專利名稱：使用移植了nog確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型進(jìn)行的抗癌藥靶探索以及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌病態(tài)非人動(dòng)物模型，其特征在于可以再現(xiàn)以人類癌癥組織的癌癥干細(xì)胞為頂點(diǎn)的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程，探討其生物學(xué)特性。本發(fā)明還涉及抗癌藥的篩選方法或受檢物質(zhì)的藥理效果的評(píng)價(jià)方法，該方法是使用該非人動(dòng)物模型或?qū)?yán)重免疫缺陷動(dòng)物一N0D/SCID/ Y (C)(裸)(NOG)小鼠移植人腫瘤組織并確立的NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系。
背景技術(shù)：
人的腫瘤細(xì)胞中可見各種組織構(gòu)建，已知其呈以癌癥干細(xì)胞為頂點(diǎn)的等級(jí)結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)I)。例如對(duì)于結(jié)腸癌，已知可大致分為形成腺腔結(jié)構(gòu)的區(qū)域和浸潤(rùn)區(qū)域這兩個(gè)等級(jí)，該腺腔結(jié)構(gòu)由分化為結(jié)腸上皮樣的細(xì)胞形成；浸潤(rùn)區(qū)域顯示分化為間充質(zhì)系細(xì)胞 的傾向(非專利文獻(xiàn)2、3)。上述認(rèn)識(shí)是由膨大的人結(jié)腸癌癥組織形態(tài)學(xué)觀察的積累獲得的，但是可再現(xiàn)該癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)的模型動(dòng)物很稀少，因此，該結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程、以及癌癥干細(xì)胞在其中的參與情況尚不明確。另一方面，在對(duì)嚴(yán)重免疫缺陷動(dòng)物一N0D/SCID/ Y (C)(裸)(NOG)小鼠移植人腫瘤組織并確立的NOG確立癌細(xì)胞株中，近年來(lái)正顯示出顯示與人類癌癥組織類似的組織構(gòu)建(非專利文獻(xiàn)4)。但是目前為止，用于在體內(nèi)系統(tǒng)中形態(tài)學(xué)觀察癌細(xì)胞株的等級(jí)結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程、或者了解其形成過(guò)程中癌癥干細(xì)胞的參與的有用的模型動(dòng)物尚不存在。已知在用于治療或預(yù)防癌癥疾病的藥物的開發(fā)或評(píng)價(jià)中，使用反映人的癌癥疾病的癌癥病態(tài)動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行抗癌藥的篩選或評(píng)價(jià)受檢物質(zhì)的藥理效果，這可獲得與人臨床數(shù)據(jù)接近的結(jié)果。由以上可知，人們需求保有與人的癌癥疾病更為類似的病態(tài)的非人動(dòng)物模型。人們還需求在體外系統(tǒng)中呈現(xiàn)與人的癌癥疾病病態(tài)更為類似的細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)體系?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) I =Dalerba P.等人·，Annu Rev Med. 2007; 58: 267-284 非專利文獻(xiàn) 2 :Brabletz T.等人·，Nat Rev Cancer. 2005; 5: 744-749 非專利文獻(xiàn) 3 :Kirchner T.等人·，Am J Pathol. 2000; 157: 1113-1121 非專利文獻(xiàn) 4:Fujii E.等人·，Pathol Int. 2008; 58: 559-567。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供癌癥病態(tài)非人動(dòng)物模型，其特征在于可再現(xiàn)人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程及其生物學(xué)特性。本發(fā)明的課題還在于提供抗癌藥靶的探索方法，該方法是使用該非人動(dòng)物模型或?qū)?yán)重免疫缺陷動(dòng)物一N0D/SCID/Y (c)(裸)(NOG)小鼠移植人腫瘤組織并確立的NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系。本發(fā)明的課題還在于提供對(duì)癌癥疾病的預(yù)防或治療有效的抗癌藥的篩選方法，該篩選方法是使用該非人動(dòng)物模型或?qū)υ揘OG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系。本發(fā)明的課題進(jìn)一步在于提供受檢物質(zhì)對(duì)人的癌癥疾病的預(yù)防效果或治療效果的評(píng)價(jià)方法，該方法是使用該非人動(dòng)物模型或該NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系。本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入的研究。本發(fā)明人認(rèn)為，在將對(duì)嚴(yán)重免疫缺陷動(dòng)物NOG小鼠移植人腫瘤組織并確立的NOG確立癌細(xì)胞株移植到NOG小鼠之后，形態(tài)學(xué)觀察其組織構(gòu)建，這可以對(duì)其等級(jí)結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程、和癌癥干細(xì)胞在其中的參與、或者其生物學(xué)特性進(jìn)行了解，因此進(jìn)行了以下的研究。首先，在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的NOG確立癌細(xì)胞株移植到該小鼠后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，在人類癌癥組織中觀察到呈現(xiàn)上皮樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域、和由部分顯示間充質(zhì)系性質(zhì)的細(xì)胞形成的浸潤(rùn)區(qū)域(

圖1-4)。該等級(jí)結(jié)構(gòu)與作為移植源的人類癌癥組織酷似，在形成其等級(jí)結(jié)構(gòu)的癌癥進(jìn)展過(guò)程中可見隨時(shí)間的變動(dòng)。并且，如果隨時(shí)間觀察由組織形態(tài)不同的移植源腫瘤確立的細(xì)胞株，則顯示各細(xì)胞株經(jīng)由特有的變動(dòng)的進(jìn)展過(guò)程，呈現(xiàn)與移植源腫瘤類似的組織圖像(表I)，其可重復(fù)再現(xiàn)(圖5);并且在該過(guò)程中，癌癥干細(xì)胞的樣態(tài)隨時(shí)間變遷(推移)(圖6、7)。雖然在人結(jié)腸癌中部分地預(yù)測(cè)了該變遷的癌癥干細(xì)胞的存在，但是，現(xiàn)在通過(guò)使用NOG小鼠以及該確立癌細(xì)胞株，首次明確了其經(jīng)驗(yàn)性存在、以及其在腫瘤組織所構(gòu)建的等級(jí)中的參與(圖8)。如上所述，從各細(xì)胞株重復(fù)地經(jīng)過(guò)了特有的變化的進(jìn)展過(guò)程可知，其中所含的癌癥干細(xì)胞具有特有的最終分化終點(diǎn)這樣的生物學(xué)特性的一部分(圖5、表I)。并且，如果跨兩代進(jìn)行癌癥干細(xì)胞變遷的追蹤，則可以明確在第I代中失去癌癥干細(xì)胞性并分化的細(xì)胞在第2代中重新獲得干細(xì)胞性，S卩，顯示所謂的干細(xì)胞的可塑性這樣的生物學(xué)特性(圖9)。近年來(lái)已經(jīng)明確了干細(xì)胞獲得分化多能的所謂的重編程現(xiàn)象與P53等蛋白質(zhì)表達(dá)的減少有關(guān)。因此，在對(duì)P53蛋白進(jìn)行免疫染色時(shí)也顯示，在同一模型中發(fā)現(xiàn)的癌癥干細(xì)胞中，該P(yáng)53蛋白表達(dá)減少(圖10)。由以上可以明確，在該模型中，癌癥干細(xì)胞的重編程的生物學(xué)特性得以忠實(shí)再現(xiàn)。同樣，近年來(lái)有人指出存在于腫瘤間充質(zhì)的成纖維細(xì)胞可能在腫瘤生長(zhǎng)·進(jìn)展方面發(fā)揮較大作用，推定在一部分腫瘤中，該成纖維細(xì)胞可能通過(guò)完全上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(完全EMT)，由腫瘤本身產(chǎn)生(Radisky DC,等人，JCell Biochem. 2007; 101: 830-9)。本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)NOG確立癌細(xì)胞株移植到小鼠后的隨時(shí)間觀察，發(fā)現(xiàn)了不是宿主(小鼠)的成纖維細(xì)胞、而是來(lái)自于移植的人組織的成纖維細(xì)胞，因此表明在同一模型中再現(xiàn)了包含腫瘤間充質(zhì)形成的等級(jí)結(jié)構(gòu)的形成(圖11、12)。并且，通過(guò)使用本發(fā)明的NOG確立癌細(xì)胞株，成功地構(gòu)建了抗癌藥抗性模型細(xì)胞(圖13)。以上顯示通過(guò)將上述NOG確立癌細(xì)胞株移植到該小鼠中并隨時(shí)間觀察，可以制備體內(nèi)動(dòng)物模型，該體內(nèi)動(dòng)物模型的特征在于(I)可以制備重復(fù)再現(xiàn)移植源人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)的模型動(dòng)物；(2)發(fā)現(xiàn)具備形成各等級(jí)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)的特有的癌癥干細(xì)胞，在其上再現(xiàn)癌癥干細(xì)胞的生物學(xué)特性；(3)在該等級(jí)結(jié)構(gòu)的再現(xiàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過(guò)完全EMT轉(zhuǎn)化為形成腫瘤間充質(zhì)的成纖維細(xì)胞的過(guò)程。這些特征在NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中也可以再現(xiàn)。
