫度降低。當(dāng)植物活躍地進(jìn)行光合作用時(shí)，它打開氣孔，蒸騰作用變得活躍。這導(dǎo)致葉片表面的溫度降低。同時(shí)，在干旱脅迫下，植物通過關(guān)閉氣孔抑制蒸騰作用，以保持細(xì)胞水勢(shì)。這會(huì)阻礙光合作用并提高葉片溫度?？购抵参锛词乖诟珊禇l件下也能夠開放氣孔和進(jìn)行光合作用，與干旱敏感植物相比，葉片溫度更低。Hirayama等報(bào)道，用葉片溫度作為指標(biāo)來選擇抗旱水稻株系可以有效地開發(fā)抗旱水稻栽培種(Hirayama et al. , Breeding Science 56:47-54.2006)。如這里的實(shí)施例中所述，植物葉片溫度是否低可通過使用紅外熱成像儀等裝置在干旱脅迫下對(duì)其進(jìn)行測(cè)試而簡(jiǎn)單地加 以評(píng)估。同時(shí)，光合作用和氣孔擴(kuò)張程度可以通過使用光合成/蒸騰作用測(cè)量系統(tǒng)等裝置在干旱脅迫下進(jìn)行簡(jiǎn)單的測(cè)量來加以評(píng)估，如本文實(shí)施例中所述。進(jìn)一步，已經(jīng)知道，一般的植物在暴露于干旱脅迫時(shí)會(huì)顯示卷葉。特別地，已知水稻葉子會(huì)卷曲成針狀。然而，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物即使在干旱脅迫下也很少顯示卷葉。具體地，本發(fā)明涉及用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的、在干旱脅迫下可抵抗卷葉的植物。本發(fā)明還涉及從上述植物獲得的細(xì)胞、繁殖材料和器官。本發(fā)明還涉及從上述細(xì)胞、繁殖材料和器官中至少一種獲得的加工食品。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生在干旱脅迫下抗卷葉的轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括向植物細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明DNA或載體并從該植物細(xì)胞再生植物的步驟。本發(fā)明還涉及用于評(píng)估植物在干旱脅迫下是否抗卷葉的方法，其包括下述的步驟(a)-(c)，當(dāng)分子量或核苷酸序列相同時(shí)，則判定測(cè)試植物在干旱脅迫下抗卷葉(a)從測(cè)試植物制備DNA樣品；(b)從DNA樣品擴(kuò)增包括本發(fā)明DNA的區(qū)域；和(c)將本發(fā)明DNA的分子量或核苷酸序列與擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行比較。本發(fā)明還涉及用于評(píng)估植物在干旱脅迫下是否抗卷葉的方法，其包括使用包含SEQ ID N0:8和9核苷酸序列的引物以及從測(cè)試植物制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR的步驟，當(dāng)PCR產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物在干旱脅迫下抗卷葉。進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及用于評(píng)估植物在干旱脅迫下是否抗卷葉的方法，其包括使用包含SEQ ID NO: 10和11核苷酸序列的引物以及從測(cè)試植物制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR的步驟，當(dāng)PCR產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物在干旱脅迫下不抗卷葉。此外，本發(fā)明涉及選擇在干旱脅迫下抗卷葉的植物的方法，其包括如下步驟(a)通過將任意植物與在干旱脅迫下抗卷葉的植物進(jìn)行雜交產(chǎn)生栽培種；和(b)通過上述用于評(píng)估植物在干旱脅迫下是否抗卷葉的方法評(píng)估步驟(a)中產(chǎn)生的植物在干旱脅迫下是否抗卷葉。根據(jù)本文的描述，可以實(shí)現(xiàn)在干旱脅迫下抗卷葉的轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)生、植物在干旱脅迫下是否抗卷葉的評(píng)估和在干旱脅迫下抗卷葉的植物的選擇。這里，抗卷葉性是指抵抗由干旱脅迫導(dǎo)致的卷葉。當(dāng)水稻葉脫水時(shí)，葉片內(nèi)部表皮馬達(dá)細(xì)胞(epicuticular motor cell)的膨脹壓降低，結(jié)果葉片卷曲，從而使表皮側(cè)呈凹形。植物是否抗卷葉可以簡(jiǎn)單地通過測(cè)試其葉片在干旱脅迫下是否卷曲來加以評(píng)估。
這里，只要植物轉(zhuǎn)化體中葉片卷曲的程度與對(duì)照相比減少，即使程度差異很輕微，也可以判定植物“抗卷葉”。進(jìn)一步，在干旱脅迫條件下，作物一般經(jīng)常嚴(yán)重不稔，使得成熟的顆粒數(shù)目和實(shí)粒重量降低。這導(dǎo)致最終的糧食產(chǎn)量減少。然而，即使在干旱脅迫下，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物與不具有本發(fā)明DNA的植物(對(duì)照)相比，也能夠產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蛘吒氐膶?shí)粒(實(shí)粒數(shù)目或?qū)嵙Ｖ亓康臏p少被抑制)。具體地，本發(fā)明涉及用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物，其與對(duì)照相比在干旱脅迫下可產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)粒或者更重的實(shí)粒。這種植物也稱作經(jīng)過改良從而可以在干旱脅迫下減少實(shí)粒數(shù)量損失或者實(shí)粒重量損失的植物。作為另一選擇，該植物可以稱作經(jīng)過改良從而在干旱脅迫下具有更大數(shù)量的實(shí)?；蛘吒氐膶?shí)粒的植物。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及從上述植物分離的細(xì)胞、繁殖材料和器官。本發(fā)明還涉及從上述細(xì)胞、繁殖材料和器官中至少一種生產(chǎn)的加工食品。 