接著，由于可以制備具有上述特征的新的模型動(dòng)物，因此，對(duì)于該模型作為新的抗癌藥靶的探索、及其新的篩選方法的應(yīng)用進(jìn)行了研究。新的抗癌藥靶的探索方法可以如下進(jìn)行通過(guò)激光顯微切割法(LMD)采集具有在同一細(xì)胞株的各區(qū)域的進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)的組織塊，研究其mRNA表達(dá)，由此來(lái)研究依賴于過(guò)程、組織結(jié)構(gòu)或其生物學(xué)特性而變化的基因。上述發(fā)現(xiàn)的基因或其所編碼的蛋白有助于該癌癥進(jìn)展過(guò)程，因此，可認(rèn)為該抑制物質(zhì)可成為抑制該癌癥進(jìn)展過(guò)程的新的抗癌藥靶分子。另一方面，關(guān)于新的藥物評(píng)價(jià)篩選方法，可以考慮著眼于觀察該模型的隨時(shí)間變化而看到的癌癥進(jìn)展過(guò)程，將現(xiàn)有抗癌藥(例如氟尿嘧啶、伊立替康等)給予該模型顯示抑制特定的癌癥進(jìn)展過(guò)程、或者對(duì)癌癥干細(xì)胞進(jìn)行特有的生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)的事件的方法。將該例子應(yīng)用于新的抗癌藥篩選，則可以了解特定抗癌藥發(fā)揮作用的癌癥進(jìn)展過(guò)程、或特定的生物學(xué)特性，因此可認(rèn)為可以進(jìn)行臨床預(yù)測(cè)性更高的篩選。
S卩，本發(fā)明人成功地制備了保有與人的癌癥疾病更為類似的病態(tài)的非人動(dòng)物模型或顯示與人類癌癥疾病更為類似的細(xì)胞形態(tài)的、體外條件下的NOG確立癌細(xì)胞株培養(yǎng)體系，由此完成了本發(fā)明。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供以下的[1]_[18]。[I]非人動(dòng)物模型，該非人動(dòng)物模型通過(guò)將把人腫瘤組織移植到嚴(yán)重免疫缺陷N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠中確立的NOG確立癌細(xì)胞株移植到屬于相同或不同種的非人動(dòng)物中而得到。[2] [I]的非人動(dòng)物模型，其特征在于該非人動(dòng)物模型再現(xiàn)人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)和癌癥進(jìn)展過(guò)程。[3] [I]的非人動(dòng)物模型，其特征在于該非人動(dòng)物模型可以發(fā)現(xiàn)具備再現(xiàn)人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)和癌癥進(jìn)展過(guò)程的性質(zhì)的特有的癌癥干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性。[4] [I]的非人動(dòng)物模型，其特征在于該非人動(dòng)物模型可在人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)的再現(xiàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過(guò)完全上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(完全EMT)轉(zhuǎn)化為形成腫瘤間充質(zhì)的成纖維細(xì)胞的過(guò)程。[5]非人動(dòng)物模型，該非人動(dòng)物模型可通過(guò)對(duì)[1]_[4]中任一項(xiàng)的非人動(dòng)物模型給予抗癌藥，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、其癌癥進(jìn)展過(guò)程、其生物學(xué)特性、或其顯示的完全上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(完全EMT)的變化作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，來(lái)研究抗癌藥抗性的成因。[6] [1]-[4]中任一項(xiàng)的非人動(dòng)物模型，其特征在于上述人腫瘤組織是來(lái)自結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌的腫瘤組織。[7]抗癌藥靶的探索方法，其特征在于在移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。[8] [7]的抗癌藥靶的探索方法，其特征在于該方法包含下述(1)-(4)的步驟
(1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(3)對(duì)于(2)中采集的組織塊研究DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的步驟；以及(4)對(duì)依賴于組織塊中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性變化的基因·蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。[9] [7]的抗癌藥靶的探索方法，其特征在于該方法包含下述(1)-(3)的步驟
(1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)對(duì)再現(xiàn)了特征結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)細(xì)胞的DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行研究的步驟；以及
(3)對(duì)依賴于培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性變化的基因·蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。[10]抗癌藥的篩選方法，其特征在于在移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 [11] [10]的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(5)的步驟
(1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟；
(3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(5)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程及其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。[12] [10]的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(4)的步驟
(1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟；
(3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(4)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。[13] [10]的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(5)的步驟
(1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟；
(3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(5)對(duì)抑制特定的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的受檢物質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。[14] [10]的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(4)的步驟
(1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟；
(3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(4)對(duì)抑制特定的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的受檢物質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。
[15]用于治療或預(yù)防人類癌癥疾病的藥物的評(píng)價(jià)方法，其特征在于在移植了NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。[16] [15]的藥物的評(píng)價(jià)方法，其特征在于該評(píng)價(jià)方法包含下述(1)-(5)的步驟
(1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟；
(3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(5)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。[17] [15]的用于治療或預(yù)防人類癌癥疾病的藥物的評(píng)價(jià)方法，其特征在于該評(píng)價(jià)方法包含下述(1)-(4)的步驟
(1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟；
(3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(4)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。[18]使用移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物或NOG確立癌細(xì)胞株作為再現(xiàn)癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的癌癥模型動(dòng)物或細(xì)胞株的方法。根據(jù)本發(fā)明，提供保有與人類癌癥疾病更為類似的病態(tài)的非人動(dòng)物模型、以及在體外體系中呈現(xiàn)與人的癌癥疾病病態(tài)更為類似的細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)體系。通過(guò)使用可更良好地反映人的癌癥疾病的癌癥病態(tài)動(dòng)物模型或癌細(xì)胞培養(yǎng)體系，進(jìn)行抗癌藥的篩選或評(píng)價(jià)受檢物質(zhì)的藥理效果，有望獲得與人臨床數(shù)據(jù)接近的結(jié)果。附圖簡(jiǎn)述圖I是表示上皮樣生長(zhǎng)區(qū)域的照片。可見腺腔結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞全周表達(dá)鈣粘著蛋白E (E-cadherin)。圖2是表示在體外培養(yǎng)條件下的上皮樣生長(zhǎng)的照片。左側(cè)照片立體懸浮培養(yǎng)。右側(cè)照片在基質(zhì)膠(Matrigel)中的立體培養(yǎng)。基質(zhì)膠中的立體培養(yǎng)可見上皮樣腺腔結(jié)構(gòu)的形成。圖3是表示浸潤(rùn)區(qū)域的照片。在各浸潤(rùn)區(qū)域的與腫瘤間充質(zhì)的接觸面，鈣粘著蛋白E的表達(dá)消失。圖4是表示其它癌癥種類的上皮性區(qū)域和浸潤(rùn)區(qū)域的照片?？梢娂?xì)胞全周被鈣粘 著蛋白E包圍的上皮樣區(qū)域(*)，和鈣粘著蛋白E部分消失、可見對(duì)纖連蛋白顯示陽(yáng)性的細(xì)胞的浸潤(rùn)區(qū)域(用箭頭表示的部分)。圖5是表示移植源癌癥組織與NOG確立癌細(xì)胞株(繼代3代以上確立)的組織構(gòu)建的再現(xiàn)性的照片。如照片所示，NOG確立癌細(xì)胞株重復(fù)地再現(xiàn)與移植源癌組織類似的組織結(jié)構(gòu)。圖6是表示上皮樣生長(zhǎng)部的癌癥干細(xì)胞的照片。在上皮樣生長(zhǎng)區(qū)域，在上皮細(xì)胞間可見未被BrdU連續(xù)標(biāo)記標(biāo)記的低生長(zhǎng)細(xì)胞(慢周期細(xì)胞黑三角)，存在于該BrdU陰性細(xì)胞區(qū)域的細(xì)胞呈現(xiàn)癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物(Lgr5)陽(yáng)性。圖7是表示浸潤(rùn)生長(zhǎng)部的癌癥干細(xì)胞的照片。在浸潤(rùn)生長(zhǎng)區(qū)域，在未被BrdU連續(xù)標(biāo)記標(biāo)記的上皮腺腔結(jié)構(gòu)部可見低生長(zhǎng)細(xì)胞(黑三角)。同時(shí)，在浸潤(rùn)區(qū)域也可見低生長(zhǎng)細(xì)胞(黑箭頭)。在顯示被認(rèn)為是該細(xì)胞的浸潤(rùn)過(guò)程的聚簇的細(xì)胞中也觀察到低生長(zhǎng)細(xì)胞(黑箭頭)，以上的細(xì)胞顯示為癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物(Lgr5)陽(yáng)性細(xì)胞(空心箭頭)。圖8是表示癌癥干細(xì)胞與腫瘤等級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系的圖。圖9是由使用IdU和BrdU的2代連續(xù)標(biāo)記移植試驗(yàn)得到的標(biāo)本。除了跨2代停止生長(zhǎng)的細(xì)胞(空心箭頭)、在第I代為低生長(zhǎng)但在第2代停止生長(zhǎng)的細(xì)胞(空心三角)之夕卜，還觀察到在第I代進(jìn)行了分化生長(zhǎng)、但在第2代停止生長(zhǎng)而干細(xì)胞化的細(xì)胞(箭頭)。圖10是使用P53以及BrdU抗體的免疫染色標(biāo)本?？梢奝53和BrdU弱陽(yáng)性或陰性細(xì)胞(空心箭頭)。圖11是表示來(lái)自人的成纖維細(xì)胞的照片。圖12是表示來(lái)自人的成纖維細(xì)胞體外生長(zhǎng)的照片和圖。在懸浮條件下培養(yǎng)，則只可見上皮樣細(xì)胞(黑三角)，未見成纖維細(xì)胞，如果將該細(xì)胞貼壁，則成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)(黑色箭頭)。另外，通過(guò)人HMC抗體可以確認(rèn)該細(xì)胞的90%左右是來(lái)自人的細(xì)胞。圖13是表示對(duì)移植了 NOG確立結(jié)腸癌細(xì)胞株的NOG小鼠給予抗癌藥(5_氟尿嘧啶)之后可見的抗癌藥抗性的癌細(xì)胞病理組織的照片?？梢姷头只俟?黑色箭頭)的增加以及出芽圖像(虛線部)減少。實(shí)施發(fā)明的方案
本發(fā)明涉及可有效用于人類癌癥疾病的治療或預(yù)防的藥物開發(fā)的癌癥疾病病態(tài)非人動(dòng)物模型，以及在體外系統(tǒng)中呈現(xiàn)與癌癥疾病病態(tài)更為類似的細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)體系。具體來(lái)說(shuō)，涉及將對(duì)嚴(yán)重免疫缺陷NOD/SCID/γ (c)(裸)(NOG)小鼠移植人類癌癥組織并確立的NOG確立癌細(xì)胞株移植到相同或不同種的非人動(dòng)物中，由此獲得的非人動(dòng)物模型以及NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系。
本發(fā)明的非人動(dòng)物模型可以再現(xiàn)人類癌癥疾病的病態(tài)中特有地觀察到的癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、及其生物學(xué)特性。本發(fā)明中，對(duì)象癌癥疾病的種類沒(méi)有特別限定，但是可優(yōu)選例舉結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌或胰腺癌。本發(fā)明中，“在人類癌癥疾病的病態(tài)中特有地觀察到的癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)”可舉出形成腺腔結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)和浸潤(rùn)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中，所述腺腔結(jié)構(gòu)由分化為上皮樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞形成，浸潤(rùn)區(qū)域顯示分化為間充質(zhì)系細(xì)胞的傾向。在上述上皮樣腺腔區(qū)域，在細(xì)胞全周表達(dá)鈣粘著蛋白E，鈣粘著蛋白E的表達(dá)可以使用抗鈣粘著蛋白E抗體來(lái)確認(rèn)。在上述浸潤(rùn)區(qū)域中，顯示出芽、腫瘤細(xì)胞的聚簇、解離的單個(gè)的腫瘤細(xì)胞以及小管重建這樣的特征形態(tài)圖像。位于這些浸潤(rùn)區(qū)域的細(xì)胞發(fā)生部分喪失上皮性的部分-EMT，在與間充質(zhì)系細(xì)胞的接觸面，鈣粘著蛋白E的表達(dá)消失，通常有在上皮樣 細(xì)胞中未見表達(dá)的纖連蛋白表達(dá)。在上述上皮樣腺腔區(qū)域和上述浸潤(rùn)區(qū)域，可以發(fā)現(xiàn)為低生長(zhǎng)細(xì)胞的癌癥干細(xì)胞。對(duì)于在這些區(qū)域是否存在癌癥干細(xì)胞，可使用細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)志物(例如BrdU連續(xù)標(biāo)記和Ki67染色)或癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物(例如Lgr5染色)等確認(rèn)。并且，可以將再現(xiàn)上述癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性，以及可確認(rèn)癌癥干細(xì)胞的存在組合，在不同時(shí)間對(duì)該兩者同時(shí)進(jìn)行觀察。由此可以了解等級(jí)結(jié)構(gòu)和癌癥進(jìn)展過(guò)程是如何以癌癥干細(xì)胞為起點(diǎn)，構(gòu)建癌癥組織特有的組織的。更具體地說(shuō)，在移植初期的高應(yīng)激的環(huán)境下，主要是癌癥干細(xì)胞及其祖細(xì)胞存活。轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)期，則由上述上皮樣腺腔區(qū)域出現(xiàn)形成腺腔的癌細(xì)胞，另一方面仍保有總是具備低生長(zhǎng)性的癌癥干細(xì)胞及其祖細(xì)胞，其擔(dān)負(fù)著上皮樣腺腔區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大的作用。另一方面，在上述浸潤(rùn)區(qū)域中，由耐受了移植初期的高應(yīng)激環(huán)境的細(xì)胞出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的聚簇、解離的單個(gè)的腫瘤細(xì)胞這樣的部分EMT細(xì)胞。為了引發(fā)部分EMT，這些低生長(zhǎng)的癌癥干細(xì)胞是遷移性的，因此擔(dān)負(fù)著癌癥的浸潤(rùn) 傳播等性質(zhì)，同時(shí)擴(kuò)大其區(qū)域。并且若一部分的部分EMT細(xì)胞到達(dá)一定的環(huán)境中，那么發(fā)生所謂的間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)。由此，一度喪失上皮性的部分EMT細(xì)胞再次獲得上皮細(xì)胞的性質(zhì)，由其形成新的上皮樣腺腔結(jié)構(gòu)。 本發(fā)明中，“在人類癌癥疾病的病態(tài)中特有地觀察到的癌癥進(jìn)展過(guò)程”可以是對(duì)每種癌細(xì)胞的分化能力例舉的以下的過(guò)程。為高分化癌時(shí)，是以上皮樣生長(zhǎng)過(guò)程(上皮管形成模式Epithelialduct-forming pattern))為主體的過(guò)程。為中分化癌時(shí)，是含有上皮樣生長(zhǎng)過(guò)程(上皮管形成模式(epithelial duct-forming pattern))、同時(shí)以浸潤(rùn)生長(zhǎng)過(guò)程(浸潤(rùn)EMT模式(invasive EMT pattern))為主體的過(guò)程。為低分化癌時(shí)，是以浸潤(rùn)生長(zhǎng)過(guò)程(浸潤(rùn)EMT模式(invasive EMT pattern))為主體的過(guò)程。本發(fā)明中，作為“可探討癌癥干細(xì)胞的生物學(xué)特性”的例子，可以舉出以下幾點(diǎn)。各細(xì)胞株重復(fù)地經(jīng)過(guò)了特有的變化的進(jìn)展過(guò)程，因此，其中所含的癌癥干細(xì)胞顯示了相同細(xì)胞株具有特有的最終分化終點(diǎn)這樣的生物學(xué)特性。并且，如果跨兩代進(jìn)行癌癥干細(xì)胞變遷的追蹤，則在第I代中失去癌癥干細(xì)胞性并分化的細(xì)胞在第2代中重新獲得干細(xì)胞性，S卩，顯示所謂的干細(xì)胞的可塑性這樣的生物學(xué)特性。
已知干細(xì)胞的分化多能的獲得、即所謂重編程的生物學(xué)特性與P53蛋白質(zhì)表達(dá)的減少有關(guān)，這在同一模型中發(fā)現(xiàn)的癌癥干細(xì)胞中也有再現(xiàn)。本發(fā)明的動(dòng)物模型中再現(xiàn)了癌細(xì)胞通過(guò)完全上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(完全-EMT)轉(zhuǎn)化為形成腫瘤間充質(zhì)的成纖維細(xì)胞的過(guò)程。對(duì)于轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，可通過(guò)進(jìn)行IHC染色來(lái)確認(rèn)。對(duì)于是否進(jìn)行了向人特異性成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，這可通過(guò)對(duì)人特異性β2微球蛋白進(jìn)行IHC染色來(lái)確認(rèn)。本發(fā)明的動(dòng)物模型中，可以觀察到在上述對(duì)象癌癥疾病的種類、或者癌癥疾病的進(jìn)展?fàn)顩r中特有的過(guò)程。本發(fā)明的動(dòng)物模型中，可發(fā)現(xiàn)特有的癌癥干細(xì)胞，該特有的癌癥干細(xì)胞具備再現(xiàn)上述人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)和癌癥進(jìn)展過(guò)程的性質(zhì)?？捎糜谠搫?dòng)物模型制備的動(dòng)物可舉出除人類以外的小鼠、裸小鼠、大鼠、裸大鼠、 豚鼠、倉(cāng)鼠、兔、狗或猴等通常試驗(yàn)中常用的哺乳動(dòng)物?？