而且，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生與對(duì)照相比在干旱脅迫下產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒的轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括將本發(fā)明的DNA或載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)并從植物細(xì)胞再生植物的步驟。此外，本發(fā)明涉及用于評(píng)估植物在干旱脅迫下與對(duì)照相比是否產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒的方法，其包括下述的步驟(a)-(c)，其中當(dāng)分子量或核苷酸序列相同時(shí)，則判定測(cè)試植物與對(duì)照相比在干旱脅迫下生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒(a)從測(cè)試植物制備DNA樣品；(b)從DNA樣品擴(kuò)增包括本發(fā)明DNA的區(qū)域；和(c)將本發(fā)明DNA的分子量或核苷酸序列與擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行比較。本發(fā)明還涉及用于評(píng)估植物在干旱脅迫下與對(duì)照相比是否產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒的方法，其包括使用包含SEQ ID N0:8和9核苷酸序列的引物以及從測(cè)試植物制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR的步驟，其中當(dāng)PCR產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物在干旱脅迫下與對(duì)照相比產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒。進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及用于評(píng)估植物在干旱脅迫下與對(duì)照相比是否產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)粒或更重的實(shí)粒的方法，其包括使用包含SEQ ID NO: 10和11核苷酸序列的引物以及從測(cè)試植物制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR的步驟，其中當(dāng)PCR產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，則判定測(cè)試植物在干旱脅迫下與對(duì)照相比不產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒。此外，本發(fā)明涉及用于選擇在干旱脅迫下與對(duì)照相比產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)粒或更重的實(shí)粒的植物的方法，其包括如下步驟(a)通過將任意植物與在干旱脅迫下與對(duì)照相比產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)粒或更重的實(shí)粒的植物進(jìn)行雜交而產(chǎn)生栽培種；和(b)通過上述用于評(píng)估植物在干旱脅迫下與對(duì)照相比是否產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒的方法評(píng)估步驟(a)中產(chǎn)生的植物在干旱脅迫下與對(duì)照相比是否產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)粒。根據(jù)本文的描述，可以實(shí)現(xiàn)上述植物的產(chǎn)生、評(píng)估和選擇。這里，“產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)粒或更重的實(shí)?！钡囊馑际?，與沒有本發(fā)明DNA的對(duì)照相t匕，在干旱脅迫下實(shí)粒的數(shù)量更多，或者在干旱脅迫下實(shí)粒的重量更大。這里，只要與對(duì)照相比，實(shí)粒的數(shù)量更多或者實(shí)粒的重量更大，即使差異非常小，也判定植物“產(chǎn)生更大數(shù)量的實(shí)?；蚋氐膶?shí)?！?。植物實(shí)粒的數(shù)量可以通過例如計(jì)數(shù)所收獲的谷穗中除不稔谷穗之外的實(shí)粒的數(shù)量而容易地加以確定。然而，確定方法并不僅限于該實(shí)例。同時(shí)，植物實(shí)粒的重量可以通過例如對(duì)除不稔谷穗之外所收獲的谷穗中的實(shí)粒稱重而容易地加以確定。然而，確定方法并不僅限于該實(shí)例。SEQ ID NOs相應(yīng)的各個(gè)序列的列表如下SEQ ID NO: I, Kinandang Patong Drol 基因的基因組 DNA 核苷酸序列；SEQ ID NO: 2, Kinandang Patong Drol 基因的 cDNA 核苷酸序列；SEQ ID NO:3, Kinandang Patong Drol 蛋白的氨基酸序列； SEQ ID N0:4和5，用于擴(kuò)增在IR64和Kinandang Patong之間有多態(tài)性的InDel標(biāo)記Drol-INDEL09的引物系列；SEQ ID N0:6和7，用于擴(kuò)增在IR64和Kinandang Patong之間有多態(tài)性的CAPS標(biāo)記Drol-CAPS05的引物系列；SEQ ID N0:8 和 9，用于擴(kuò)增 Kinandang Patong基因組DNA特異標(biāo)記 SNP02-KP 的引物系列；SEQ ID NO: 10和11，用于擴(kuò)增IR64基因組DNA特異標(biāo)記SNP02-IR64的引物系列；SEQ ID NO: 12,高粱Drol基因的CDS核苷酸序列；SEQ ID NO: 13,高粱Drol蛋白的氨基酸序列；SEQ ID NO: 14，玉米Drol基因的CDS核苷酸序列；SEQ ID NO: 15,玉米Drol蛋白的氨基酸序列；SEQ ID NO: 16,在FOX搜尋系統(tǒng)中使用的Nipponbare的cDNA核苷酸序列[這一序列與根據(jù)基因組DNA核苷酸序列確定的cDNA序列(SEQ IDN0:2的核苷酸序列)相比，在5’和3’端各具有Ibp添加。而且，該cDNA在自其核苷酸序列5’端373位bp處(自SEQID NO: 2的5’端372位bp處)有一個(gè)A變成G的核苷酸取代。]SEQ ID NO: 17, Kinandang Patong Drol基因的核苷酸序列和其包含啟動(dòng)子區(qū)域的上游序列；和SEQ ID NO: 18，Nipponbare中與SEQ ID NO: 17相應(yīng)的區(qū)域的核苷酸序列。本文通過提述并入這里索引的全部先前技術(shù)文獻(xiàn)。