蓛?yōu)選例舉小鼠、裸小鼠、大鼠、裸大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠或兔等嚙齒類動(dòng)物。從飼養(yǎng)或操作的簡(jiǎn)便性考慮，可更優(yōu)選例舉小鼠、裸小鼠(例如N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠)、大鼠、裸大鼠。確立NOG確立癌細(xì)胞株的嚴(yán)重免疫缺陷N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠(供體動(dòng)物)和移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的動(dòng)物(受體動(dòng)物)可以是同一種動(dòng)物，也可以是不同種動(dòng)物。從免疫學(xué)觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選同一種動(dòng)物，在使用如裸小鼠或裸大鼠等免疫缺陷動(dòng)物時(shí)，可以使用互相不同種的動(dòng)物。以下對(duì)本發(fā)明的動(dòng)物模型的制備方法進(jìn)行說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明的動(dòng)物模型，可通過(guò)將對(duì)供體動(dòng)物一嚴(yán)重免疫缺陷N0D/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠移植人腫瘤組織并確立的NOG確立癌細(xì)胞株移植到受體動(dòng)物的皮下、各體腔或各器官來(lái)制備。對(duì)于移植到受體動(dòng)物中的NOG確立癌細(xì)胞株，可以從該NOG小鼠中摘出、確立。所述NOG小鼠的周齡可根據(jù)所移植的確立癌細(xì)胞株的種類或受體動(dòng)物的種類來(lái)選擇。對(duì)于受體動(dòng)物的周齡，在例如為小鼠、裸小鼠、SCID小鼠、NOD-SCID小鼠、NOG小鼠、大鼠、裸大鼠時(shí)，優(yōu)選使用4-100周齡的受體動(dòng)物。本發(fā)明的動(dòng)物模型具體可按照下述方法制備。首先將來(lái)自人的癌細(xì)胞移植到NOG小鼠中并繼代，將確立的NOG確立癌細(xì)胞株(Fujii E等人.，Pathol Int. 2008;58:559-567)移植到受體動(dòng)物中。從移植技術(shù)簡(jiǎn)便的觀點(diǎn)考慮，皮下移植是優(yōu)選的移植部位，但移植部位并沒(méi)有特別限定，優(yōu)選根據(jù)所使用的動(dòng)物選擇適當(dāng)?shù)囊浦膊课?。NOG確立癌細(xì)胞株的移植操作沒(méi)有特別限定，可按照常用的移植操作進(jìn)行。在上述移植后，本發(fā)明的動(dòng)物模型可以進(jìn)一步根據(jù)需要在常規(guī)或無(wú)菌條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件沒(méi)有限定，具體來(lái)說(shuō)，可例舉溫度條件20-26°C、濕度條件30-70%、喂食 喂水條件自由攝取、照明周期12小時(shí)明暗周期。飼養(yǎng)時(shí)間沒(méi)有特別限定，優(yōu)選地，對(duì)于小鼠、裸小鼠、大鼠或裸大鼠均可以是自移植起飼養(yǎng)3天以上，優(yōu)選28天以上。通過(guò)將移植動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)定的時(shí)間，移植的NOG確立癌細(xì)胞株在該移植部位分化生長(zhǎng)為具有人腫瘤組織的組織學(xué)特征的組織。這樣，本發(fā)明的動(dòng)物模型具有具備人腫瘤組織的特征的組織，可作為人類癌癥疾病的病態(tài)動(dòng)物模型提供。
該細(xì)胞的培養(yǎng)方法是在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(D-MEM、MEM、RPMI1640, BME、D-MEM/F12、G-MEM等)中加入適當(dāng)?shù)奶砑游?滅活胎牛血清、青霉素、鏈霉素、葡萄糖、碳酸氫鈉、HEPES、L-葡糖胺、肝素、BSA、FGF、EGF、運(yùn)鐵蛋白、胰島素、腐胺、亞硒酸鹽、孕酮等)，將其在適合哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件(例如37°C、5%C02存在下)實(shí)施。通過(guò)以在這些動(dòng)物或細(xì)胞株中表達(dá)的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程或其生物學(xué)特性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，本發(fā)明的模型動(dòng)物或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系可用于抗癌藥靶的探索、抗癌藥的篩選、或用于治療或預(yù)防人類癌癥疾病的藥物的評(píng)價(jià)篩選。本發(fā)明涉及抗癌藥靶的探索方法，其特征在于在移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。本方法中，在使用移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型時(shí)，可通過(guò)以下
(1)-(4)的步驟進(jìn)行抗癌藥靶的探索
(1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(3)對(duì)于(2)中采集的組織塊研究其DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的步驟；以及
(4)對(duì)依賴于組織塊中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性變化的基因·蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。本方法中，在使用NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系時(shí)，可按照以下
(1)-(3)的步驟進(jìn)行抗癌藥靶的探索。(I)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)對(duì)再現(xiàn)了特征結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)細(xì)胞的DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行研究的步驟；以及
(3)對(duì)依賴于培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性變化的基因·蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。本發(fā)明中，對(duì)于癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織或細(xì)胞株的結(jié)構(gòu)觀察，可如下進(jìn)行通過(guò)AMeX法等制備薄切片組織標(biāo)本，再對(duì)其實(shí)施HE染色和免疫組織化學(xué)染色(IHC)。在受檢組織中，在上述人腫瘤組織中確認(rèn)特異性的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性時(shí)，作為癌癥的關(guān)聯(lián)組織，要確認(rèn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。本發(fā)明中，RNA可舉出mRNA或微小RNA，但并不限于它們。對(duì)于DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的確認(rèn)沒(méi)有特別限定，可按照常用的表達(dá)確認(rèn)方法進(jìn)行。例如，可按照常規(guī)方法提取各基因的mRNA，通過(guò)實(shí)施以該mRNA為模板的RNA雜交法、或RT-PCR法來(lái)進(jìn)行各基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定。也可以進(jìn)一步使用DNA陣列技術(shù)，測(cè)定各基因的表達(dá)水平。還可以按照常規(guī)方法回收含有由各基因編碼的蛋白質(zhì)的部分，通過(guò)SDS-PAGE等電泳法檢測(cè)各蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此進(jìn)行基因翻譯水平的測(cè)定。還可以使用各蛋白質(zhì)的抗體，實(shí)施蛋白質(zhì)印跡法，檢測(cè)各蛋白質(zhì)的表達(dá)，由此進(jìn)行基因翻譯水平的測(cè)定。本發(fā)明涉及抗癌藥的篩選方法，其特征在于在移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。本方法中，使用移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型時(shí)，可按照以下(1)-(5)的步驟進(jìn)行抗癌藥的篩選
(1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟；
(3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(5)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程及其生物學(xué)特性進(jìn)行 鑒定的步驟。作為使用移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型時(shí)的又一方案，可按照以下(1)-(5)的步驟進(jìn)行抗癌藥的篩選
(1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟；
(3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(5)對(duì)抑制特定的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的受檢物質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。本方法中，使用NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系時(shí)，可按照以下(1)-(4)的步驟進(jìn)行抗癌藥的篩選
(1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟；
(3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(4)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。作為使用NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系時(shí)的又一方案，可按照以下
(1)-(4)的步驟進(jìn)行抗癌藥的篩選
(1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟；