實(shí)施例在本發(fā)明中，對(duì)提籃法進(jìn)行了改進(jìn)，以便能夠?qū)ι罡赃M(jìn)行簡(jiǎn)單、可重復(fù)、且節(jié)省空間的評(píng)估。而且，為了將候選核苷酸序列導(dǎo)入到IR64中，對(duì)基于愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了改進(jìn)，并將將基因?qū)氲搅?IR64中。通過圖位克隆方法(map-based cloning)分離和鑒定了深根性基因Drol的核苷酸序列。因此，本發(fā)明人開發(fā)了一種通過用基因容易地修飾深根性而賦予植物避旱能力的技術(shù)。下文中，將參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的介紹，但是不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于此。
「實(shí)施例IlDrol基因座位的鑒定兩個(gè)水稻栽培種Kinandang Patong(—種菲律賓旱稻品種)和IR64(由國(guó)際水稻研究所(International Rice Research Institute)開發(fā)的水田稻)由國(guó)際水稻研究所提供。兩個(gè)栽培種彼此雜交，以獲得用于基因分離的材料。在通過兩個(gè)栽培種雜交產(chǎn)生的BC2F2群體中，一個(gè)群體的第9染色體分離但是其它染色體區(qū)域則盡量固定于IR64純合型，該群體分離成淺根性植物和深根性植物。IR64和Kinandang Patong分別顯示淺根性表型和深根性表型。因此認(rèn)為該分離涉及了負(fù)責(zé)Kinandang Patong的深根性的基因。從該觀點(diǎn)出發(fā)，發(fā)明人對(duì)群體進(jìn)行了徹底的評(píng)估，將植物分成淺根型和深根型，以研究其基因型。結(jié)果顯示，與深根性有關(guān)的數(shù)量性狀座位(QTL)位于第9染色體上(Uga et al. , The 2ndInternational Conference on Plant Molecular Breeding. 2007)。使用能夠定量評(píng)估深根性的提籃法進(jìn)行了詳細(xì)的遺傳分析。具體地，在直徑15cm的塑料籃中填滿土壤并埋置在 花盆(pot)中。播種后，將水稻植株培養(yǎng)到大約8葉齡。根據(jù)深根率對(duì)深根性進(jìn)行評(píng)估，深根率由穿出提籃底部的根數(shù)相對(duì)于從每個(gè)提籃中穿出的總根數(shù)的百分比確定。當(dāng)相對(duì)于地表以超過53°的角度向下延伸時(shí)，根就會(huì)穿出提籃底部。IR64的平均深根率是1.6%，而Kinandang Patong的平均深根率是72. 6%。為了將與深根有關(guān)的QTL定位成單個(gè)基因座位，從BC2F2群體中選出8株在QTL附近區(qū)域內(nèi)有重組的植物。然后，從自交后代(BC2F3)中選出自交固定系(BC2F4)15對(duì)于每個(gè)固定系，在花盆中培養(yǎng)20-23株植物。通過由提籃法確定的深根率推導(dǎo)基因型。在BC2F4系中，QTL周圍區(qū)域固定于IR64型的植株顯示的平均深根率為2.6%，這與IR64的深根率幾乎相當(dāng)。同時(shí)，QTL周圍區(qū)域固定于Kinandang Patong型中的植株顯示的平均深根率為40. 4%。從這些結(jié)果可以清晰地確定它們的QTL基因型。QTL被作為單一的座位定位到InDel標(biāo)記ID07_14和ID07_17之間。因此，QTL被命名為深根相關(guān)座位 “Drol ”(Deeper Rooting I) (Uga et al. , Nihon Ikusyu Gakkai Dai 112KaiKouenkai Youshisyu (112nd Meeting of The Japanese Society of Breeding, Programand Abstracts)PP. 188, 2007;Uga et al. , Dai 27Kai Ne Kenkyu Syukai(27th ResearchMeeting of The Japanese Society for Root Research), 2007;Uga et al. , The 5thInternational Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008)。進(jìn)一步，通過基于簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記公開信息(International Rice Genome Sequencing Project 2005)的多態(tài)性分析，對(duì)位于該區(qū)域中兩個(gè)InDel標(biāo)記之間的SSR標(biāo)記進(jìn)行了評(píng)估。Drol的候選區(qū)域被縮小到位于SSR標(biāo)記RM24393和RM7424之間的608kbp區(qū)域?！笇?shí)施例21高分辨率連鎖分析為了通過圖位克隆方法分離Drol基因，從由4，560株植物構(gòu)成的BC3F2群體中選擇了 359株在候選區(qū)域內(nèi)具有重組的植物。為了用所選植物的后代縮小候選區(qū)域，必須一次對(duì)大量的植物進(jìn)行深根率評(píng)估。由此，本發(fā)明人開發(fā)了一種評(píng)估方法，能夠進(jìn)行水培而無需將提籃埋置在花盆里。在本發(fā)明人開發(fā)的改良提籃法中，將填滿土的直徑7. 5cm的定制不銹鋼提籃置于水培養(yǎng)基中，而不是埋在花盆里。這樣，該方法能夠在相當(dāng)于現(xiàn)有方法所需面積四分之一的空間內(nèi)對(duì)水稻的深根性進(jìn)行評(píng)估。在改良提籃法中，深根定義為相對(duì)于地表以超過50°的角度向下延伸(圖I)。使用改良提籃法，通過對(duì)每個(gè)株系評(píng)估大約40株植物確定深根率。根據(jù)深根率的頻率分布預(yù)測(cè)每個(gè)株系中Drol的基因型。為了縮小基因區(qū)域，通過篩選選擇DNA標(biāo)記。關(guān)于位于,從OryzaSNP聯(lián)合會(huì)的主頁(yè)(http://irfRc.irri. org/index. php option=com content&task=view&id=14&Itemid=106)提取與 IR64和Kinandang Patong近緣的栽培種Azucena中Drol附近的SNP的信息用于設(shè)計(jì)CAPS標(biāo)記。對(duì)CAPS標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果，有6個(gè)標(biāo)記在IR64和Kinandang Patong之間存在多態(tài)性，并使用這6個(gè)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行作圖。而且,構(gòu)建了 IR64和Kinandang Patong的BAC文庫(kù)，并篩選含有候選區(qū)域的克隆。對(duì)選擇到的克隆通過核苷酸測(cè)序進(jìn)行分析。利用所得的序列信息制備11種類型的InDel標(biāo)記和CAPS標(biāo)記，用于在IR64和KinandangPatong之間產(chǎn)生多態(tài)性。使用這些標(biāo)記從359個(gè)株系中選擇重組系。通過連鎖分析，將Drol基因區(qū)域縮小到一個(gè)6. O-kbp區(qū)域內(nèi)，其位于一個(gè) In Del標(biāo)記Drol_INDEL09 (引物:5，-GCAGACGCTCGTAACACGTA-3， (SEQ ID NO:4)和 5，-GTGGCAGCTCCATCAACTCT-3， (SEQ IDN0:5))和一個(gè)CAPS標(biāo)記Drol-CAPS05(引物5’-GCACAAGATGGGAGGAGAGT-3’ (SEQ ID NO:6)和 5’-CATGGGTGAGAATCGTGTTG-3’ (SEQ ID NO: 7);擴(kuò)增的 DNA 用限制酶 Hinf I 消化)之間。對(duì)包含該候選區(qū)域的基因組核苷酸序列進(jìn)行RAP-DB分析，顯示存在一個(gè)預(yù)測(cè)基因。發(fā)現(xiàn)該預(yù)測(cè)基因在IR64序列的外顯子4中具有一個(gè)Ι-bp缺失，造成移框，導(dǎo)致一個(gè)終止密碼子。[實(shí)施例3]用于鑒定Drol基因的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)并評(píng)估Drol基因過表達(dá)植物中的深根率3. I用于鑒定Drol基因的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)通過RAP-DB預(yù)測(cè)的基因被假定是Dro I。將涵蓋Dro 16. O-kbp候選區(qū)域的Kinandang Patong 來源 8. 7-kbp KpnI-NotI 片段及其上下游區(qū)域插入到 pPZP2H_lac (Fuseet al. ,Plant Biotechnology 18:219-222，2001)中，并通過農(nóng)桿菌 EHAlOl 導(dǎo)入到 IR64 的愈傷組織中。具體地，IR64的轉(zhuǎn)化如下。(誘導(dǎo)用于農(nóng)桿菌感染的愈傷組織)將經(jīng)滅菌的IR64種子置于含有2，4_D的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在30_33° C在連續(xù)光照下培養(yǎng)I周。然后，切割愈傷組織并轉(zhuǎn)移到新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。將該程序重復(fù)三次以形成愈傷組織。所用的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是從NBPRCH40 (Hiei and KomariNature Protocols 3:824-834. 2008)修改而來，NBPRCH40 在 Hiei and Komari 中是用于預(yù)培養(yǎng)愈傷組織，用于在選擇出用不成熟胚法轉(zhuǎn)化的愈傷組織之后將植物轉(zhuǎn)化體再分化。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基具有如下的組成IOOmL IOx N6 主要鹽(major salts), IOmL IOOx Fe-EDTA, ImL 1，000xB5 微量鹽(minor salts) , ImL I, OOOx B5 維生素，30g/L 麥芽糖，0. 5g/L 酪蛋白氨基酸，0. 5g/L 脯氛酸,2mg/L 2, 4-D 和 5g/L Gelrite (pH 5. 8)。(農(nóng)桿菌感染)在感染之前，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。預(yù)培養(yǎng)3天后，將愈傷組織浸沒在農(nóng)桿菌懸浮液中。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到2N6-AS培養(yǎng)基中(Hiei and Komari, NatureProtocols 3:824-834. 2008)，并在 23。C 黑暗共培養(yǎng)。(除菌和被轉(zhuǎn)化愈傷組織的篩選)共培養(yǎng)之后除去農(nóng)桿菌。然后為了選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織置于含有藥物(25mg/L潮霉素和400mg/L羧芐青霉素)的愈傷組織(選擇)培養(yǎng)基中。30-33° C連續(xù)光照培養(yǎng)I周后，切割愈傷組織，并轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。這個(gè)程序重復(fù)3次，以選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(轉(zhuǎn)化體再分化)將在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再分化培養(yǎng)基中。在28° C連續(xù)光照下培養(yǎng)I周-10天后，將出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的再分化培養(yǎng)基中。這個(gè)程序重復(fù)2次，以選擇被轉(zhuǎn)化的植物。再分化培養(yǎng)基的組成如下100mL IOx N6主要鹽，IOmLIOOx Fe-EDTA, ImL I, OOOx B5 微量鹽，ImLl, OOOx B5 維生素，30g/L 麥芽糖，30g/L 山梨醇，2g/L酪蛋白氨基酸，O. 5g/L脯氨酸，O. 02mg/L NAA, 5g/L, 2mg/L細(xì)胞分裂素，和5g/LGelrite (pH 5. 8)。潮霉素和羧芐青霉素向制備培養(yǎng)基的添加濃度分別為25mg/L和300mg/L0(^JH^(Naturalization))將再分化轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到并在生根培養(yǎng)基中(MS培養(yǎng)基(4g/L Gelrite (pH5. 