(3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(4)對(duì)抑制特定的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的受檢物質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。
本發(fā)明的方法中的“受檢物質(zhì)”沒(méi)有特別限定，例如可舉出天然化合物、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等單一化合物，以及化合物文庫(kù)、基因文庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、原核細(xì)胞提取物、真核單細(xì)胞提取物或動(dòng)物細(xì)胞提取物等。它們可以是純化物，還可以是植物、動(dòng)物或微生物等的提取物等的粗純化物。受檢物質(zhì)的制造方法也沒(méi)有特別限定，可以是由天然產(chǎn)物分離的物質(zhì)，也可以是化學(xué)或生物化學(xué)合成的物質(zhì)，還可以是基因工程制備的物質(zhì)。上述受檢試樣可根據(jù)需要適當(dāng)標(biāo)記后使用。標(biāo)記物例如可舉出放射標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物等。除上述受檢試樣之外，也包含將多種這些受檢試樣混合得到的混合物。本方法中，對(duì)于對(duì)非人動(dòng)物模型給予受檢物質(zhì)的方法也沒(méi)有特別限定。根據(jù)所給予的受檢物質(zhì)的種類，可適當(dāng)選擇口服給予，或皮下、靜脈、局部、透皮或經(jīng)腸(直腸)等的非口服給予。本方法中，對(duì)于用受檢物質(zhì)對(duì)NOG確立癌細(xì)胞株的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的方法也沒(méi)有特別限定。該處理可通過(guò)在細(xì)胞的培養(yǎng)液或該細(xì)胞提取液中添加受檢試樣來(lái)進(jìn)行。受檢試樣為蛋白質(zhì)時(shí)，例如可以通過(guò)將含有編碼該蛋白質(zhì)的DNA的載體導(dǎo)入NOG確立癌細(xì)胞株， 或者將該載體添加到NOG確立癌細(xì)胞株的細(xì)胞提取液中來(lái)進(jìn)行。例如還可以利用使用酵母或動(dòng)物細(xì)胞等的雙雜交法。受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行然后，對(duì)該模型動(dòng)物摘出移植組織(移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的組織)，觀察該移植組織的組織學(xué)特征，或者在細(xì)胞培養(yǎng)體系中測(cè)定組織學(xué)特征。具體來(lái)說(shuō)，受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行在非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)是否形成人類癌細(xì)胞特有的等級(jí)結(jié)構(gòu)，或者確認(rèn)對(duì)人類癌癥疾病的特征性的癌癥進(jìn)展過(guò)程的影響。對(duì)癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織或細(xì)胞株的結(jié)構(gòu)觀察可如下進(jìn)行通過(guò)AMeX法等制備薄切片組織標(biāo)本，再實(shí)施HE染色和免疫組織化學(xué)染色(IHC)。更具體地說(shuō)，上述受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行對(duì)于未給予受檢物質(zhì)的對(duì)照非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株同樣地觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)是否形成人類癌細(xì)胞特有的等級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)比給予了受檢物質(zhì)的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株和上述對(duì)照動(dòng)物的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)。這種情況下，與對(duì)照動(dòng)物的情況相比，如果在給予了受檢物質(zhì)的移植組織或培養(yǎng)體系中未見人類癌細(xì)胞特有的等級(jí)結(jié)構(gòu)，或者其比例降低時(shí)，則可以選擇這些受檢物質(zhì)作為具有人類癌癥疾病的治療或預(yù)防效果的有效物質(zhì)。更具體地說(shuō)，上述受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行對(duì)于未給予受檢物質(zhì)的對(duì)照非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株同樣地觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌癥進(jìn)展過(guò)程，確認(rèn)是否可見人類癌細(xì)胞特有的癌癥進(jìn)展過(guò)程，對(duì)比給予了受檢物質(zhì)的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株和上述對(duì)照動(dòng)物的癌癥干細(xì)胞的癌癥進(jìn)展過(guò)程。這種情況下，與對(duì)照動(dòng)物的情況相t匕，如果在給予了受檢物質(zhì)的移植組織或培養(yǎng)體系中未見人類癌細(xì)胞特有的癌癥進(jìn)展過(guò)程，則可以選擇這些受檢物質(zhì)作為具有人類癌癥疾病的治療或預(yù)防效果的有效物質(zhì)。并且更具體地說(shuō)，上述受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行對(duì)于未給予受檢物質(zhì)的對(duì)照非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株同樣地觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌癥干細(xì)胞的生物學(xué)特性，確認(rèn)是否可見人類癌細(xì)胞特有的該特性，對(duì)比給予了受檢物質(zhì)的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株和上述對(duì)照動(dòng)物的癌癥干細(xì)胞的該特性。這種情況下，與對(duì)照動(dòng)物的情況相比，如果在給予了受檢物質(zhì)的移植組織或培養(yǎng)體系中未見人類癌細(xì)胞特有的該特性，則可以選擇這些受檢物質(zhì)作為具有人類癌癥疾病的治療或預(yù)防效果的有效物質(zhì)。對(duì)于用上述本發(fā)明的篩選方法選擇的人類癌癥疾病的預(yù)防有效物質(zhì)或治療有效物質(zhì)，可根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行其它的藥效試驗(yàn)或安全性試驗(yàn)等，或者進(jìn)一步對(duì)人類癌癥疾病患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)，由此可以選擇作為效果更高、實(shí)用性高的預(yù)防有效物質(zhì)或治療有效物質(zhì)。上述選擇的預(yù)防有效物質(zhì)或治療有效物質(zhì)還可進(jìn)一步根據(jù)其結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，通過(guò)化學(xué)合成、生物化學(xué)合成(發(fā)酵)或基因?qū)W操作來(lái)工業(yè)化制造。本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防人類癌癥疾病的藥物的評(píng)價(jià)篩選方法，其特征在于在移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型中，以癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)或癌癥進(jìn)展過(guò)程為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)
本方法中，在使用移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型時(shí)，可通過(guò)以下的(1)-(5) 的步驟進(jìn)行藥物的評(píng)價(jià)。(I)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；
(2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟；
(3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟；
(4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(5)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程及其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。本方法中，在使用NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系時(shí)，可通過(guò)以下(1)-(4)的步驟進(jìn)行藥物的評(píng)價(jià)
(1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟；
(2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟；
(3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及
(4)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。本發(fā)明的藥物的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行對(duì)上述非人動(dòng)物模型給予對(duì)象受檢物質(zhì)，或者將NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系用受檢物質(zhì)進(jìn)行處理，檢驗(yàn)該受檢物質(zhì)的給予對(duì)于移植組織(移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的組織)或培養(yǎng)體系的預(yù)防或改善效果。這里，具體來(lái)說(shuō)，受檢物質(zhì)的給予對(duì)上述移植組織或培養(yǎng)體系的預(yù)防或改善的效果可通過(guò)對(duì)給予受檢物質(zhì)所引起的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)的形態(tài)、癌癥進(jìn)展過(guò)程或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定 觀察來(lái)評(píng)價(jià)。在非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，通過(guò)觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)是否形成人類癌細(xì)胞特有的等級(jí)結(jié)構(gòu)，或者確認(rèn)對(duì)于人類癌癥疾病中的特征性的癌癥進(jìn)展過(guò)程的影響來(lái)進(jìn)行。