8)，補(bǔ) 充25mg/L潮霉素和200mg/L羧芐青霉素))28° C連續(xù)光照下培養(yǎng)。在確認(rèn)根生長(zhǎng)之后，對(duì)轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行馴化。對(duì)通過潮霉素篩選獲得的17個(gè)獨(dú)立愈傷組織來源的轉(zhuǎn)化體克隆，在第一代(TO)中通過改良提籃法測(cè)試其深根率。在導(dǎo)入了 Kinandang Patong來源8. 7-kbp片段的株系中，多數(shù)株系顯示高的深根率，而在對(duì)照載體中，深根率與IR64相同(圖I和2)。通過組合使用Southern分析和可檢出轉(zhuǎn)化載體中潮霉素抗性基因的序列的實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)確定導(dǎo)入到TO代每個(gè)植物內(nèi)的轉(zhuǎn)化載體的拷貝數(shù)。選擇攜帶單拷貝基因的植物，并產(chǎn)生Tl種子。對(duì)于四個(gè)來自具有單拷貝TO的株系的Tl植物，根據(jù)通過實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)獲得的信號(hào)強(qiáng)度推斷其缺失型(O拷貝)、雜合型(I個(gè)拷貝)和純合型(2個(gè)拷貝)，并評(píng)估與深根率的關(guān)聯(lián)性。在所有4個(gè)株系中，具有零信號(hào)強(qiáng)度的植物的深根率與對(duì)照載體相同(圖3)。同時(shí)，具有高強(qiáng)度的株系顯示高的深根率。例如，D27-C的兩個(gè)株系推斷為缺失型，因?yàn)樗鼈兊男盘?hào)強(qiáng)度為0，并且它們的深根率較低。同時(shí)，四個(gè)信號(hào)強(qiáng)度為大約10-20的株系顯示中等的深根率，因此推定是雜合型；所有四個(gè)信號(hào)強(qiáng)度為40-70的株系顯示高的深根率，因此判斷是純合型。如上所述，在具有單拷貝Drol的Tl株系中，發(fā)現(xiàn)深根率和被導(dǎo)入Drol基因的基因型分離之間存在正相關(guān)。3. 2評(píng)估Drol基因過表達(dá)植物的深根率推定基因的全長(zhǎng)cDNA (AK068870)已經(jīng)被登記在RAP-DB中。在FOX搜尋系統(tǒng)(全長(zhǎng)cDNA過表達(dá)基因搜尋系統(tǒng))上可以獲得Tl和T2代Nipponbare的各兩個(gè)株系。用于FOX株系的全長(zhǎng)cDNA序列(SEQ ID NO: 16)與從基因組核苷酸序列確定的cDNA序列(SEQID NO:2)相比，在5’和3’端各有一個(gè)Ι-bp添加。而且，該cDNA在自其核苷酸序列5’端起373bp處(自SEQ ID NO: 25'端起372bp)具有一個(gè)G代替A的核苷酸取代。該核苷酸取代造成SEQ ID NO:3中37位的賴氨酸被谷氨酸代替的非同義氨基酸取代。通過改良提籃法對(duì)來自4個(gè)株系中每一個(gè)的5株植物進(jìn)行評(píng)估，考察其深根率。結(jié)果顯示，在FOX株系中，深根率的范圍是8. 1-50. 0%，而10個(gè)野生型Nipponbare (對(duì)照)的比例為12. 2-23. 5%。因此，F(xiàn)OX株系的植物包括深根率顯著高于Nipponbare的植物(圖4)。結(jié)果證明，6. O-kbp候選區(qū)域中的預(yù)測(cè)基因是真實(shí)的Drol。同時(shí)，互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,Kinandang Patong型Drol是負(fù)責(zé)深根性的功能形式,而IR64型Drol喪失了功能或者其功能被破壞，導(dǎo)致淺根性。對(duì)兩個(gè)具有多拷貝Drol的株系(Tl)進(jìn)行評(píng)估，考察信號(hào)強(qiáng)度與深根率的關(guān)系。在D130-C中，發(fā)現(xiàn)在信號(hào)強(qiáng)度和深根率之間有正相關(guān)(圖3)。同時(shí)，關(guān)于D91-e，在4株信號(hào)強(qiáng)度與具有單拷貝基因的純合型相當(dāng)(10-350)的植物中觀察到信號(hào)強(qiáng)度與深根率正相關(guān)；然而6個(gè)具有高信號(hào)強(qiáng)度(500-2，000)的株系具有與載體對(duì)照相同的淺根。推定多拷貝的Drol的導(dǎo)入會(huì)在植物內(nèi)導(dǎo)致基因沉默。這提示，必須調(diào)節(jié)Drol基因的表達(dá)水平，例如通過在導(dǎo)入時(shí)選擇具有單拷貝基因的植物。[實(shí)施例4]水稻、高粱和玉米中Drol的氨基酸序列同源性使用Drol的氨基酸序列進(jìn)行查詢,在NCBI主頁(yè)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)通過blastn搜索與Drol同源的基因。該搜索鑒定了高度同源的基因；1個(gè)是高粱基因，另一個(gè)是玉米基因。在高粱和玉米中，與Drol具有最高同源性的ORF沒有基因名稱。因此，本發(fā)明人將該高粱和玉米基因分別命名為“SbDrolLl”和“ZmDrolLl”。高粱基因的氨基酸序列在NCBI主頁(yè)上可以獲得。同時(shí)，玉米基因的氨基酸序列可以通過基于在NCBI提取的mRNA序列進(jìn)行搜索從MaizeGDB (http: //www. maizegdb. org/)獲得。SbDrolLl CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。另一方面，ZmDrolLl CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示。SbDrolLl和ZmDrolLl對(duì)Drol分別顯示64%和62%的同源性(圖5)。[實(shí)施例5]Drol在大田條件下對(duì)深根性的影響本發(fā)明人評(píng)估了 Drol是否在大田條件下負(fù)責(zé)深根性。通過如下的方法開發(fā)用作大田試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料的近等基因系(Drol-NIL)。將IR64/Kinandang Patong F1與IR64回交4次，隨后進(jìn)行自交。從所得的BC4F2株系，選擇只就第9染色體上16. 6-19. 5-Mbp區(qū)域而言為純合的植物，并使用這些株系的自交種子作為近等基因系。將IR64、Kinandang Patong和Drol-NIL的種子種在旱田里，并在常用的旱稻施肥管理下生長(zhǎng)。植物在雨水灌溉條件下生長(zhǎng)105天。用鏟車將植物附近的土壤除去大約Im深。然后，通過噴水仔細(xì)洗去距離植物5cm左右的暴露表面，以便觀察最大根深度。結(jié)果顯不，IR64, Kinandang Patong和Drol-NIL在土壤中的根深度分別為大約20，80和40cm(圖6)。Drol-NIL的根長(zhǎng)與IR62相同。但是，Drol-NIL的根生長(zhǎng)深度大約是IR64的兩倍。因此，由于Drol的效果，根生長(zhǎng)角度增加，結(jié)果導(dǎo)致Drol-NIL的根延伸更深，直到與IR64的根長(zhǎng)相同的深度(大約40cm)。[實(shí)施例6]Dro I在用于測(cè)試抗旱的試驗(yàn)田中的抗旱效果本發(fā)明人測(cè)試了由于Drol導(dǎo)致的深根性是否可以提高抗旱性。使用IR64和Drol-NIL作為抗旱性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料。在本發(fā)明人研究所的塑料溫室中設(shè)置了與茨城農(nóng)業(yè)中心植物生物技術(shù)研究所(Plant Biotechnology Institute, Ibaraki AgriculturalCenter)所用相同的抗旱試驗(yàn)設(shè)施(Hirayama and Suga, Nougyo Kenkyu Senta KenkyuShiryo Dai 30 Gou, Ine Ikusyu Manyuaru(Agricultural Research Center ResearchData NO. 30;Rice plant breeding manual) 152-155. 1995)進(jìn)行抗旱試驗(yàn)。設(shè)施包括灌概區(qū)域和干旱脅迫區(qū)域。在灌溉區(qū)域中，在地面土壤上放置了用木框包圍的30cm額外的表土。在灌溉區(qū)域中，在播種和收獲期間對(duì)水稻間歇性澆水，以避免干旱脅迫。在栽培期間，通過置于土壤中25cm深處的張力計(jì)監(jiān)視土壤水勢(shì)，當(dāng)水勢(shì)低于大約-O. 015Mpa時(shí)便進(jìn)行灌溉(圖7)。一般地，植物在這個(gè)水平上不會(huì)受到干旱脅迫的影響。同時(shí)，在干旱脅迫區(qū)域中，在試驗(yàn)田床土(bed soil)上鋪設(shè)10_mm碌石(5cm厚)，在上面設(shè)置25cm額外的表層土，以阻斷來自土壤的毛細(xì)管水。在這樣的安排下，當(dāng)終止灌溉后額外表層土中的土壤水含量逐漸減少，植物將暴露于干旱脅迫。在干旱脅迫區(qū)域中，在播種第2個(gè)月后終止灌溉，并且在第一個(gè)穗出現(xiàn)之前不給植物澆水。在終止灌溉后的第10天，25cm深度的土壤水勢(shì)減少到-O. 07Mpa。結(jié)果，在干旱脅迫區(qū)域?qū)崿F(xiàn)了干旱脅迫條件(圖7)。另一方面，在40cm土壤深度，在整個(gè)干旱處理期間，水勢(shì)穩(wěn)定在大約-O. 03Mpa左右。因此，在這個(gè)深度并沒有實(shí)現(xiàn)干旱脅迫條件。在干旱脅迫區(qū)域，IR64在終止灌溉35天后觀察到卷葉，提示干旱脅迫效應(yīng)。對(duì)比地，在具有Kinandang Patong型Drol的IR64(Drol-NIL)中則沒有檢測(cè)到卷葉(圖8)。隨后，脅迫區(qū)域中IR64的卷葉程度增加，在第49天，植物生長(zhǎng)顯示被嚴(yán)重抑制。同時(shí)，在Drol-NIL中，卷葉的程度甚至在第49天仍然較低，與IR64相比，植物生長(zhǎng)旺盛。在干旱脅迫區(qū)域中終止灌溉35天后，DioI-NIL的平均葉片溫度比IR64低O. 7° C(圖9)。Drol-NIL的葉片溫度在每個(gè)測(cè)量日均顯示比IR64更低。而且，還在第34和41天對(duì)IR64和Drol-NIL測(cè)量了 2次氣孔導(dǎo)度和光合速率。結(jié)果顯示，Drol-NIL的這兩個(gè)數(shù)值均顯著大于IR64(圖9)。在干旱脅迫區(qū)域出現(xiàn)第一個(gè)穗之后，再次給植物澆水以便水稻谷粒成熟。每個(gè)植物單獨(dú)收獲，對(duì)其草桿長(zhǎng)度、穗長(zhǎng)度、穗數(shù)、穗重、實(shí)粒數(shù)目和地上部分的干物質(zhì)重量進(jìn)行評(píng)估。IR64和Drol-NIL之間在莖桿和穗長(zhǎng)上沒有觀察到顯著差異。同時(shí)，地上部分的干重、穗數(shù)、穗重和實(shí)粒的數(shù)目在IR64和Drol-NIL之間有顯著差異(圖10)。特別地，Drol-NIL中實(shí)粒的數(shù)目比IR64高大約3. 8倍。為了確認(rèn)Drol-NIL的深根性是否是這 一結(jié)果的原因，對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行了解剖，以觀察根是否穿透了礫石層。結(jié)果顯示，DioI-NIL的根穿透了礫石層而進(jìn)入到了更深的土壤層，而IR64的根則不能穿透礫石層(圖11)。上述發(fā)現(xiàn)證明，水稻通過由Drol賦予的深根性獲得了抗旱性，使光合能力和產(chǎn)量增加。同時(shí)，用通過檢測(cè)從對(duì)象發(fā)射的紅外能并將其轉(zhuǎn)變成表觀溫度從而顯示溫度分布圖像的設(shè)備(紅外熱成像儀)測(cè)量葉片溫度。具體地，通過在一定距離之外的紅外熱成像測(cè)量水稻在干旱脅迫條件下的葉表面溫度。然后，將圖像輸出到專用軟件，以確定圖像上植物的平均葉片溫度。光合速率的評(píng)估是通過將葉片置于通以含恒定濃度二氧化碳的空氣的小室中，并測(cè)量室內(nèi)輸出空氣中二氧化碳的降低。同時(shí)，通過測(cè)量從含有葉片的小室輸出的空氣中水蒸汽含量的增加評(píng)估氣孔導(dǎo)度。具體地，數(shù)值的確定如下。將來自干旱脅迫條件下水稻的葉片在光合蒸騰作用測(cè)量系統(tǒng)的小室內(nèi)完全展開夾持一定的時(shí)間。將同一展開葉片測(cè)量三次，以確定平均值。[實(shí)施例7]DroI在嚴(yán)重干旱的旱田中的抗旱效果在實(shí)施例6中，Drol被證明可以在測(cè)試抗旱性的試驗(yàn)田中導(dǎo)致抗旱性。接下來，本發(fā)明人評(píng)估Drol是否能夠在自然環(huán)境的農(nóng)田中在更嚴(yán)重的干旱脅迫下導(dǎo)致抗旱性。使用IR64和Drol-NIL在施肥(N:P:K=12:12:9kg/10a)和不施肥的三塊重復(fù)旱田區(qū)域內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)區(qū)域(3m X 3m)中，種植200株植物，行距30cm，株距15cm。