更具體地說(shuō)，上述受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行對(duì)于未給予受檢物質(zhì)的對(duì)照非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株同樣地觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)是否形成人類癌細(xì)胞特有的等級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)比給予了受檢物質(zhì)非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株和上述對(duì)照動(dòng)物的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)。這種情況下，與對(duì)照動(dòng)物的情形相比，如果在給予了受檢物質(zhì)的移植組織或培養(yǎng)體系中未見到人類癌細(xì)胞特有的等級(jí)結(jié)構(gòu)，或者其比例降低時(shí)，則對(duì)于給予了該受檢動(dòng)物或?qū)υ撆囵B(yǎng)體系進(jìn)行了處理的受檢物質(zhì)，可以認(rèn)定其對(duì)于人類癌癥疾病的預(yù)防效果或治療效果，還可以由其降低的程度來(lái)評(píng)價(jià)預(yù)防效果或治療效果的程度。更具體地說(shuō)，上述受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行對(duì)于未給予受檢物質(zhì)的對(duì)照非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株同樣地觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌癥進(jìn)展過(guò)程，確認(rèn)是否可見人類癌細(xì)胞特有的癌癥進(jìn)展過(guò)程，對(duì)比給予了受檢物質(zhì)的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株和上述對(duì)照動(dòng)物的癌癥干細(xì)胞的癌癥進(jìn)展過(guò)程。這種情況下，與對(duì)照動(dòng)物的情況相t匕，如果在給予了受檢物質(zhì)的移植組織或培養(yǎng)體系中未見人類癌細(xì)胞特有的癌癥進(jìn)展過(guò)程，則對(duì)于給予了該受檢動(dòng)物或?qū)υ撆囵B(yǎng)體系進(jìn)行了處理的受檢物質(zhì)，可以認(rèn)定其對(duì)于人類癌癥疾病的預(yù)防效果或治療效果，還可以由癌癥進(jìn)展過(guò)程的表現(xiàn)率程度來(lái)評(píng)價(jià)預(yù)防效果 或治療效果的程度。并且更具體地說(shuō)，上述受檢物質(zhì)的評(píng)價(jià)可如下進(jìn)行對(duì)于未給予受檢物質(zhì)的對(duì)照非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株同樣地觀察移植組織或培養(yǎng)體系的癌癥干細(xì)胞的生物學(xué)特性，確認(rèn)是否可見人類癌細(xì)胞特有的該特性，對(duì)比給予受檢物質(zhì)的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株和上述對(duì)照動(dòng)物的癌癥干細(xì)胞的該特性。這種情況下，與對(duì)照動(dòng)物的情況相t匕，如果在給予了受檢物質(zhì)的移植組織或培養(yǎng)體系中未見人類癌細(xì)胞特有的該特性，則對(duì)于給予了該受檢動(dòng)物或?qū)υ撆囵B(yǎng)體系進(jìn)行了處理的受檢物質(zhì)，可以認(rèn)定其對(duì)于人類癌癥疾病的預(yù)防效果或治療效果，還可以由該特性的表現(xiàn)率程度來(lái)評(píng)價(jià)預(yù)防效果或治療效果的程度。本發(fā)明涉及使用移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物或NOG確立癌細(xì)胞株作為再現(xiàn)癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的癌癥模型動(dòng)物或細(xì)胞株的方法。通過(guò)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，可以人工或人為地在體內(nèi)再現(xiàn)癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性。因此，對(duì)于移植了 NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物，在利用癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行例如藥物等的評(píng)價(jià)、藥物或診斷藥的靶候選分子的探索、作用于該候選分子的化合物或生物制劑等的評(píng)價(jià)時(shí)，這樣的非人動(dòng)物成為非常有用的癌癥模型動(dòng)物。僅憑NOG確立癌細(xì)胞株即可以人工或人為地在體內(nèi)或體外再現(xiàn)癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性。因此，在利用癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行例如藥物等的評(píng)價(jià)、藥物或診斷藥的靶候選分子的探索、作用于該候選分子的化合物或生物制劑等的評(píng)價(jià)時(shí)，NOG確立癌細(xì)胞株成為非常有用的癌癥模型動(dòng)物。再現(xiàn)是指根據(jù)該模型的使用目的以能夠達(dá)到規(guī)定的目的的程度實(shí)現(xiàn)即可，并不一定需要在生物體內(nèi)發(fā)生的事件完全按原樣實(shí)現(xiàn)。本說(shuō)明書中引用的所有的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)均作為參照結(jié)合到本說(shuō)明書中。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定為這些實(shí)施例。[實(shí)施例I]NOG確立癌細(xì)胞株再現(xiàn)人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu) (I)NOG確立癌細(xì)胞株和染色法
在NOG小鼠中使用以可以將人結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌移植·繼代3代以上作為確立條件制備的NOG確立癌細(xì)胞株(Fujii E等人.，Pathol Int. 2008;58:559-567)。本實(shí)施例中，將NOG確立癌細(xì)胞株皮下移植到NOG小鼠中，28天后解剖檢查，摘出移植物，用4%低聚甲醛、在4°C下、以16-24小時(shí)的條件進(jìn)行固定，然后通過(guò)AMeX法包埋，制備薄切片組織標(biāo)本(Fujii E.等人.，Pathol Int. 2008; 58: 559-567)。對(duì)組織實(shí)施HE染色和免疫組織化學(xué)染色(IHC)，一級(jí)抗體使用抗鈣粘著蛋白E抗體(DakoCytomation制造)以及抗纖連蛋白抗體(DakoCytomation制造),使用LSAB法、通過(guò)DAB 顯色(DAB Map 試劑盒，Roche Diagnostics 制造)。 為了進(jìn)行體外培養(yǎng)，將由小鼠回收的細(xì)胞團(tuán)塊用剪刀物理絞碎。接著加入膠原酶 / 分散酶(Roche,目錄號(hào) 10 269 638 001)和 DNA 酶 I (Roche,目錄號(hào) 11 284 932001)，在37°C下攪拌30分鐘。進(jìn)一步反復(fù)移液，調(diào)節(jié)磨碎的細(xì)胞。將調(diào)節(jié)后的細(xì)胞用CellBanker-1 (JUJI FIELD,目錄號(hào) BLC-1)懸浮，在 _80°C 以下保存。使用將培養(yǎng)基中的胎牛血清通過(guò)在56°C下進(jìn)行保溫30分鐘以上的處理而滅活的胎牛血清，將上述調(diào)節(jié)后的細(xì)胞在培養(yǎng)基I (RPMI1640、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素)中培養(yǎng)。球狀體的制備是將細(xì)胞在培養(yǎng)基I中懸浮，使其濃度為4X105個(gè)細(xì)胞/mL，將5 mL細(xì)胞接種于Hydrocell 6cm皿(NUNC，目錄號(hào)174912)。培養(yǎng)3_6天后用顯微鏡確認(rèn)球狀體的形成。形成球狀體后，將所有細(xì)胞過(guò)40 μπι細(xì)胞篩(BD,目錄號(hào)352340)，只回收該球狀體細(xì)胞，在培養(yǎng)基I中培養(yǎng)。作為再現(xiàn)腺腔結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)體系，是將基質(zhì)膠基底膜基質(zhì)(Matrigel BasementMembrane Matrix) (BD,目錄號(hào)354234)原液以50 μ L/孔加入到96孔板中。將其在37°C下放置5分鐘，進(jìn)行96孔板的包被。接著，以50 UL /孔加入球狀體細(xì)胞。進(jìn)一步以50μ L/孔加入用培養(yǎng)基I稀釋為20%的基質(zhì)膠基底膜基質(zhì)，在37°C下放置5分鐘。最后以100 μ L/孔加入培養(yǎng)基I，培養(yǎng)至可見腺腔結(jié)構(gòu)。(2)結(jié)果和結(jié)論