200株植物由100株IR64和100株Drol-NIL組成。植物在培養(yǎng)期間不澆水。這樣，因?yàn)樵诓シN后I個(gè)月_90天沒有降雨，干旱脅迫條件較為嚴(yán)重，并且在40cm土壤深度處平均土壤水勢(shì)為-O. OSMpa以下(圖12)。在這種干旱脅迫條件下，Drol-NIL幾乎檢測(cè)不到卷葉，而IR64在兩個(gè)區(qū)域中均觀察到嚴(yán)重的卷葉(圖13)。特別地，在沒有施肥的區(qū)域中，DioI-NIL中幾乎檢測(cè)不到卷葉，而IR64顯示出卷葉，并且與Drol-NIL相比，抽穗日期顯著延遲。在收獲季節(jié)通過四分區(qū)法對(duì)產(chǎn)量進(jìn)行估計(jì)。在所研究的5個(gè)參數(shù)中，Drol-NIL在4個(gè)參數(shù)上顯著大于IR64，即穗數(shù)、地上部分干重、總粒重量和實(shí)粒重量(表I)。94.
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1_I I_I I_I而在施肥的區(qū)域中增加到7. 8倍。這個(gè)發(fā)現(xiàn)證明，Drol在農(nóng)田的自然栽培環(huán)境中，即使在干旱條件下也會(huì)導(dǎo)致抗旱。[實(shí)施例8]用于檢查Drol基因中單核苷酸缺失的存在的標(biāo)記因?yàn)镮R64的Drol基因序列在其外顯子4中具有一個(gè)堿基的缺失，所以設(shè)計(jì)了 PCR標(biāo)記用于檢測(cè)該缺失的存在。設(shè)計(jì)了兩種類型的標(biāo)記SNP02-KP(引物5’-GTCTAGATCACGCAGTGAAT-3’ (SEQ ID NO:8)和 5’-TCGCATGATGATGACCAAGT-3’ (SEQ ID NO:9)),其只有在Kinandang Patong 型 DNA 存在下才被擴(kuò)增，和 SNP02-IR64 (引物5’ -ATCGTCTAGATCACGCAGTGAAC-3’ (SEQ ID NO: 10)和 5’-AGGGTGGCTTTACCTCCGTA-3’ (SEQ ID NO: 11))，其只有在IR64型DNA存在下才被擴(kuò)增。PCR 混合物每個(gè)反應(yīng)(15yL)中含有 0·2μΜ 引物，0.6U Tag, O. 2mMdNTPs, 2mMMgCl2,和 20ng DNA。PCR 反應(yīng)條件如下(1)95。C 2 分鐘;(2)94° C 30 秒;(3)退火 30 秒，退火溫度范圍是51. 8-62. 2° C 30秒；(4)72° C I分鐘；和(5)72° C 7分鐘；對(duì)于SNP02-KP,反應(yīng)(2)-(4)共25個(gè)循環(huán)；對(duì)于SNP02-IR64，反應(yīng)(2)-(4)共30個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果顯示，SNP02-KP只有當(dāng)使用Kinandang Patong DNA時(shí)才能被擴(kuò)增，而SNP02-IR64只有在使用IR64DNA時(shí)才能被擴(kuò)增(圖9)。工業(yè)實(shí)用件本發(fā)明提供了 Drol基因，其控制植物如水稻的深根，以及用該基因轉(zhuǎn)化的植物。通過操縱Drol基因?qū)\根性植物變成深根性植物預(yù)期可以產(chǎn)生具有更高避旱能力的植物。作為另一選擇，通過操縱Drol基因使得深根植物變成淺根植物可以賦予植物耐濕性。干旱導(dǎo)致世界糧食產(chǎn)量嚴(yán)重減少。同時(shí)，在日本，因?yàn)榈咎锏呐潘Я^差，濕損害對(duì)于沒有耐濕性的大豆和玉米也是問題。本發(fā)明可用于解決這些國(guó)內(nèi)和國(guó)際問題。
權(quán)利要求
1.下面(a)-(e)中任一項(xiàng)的DNA: (a)包含SEQID NO: I的核苷酸序列的DNA ； (b)包含SEQID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA ； (c)編碼包含SEQID NO:3，13和15中的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA ； (d)在嚴(yán)格條件下與包含SEQID NO: I, 2，12，14，16和17中的任一核苷酸序列的DNA雜交，并且具有賦予植物深根性表型的活性的DNA ;或者 (e)編碼包含與SEQID NO:3, 13和15中的任一氨基酸序列相比有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、刪除、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且具有賦予植物深根性表型的活性的 DNA。
2.權(quán)利要求I的DNA，其中所述植物是單子葉植物。
3.權(quán)利要求2的DNA，其中所述單子葉植物是禾本科植物。
4.權(quán)利要求3的DNA，其中所述禾本科植物選自下組稻、麥類(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗、貓尾草、草地早熟禾、鴨茅、意大利黑麥草、多年生黑麥草、葦狀羊茅和百喜草。
5.權(quán)利要求3的DNA，其中所述禾本科植物選自下組水稻、高粱和玉米。
6.—種載體,包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA。
7.一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其以可表達(dá)的方式包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA。
8.一種用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA轉(zhuǎn)化的植物，其具有深根性表型。
9.一種通過將權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA或權(quán)利要求6的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，其具有深根性表型。