據(jù)認(rèn)為人結(jié)腸癌組織的上皮樣腺腔區(qū)域的特征是在細(xì)胞全周表達(dá)鈣粘著蛋白E的表達(dá)(Kirchner T 等人·，Am J Pathol. 2000; 157:1113-1121)，該特征在 NOG 確立癌細(xì)胞株中可見(圖I)。顯示在上述體外條件下，形成球狀體的細(xì)胞再現(xiàn)了腺腔結(jié)構(gòu)(圖2)。與此相對(duì)，已知在具有更未分化的間充質(zhì)系細(xì)胞的性質(zhì)的浸潤(rùn)區(qū)域，顯示出芽、腫瘤細(xì)胞的聚簇、解離的單個(gè)的腫瘤細(xì)胞以及小管重建這樣的特征形態(tài)圖像。還已知位于這些區(qū)域的細(xì)胞被認(rèn)為發(fā)生部分喪失上皮性的部分-EMT，在與間充質(zhì)的接觸面，鈣粘著蛋白E的表達(dá)消失,表達(dá)通常上皮細(xì)胞不表達(dá)的纖連蛋白(Kirchner T.等人.，Am J Pathol.2000; 157: 1113-1121)。這次，在NOG確立結(jié)腸癌細(xì)胞株的移植腫瘤中再現(xiàn)了這些特征(圖 3)。同樣的上皮樣區(qū)域和浸潤(rùn)區(qū)域在胃癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌中也得到確認(rèn)(圖4)。由以上結(jié)果表明，NOG確立癌細(xì)胞株再現(xiàn)了人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)。[實(shí)施例2]NOG確立癌細(xì)胞株再現(xiàn)形成移植源人類癌癥組織的特征性等級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)程
(I) NOG確立癌細(xì)胞株和染色法
將移植源人結(jié)腸癌組織的組織形態(tài)為(I)高分化型腺癌、(2)中分化型腺癌、(3)低分化型腺癌的NOG確立癌細(xì)胞株皮下移植至NOG小鼠中，在3、7、14、17或21天后解剖檢查，與上述同樣地實(shí)施HE染色和IHC，形態(tài)學(xué)求出上皮樣區(qū)域和浸潤(rùn)部分區(qū)域的比例。在胃癌、結(jié)腸癌、肺癌中，為了確認(rèn)該組織構(gòu)建的重復(fù)再現(xiàn)性，進(jìn)行移植源癌癥組織和NOG確立癌細(xì)胞株的HE染色標(biāo)本的觀察。 (2)結(jié)果和結(jié)論
了解到，達(dá)到呈現(xiàn)移植源人結(jié)腸癌組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)分別經(jīng)歷特有的癌癥進(jìn)展過(guò)程，在高分化腺癌的情況下，是以上皮樣生長(zhǎng)過(guò)程(上皮管形成模式(Epithelial duct formingpattern))為主體，在中分化腺癌的情況下，是以含有上皮樣生長(zhǎng)，同時(shí)以浸潤(rùn)生長(zhǎng)過(guò)程(浸潤(rùn)EMT模式(Invasive EMT pattern))為主體,在低分化腺癌的情況下,主要是浸潤(rùn)生長(zhǎng)過(guò)程。該各細(xì)胞株特有的等級(jí)分化也可通過(guò)多次的移植繼代重復(fù)再現(xiàn)(圖5)。[表I]達(dá)到各NOG確立株的等級(jí)結(jié)構(gòu)的隨時(shí)間的變化
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a :接種后的天數(shù)
b:IHC切片中檢測(cè)出β_聯(lián)蛋白的核積累。[實(shí)施例3]在NOG確立癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)具備形成各等級(jí)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)的特有的癌癥干細(xì)胞
(I)NOG確立癌細(xì)胞株和染色法
已知癌癥干細(xì)胞通常是細(xì)胞周轉(zhuǎn)非常慢的低生長(zhǎng)細(xì)胞(Li L, Neaves WB. Cancerres. 2006; 66:4553-4557)。著眼于該性質(zhì)，在將NOG確立癌細(xì)胞株皮下移植至NOG小鼠中時(shí)，同時(shí)開始進(jìn)行在細(xì)胞分裂期摻入的BrdU的連續(xù)標(biāo)記，標(biāo)記14天后解剖檢查，進(jìn)行組織處理。通過(guò)將該組織與上述同樣地進(jìn)行HE染色，進(jìn)行形態(tài)觀察，并且通過(guò)IHC染色進(jìn)行摻入了 BrdU的細(xì)胞的檢測(cè)(抗體Beckton Dickinson制造)以及進(jìn)行使用Ki67抗體作為細(xì)胞分裂期標(biāo)志物的IHC染色，鑒定生長(zhǎng)細(xì)胞和低生長(zhǎng)細(xì)胞。進(jìn)一步對(duì)于與其相鄰接的標(biāo)本，使用針對(duì)已知作為癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物的Lgr5的抗體(MBL制造)，實(shí)施IHC染色(McDonaldSAC,等人·，Virchows Arch. 2009; 455: 1-13) (2)結(jié)果和結(jié)論
在實(shí)施了 BrdU連續(xù)標(biāo)記的組織中，可在上皮樣生長(zhǎng)和浸潤(rùn)生長(zhǎng)兩個(gè)區(qū)域看見一部分未被標(biāo)記的細(xì)胞，該細(xì)胞為Ki67陰性。由此可以認(rèn)為在兩個(gè)區(qū)域存在作為癌癥干細(xì)胞的特征而已知的、細(xì)胞周轉(zhuǎn)非常慢的低生長(zhǎng)細(xì)胞，將與該標(biāo)本相鄰接的標(biāo)本用癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5染色，則得到了與低生長(zhǎng)細(xì)胞的存在部位一致的染色圖像(圖6)。這些低生長(zhǎng)細(xì)胞分別在上皮樣生長(zhǎng)部和浸潤(rùn)生長(zhǎng)部被發(fā)現(xiàn)(圖7)。結(jié)合以上和取得實(shí)施例2的等級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)程考慮，顯示癌癥干細(xì)胞的存在部的變遷及其等級(jí)結(jié)構(gòu)的形成如圖8所示。過(guò)去通過(guò)觀察人結(jié)腸癌，假定了在上皮樣生長(zhǎng)部可見的靜止干細(xì)胞(stationarystem cell)和在轉(zhuǎn)移目標(biāo)地等同樣有助于形成等級(jí)結(jié)構(gòu)的遷移干細(xì)胞(migrating stemcell)的存在。然而，通過(guò)本次研究，如圖8所示，顯示了上述干細(xì)胞的實(shí)際存在，并且顯示，它們不是不同的兩種癌癥干細(xì)胞，而可以相互轉(zhuǎn)變，以及其變遷參與了腫瘤等級(jí)結(jié)構(gòu)的形 成。如實(shí)施例2所示，NOG確立癌細(xì)胞株忠實(shí)地再現(xiàn)了各移植源人類癌癥組織的最終分化終點(diǎn)，這通過(guò)多次繼代，總是會(huì)再現(xiàn)，由此可以明確，其中所含的癌癥干細(xì)胞規(guī)定了各自的最終分化終點(diǎn)。由以上顯示，在研究癌癥干細(xì)胞所特有的生物學(xué)特性方面，本模型是適合的。[實(shí)施例4]通過(guò)使用IdU和BrdU跨兩代追蹤癌癥干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)癌癥干細(xì)胞的可塑性
(I)NOG確立癌細(xì)胞株和染色法
將NOG確立癌細(xì)胞株皮下移植至NOG小鼠中時(shí)，同時(shí)開始IdU連續(xù)標(biāo)記，標(biāo)記28天后解剖，制備用于次代的IdU標(biāo)記的移植細(xì)胞株。移植至次代的同時(shí)，開始該細(xì)胞株的BrdU連續(xù)標(biāo)記，在移植3天后將其解剖，進(jìn)行組織處理。將以上得到的連續(xù)組織標(biāo)本用檢出IdU和BrdU的抗體(Beckton Dickinson制造)和只檢出BrdU的抗體(Serotec制造)、通過(guò)IHC染色檢出，檢出生長(zhǎng)細(xì)胞和低生長(zhǎng)細(xì)胞的跨世代的變動(dòng)。(2)結(jié)果和結(jié)論
如圖9所示，將第二代、移植3天后的標(biāo)本用檢出IdU和BrdU的抗體進(jìn)行IHC染色時(shí)，得到陽(yáng)性染色，在用只檢出BrdU的抗體染色時(shí)，發(fā)現(xiàn)了陰性的細(xì)胞。由以上的染色結(jié)果顯示，這些細(xì)胞在第一代中摻入了 IdU，但在第二代中未摻入BrdU，這可以認(rèn)為在第一代中進(jìn)行了細(xì)胞分裂的分化細(xì)胞在第二代中停止生長(zhǎng)而低·非生長(zhǎng)細(xì)胞化(干細(xì)胞化)。如上所述，分化生長(zhǎng)的細(xì)胞干細(xì)胞化的現(xiàn)象被稱為可塑性，一度被認(rèn)為是癌癥干細(xì)胞的生物學(xué)特征之一(Gupta PB.等人·，Nature med. (2009) 15: 1010-12)。由以上表明，本模型適合癌癥干細(xì)胞的生物學(xué)特性可塑性的研究。[實(shí)施例5]發(fā)現(xiàn)參與干細(xì)胞的重編程的低P53蛋白表達(dá)細(xì)胞與癌癥干細(xì)胞一致 (I)NOG確立癌細(xì)胞株和染色法
近年來(lái)，在制備所謂的誘導(dǎo)多能干(induced pluripotent stem, iPS)細(xì)胞時(shí),如果使P53蛋白的表達(dá)減弱，則其制備效率飛躍性提高，由此顯示，該蛋白參與了體細(xì)胞通過(guò)重編程進(jìn)行的干細(xì)胞化，有人還指出了該機(jī)制在癌癥干細(xì)胞中的重要性(Krizhanovsky V和Lowe Sff, Nature 2009; 460: 1085-6)。
因此，為了觀察在NOG確立癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的癌癥干細(xì)胞與P53低表達(dá)細(xì)胞的一致，對(duì)實(shí)施了 BrdU連續(xù)標(biāo)記處置的NOG小鼠皮下移植確立細(xì)胞株后，第28天解剖，進(jìn)行組織處理。將由此得到的連續(xù)組織標(biāo)本用抗P53抗體(DakoCytomation制造)和抗BrdU抗體(Beckton Dickinson制造)、通過(guò)IHC染色使其可觀察,觀察到其一致狀況。(2)結(jié)果和結(jié)論
在很多癌癥中均報(bào)道了 P53的過(guò)量表達(dá)(Toledo F和Wahl GM. , Nature rev cancer2006; 6: 909-923)，但這次在很多的NOG確立癌細(xì)胞中也觀察到該蛋白的過(guò)量表達(dá)。另一方面，與BrdU弱陽(yáng)性和陰性細(xì)胞一致地，P53的表達(dá)減弱或消失(圖10)。近年來(lái)，已經(jīng)了解到在使體細(xì)胞獲得分化多能的所謂的重編程中，P53蛋白表達(dá)的減少在包括癌癥干細(xì)胞在內(nèi)的干細(xì)胞生物學(xué)特性方面擔(dān)負(fù)著重要的作用。因此，在本模型的癌癥干細(xì)胞中也見到了 P53蛋白表達(dá)的減少，這顯示該細(xì)胞中，干細(xì)胞的重編程機(jī)制發(fā)揮了作用，明確了該模型適合研究其生物學(xué)特性。 [實(shí)施例6]NOG確立癌細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)了癌細(xì)胞通過(guò)完全EMT轉(zhuǎn)化為形成腫瘤間充質(zhì)的成纖維細(xì)胞的過(guò)程
(I)NOG確立癌細(xì)胞株和染色法