10.一種轉(zhuǎn)化植物，其是通過如下的步驟(a)-(d)獲得的 (a)將權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA或權(quán)利要求6的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中； (b)確定步驟(a)中的植物細(xì)胞內(nèi)的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA的拷貝數(shù)； (c)選擇含有單拷貝的被導(dǎo)入的DNA或載體的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和 (d)從步驟(c)中選擇的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物， 并且其具有深根性表型。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物是單子葉植物。
12.權(quán)利要求11的植物，其中所述單子葉植物是禾本科植物。
13.權(quán)利要求12的植物，其中所述禾本科植物選自下組水稻、麥類(小麥、大麥、黑麥、燕麥和薏苡(薏米))、玉米、黍、粟、稗、高粱、龍山稷、珍珠粟、埃塞俄比亞畫眉草、甘蔗、貓尾草、草地早熟禾、鴨茅、意大利黑麥草、多年生黑麥草、葦狀羊茅和百喜草。
14.權(quán)利要求12的植物，其中所述禾本科植物選自下組水稻、高粱和玉米。
15.一種轉(zhuǎn)化植物，其是權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的后代或克隆。
16.從權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物分離的細(xì)胞。
17.權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的繁殖材料。
18.從權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物分離的器官。
19.從權(quán)利要求16的細(xì)胞、權(quán)利要求17的繁殖材料和權(quán)利要求18的器官中的至少一個(gè)制備的加工食品。
20.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求8和11-13中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括下述步驟將權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA或權(quán)利要求6的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，以及從該植物細(xì)胞再生植物。
21.權(quán)利要求20的方法，其進(jìn)一步包括選擇具有單拷貝的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)化植物的步驟。
22.一種用于評(píng)估植物是否具有深根性表型的方法，其中當(dāng)分子量或核苷酸序列相同時(shí)則判定測(cè)試植物具有深根性表型，該方法包括下面的步驟(a)-(c) (a)從測(cè)試植物制備DNA樣品； (b)從該DNA樣品擴(kuò)增包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA的區(qū)域；和 (c)將擴(kuò)增的DNA片段的分子量或核苷酸序列與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA進(jìn)行比較。
23.一種用于評(píng)估植物是否具有深根性表型的方法，其中當(dāng)獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)則判定測(cè)試植物具有深根性表型，該方法包括使用包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列的引物并使用從該測(cè)試植物制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR的步驟。
24.一種用于評(píng)估植物是否具有深根性表型的方法，其中當(dāng)獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)則判斷測(cè)試植物不具有深根性表型，該方法包括使用包含SEQ ID NO: 10的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的引物并使用從該測(cè)試植物制備的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR的步驟。
25.一種用于選擇具有深根性表型的植物的方法，其包括如下的步驟(a)和(b) (a)通過將任意植物與具有深根性表型的植物進(jìn)行雜交產(chǎn)生栽培種；和 (b)通過權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)的方法評(píng)估步驟(a)中獲得的植物是否具有深根性表型。
26.一種蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA編碼。
27.一種抗體，其結(jié)合權(quán)利要求26的蛋白質(zhì)。
28.—種DNA，其包含至少15個(gè)與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸。
29.—種DNA，其包含SEQ ID NO:4-11中任一項(xiàng)的核苷酸序列。
全文摘要
為了提供可控制植物深根性的基因、導(dǎo)入了該基因的轉(zhuǎn)基因植物和使用該基因用于控制植物深根性的方法等，對(duì)能夠控制植物深根性的遺傳座位(Dro1座位)嘗試了高分辨率連鎖分析，該座位是在大規(guī)模分離群體中在淺根稻栽培種IR64和深根稻栽培種Kinandang Patong之間發(fā)現(xiàn)的。結(jié)果顯示，Dro1的基因區(qū)域位于夾在InDel標(biāo)記Dro1-INDEL09和CAPS標(biāo)記Dro1-CAPS05之間的6.0kbp的區(qū)域內(nèi)。而且已經(jīng)證實(shí)，用Kinandang Patong型Dro1基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物具有顯著升高的深根率。還證實(shí)，具有Kinandang Patong型Dro1基因的植物具有抗旱性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102918154SQ201080064708
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者宇賀優(yōu)作 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所