將NOG確立癌細(xì)胞株皮下移植至NOG小鼠中后14天，將各動(dòng)物解剖檢查，對(duì)于所得的腫瘤團(tuán)塊、實(shí)施人特異性的β 2微球蛋白的IHC染色，研究種的來(lái)源。在體外培養(yǎng)之前，使用人特異性抗人HLA-ABC抗原/RPE (DAK0,目錄號(hào)R7000)抗體、和小鼠特異性抗小鼠(Anti-mMuse) MHC I類(Abeam,目錄號(hào)abl5680_50)抗體,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)所接種的細(xì)胞的種的來(lái)源，然后將其在培養(yǎng)基I中培養(yǎng)，追蹤成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的出現(xiàn)。(2)結(jié)果和結(jié)論
在腫瘤間充質(zhì)中觀察到來(lái)自人的成纖維細(xì)胞(圖11)。將培養(yǎng)前已確認(rèn)90%左右為人細(xì)胞的細(xì)胞用實(shí)施例I中使用的培養(yǎng)基I培養(yǎng)，確認(rèn)成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)。(圖12)。[實(shí)施例7]可以發(fā)現(xiàn)對(duì)抗癌藥顯示抗性的形態(tài)學(xué)特征結(jié)構(gòu)
(I)來(lái)自NOG確立癌細(xì)胞株的抗癌藥抗性細(xì)胞的檢出
將高分化型腺癌和中分化型腺癌移植至各3例NOG小鼠中后7天、10天、14天，共三次腹腔內(nèi)給予100 mg/kg 5-氟尿卩密唳(5-FU,Mayne Pharma),在最后給予的第二天(移植后15天)采集腫瘤團(tuán)塊。按照與上述同樣的方法將其制備HE染色標(biāo)本，與由給予了溶劑的對(duì)象組(3例)制備的標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)比較。(2)結(jié)果和結(jié)論
如表2和圖13所示，與對(duì)象組比較，在高分化型腺癌中，高度分化的管腔結(jié)構(gòu)部減少，可顯著觀察到管腔結(jié)構(gòu)不明確的低分化腺管。在中分化腺癌中，出芽圖像減少，呈現(xiàn)以低分化腺管為主體的組織圖像。由以上結(jié)果顯示，在高分化型腺癌中，通過(guò)生長(zhǎng)活躍的上皮樣生長(zhǎng)過(guò)程形成的管腔結(jié)構(gòu)部、以及中分化型腺癌的浸潤(rùn)生長(zhǎng)過(guò)程中可見的出芽部對(duì)抗癌藥為感受性，低分化的腺管對(duì)抗癌藥為抗性。如上所述，可見到顯示抗癌藥抗性的特征性的細(xì)胞群·組織結(jié)構(gòu)，由此，可以認(rèn)為顯示可以通過(guò)本模型研究它們被選擇的過(guò)程、長(zhǎng)時(shí)間藥物處置中獲得抗性的過(guò)程、以及抗癌藥治療后的復(fù)發(fā)過(guò)程等。因此顯示，使用本模型，則可以進(jìn)行參與這些過(guò)程的因素的探索、或者以其為靶的藥物的探索和篩選。[表2]給予5-FU后在各株中觀察到的特征結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.非人動(dòng)物模型，該非人動(dòng)物模型通過(guò)將把人腫瘤組織移植到嚴(yán)重免疫缺陷NOD/SCID/ Y (c)(裸)(NOG)小鼠中確立的NOG確立癌細(xì)胞株移植到屬于相同或不同種的非人動(dòng)物中而得到。
2.權(quán)利要求I的非人動(dòng)物模型，其特征在于該非人動(dòng)物模型再現(xiàn)人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)和癌癥進(jìn)展過(guò)程。
3.權(quán)利要求I的非人動(dòng)物模型，其特征在于該非人動(dòng)物模型可以發(fā)現(xiàn)具備再現(xiàn)人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)和癌癥進(jìn)展過(guò)程的性質(zhì)的特有的癌癥干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性。
4.權(quán)利要求I的非人動(dòng)物模型，其特征在于該非人動(dòng)物模型可在人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)的再現(xiàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過(guò)完全上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(完全EMT)轉(zhuǎn)化為形成腫瘤間充質(zhì)的成纖維細(xì)胞的過(guò)程。
5.非人動(dòng)物模型，該非人動(dòng)物模型可通過(guò)對(duì)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的非人動(dòng)物模型給予抗癌藥，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、其癌癥進(jìn)展過(guò)程、其生物學(xué)特性、或其顯示的完全上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(完全EMT)的變化作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，來(lái)研究抗癌藥抗性的成因。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的非人動(dòng)物模型，其特征在于上述人腫瘤組織是來(lái)自結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌的腫瘤組織。
7.抗癌藥靶的探索方法，其特征在于在移植了NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
8.權(quán)利要求7的抗癌藥靶的探索方法，其特征在于該方法包含下述(1)-(4)的步驟 (1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟； (2)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟； (3)對(duì)于(2)中采集的組織塊研究DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的步驟；以及 (4)對(duì)依賴于組織塊中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性變化的基因·蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。
9.權(quán)利要求7的抗癌藥靶的探索方法，其特征在于該方法包含下述(1)-(3)的步驟 (1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟； (2)對(duì)再現(xiàn)了特征結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)細(xì)胞的DNA、RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行研究的步驟；以及 (3)對(duì)依賴于培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性變化的基因·蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。
10.抗癌藥的篩選方法，其特征在于在移植了NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
11.權(quán)利要求10的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(5)的步驟 (I)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟；(2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟； (3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟； (4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及 (5)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。
12.權(quán)利要求10的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(4)的步驟 (1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟； (2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟； (3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及 (4)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。
13.權(quán)利要求10的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(5)的步驟 (1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟； (2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟； (3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟； (4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及 (5)對(duì)抑制特定的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的受檢物質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。
14.權(quán)利要求10的抗癌藥的篩選方法，其特征在于該篩選方法包含下述(1)-(4)的步驟 (1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟； (2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟； (3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及 (4)對(duì)抑制特定的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的受檢物質(zhì)進(jìn)行鑒定的步驟。
15.用于治療或預(yù)防人類癌癥疾病的藥物的評(píng)價(jià)方法，其特征在于在移植了NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物模型或NOG確立癌細(xì)胞株的體外條件下的培養(yǎng)體系中，以癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
16.權(quán)利要求15的藥物的評(píng)價(jià)方法，其特征在于該評(píng)價(jià)方法包含下述(1)-(4)的步驟 (1)將NOG確立癌細(xì)胞株移植到非人動(dòng)物中，由此制備非人動(dòng)物模型的步驟； (2)將受檢物質(zhì)給予(I)的非人動(dòng)物模型的步驟； (3)采集顯示NOG確立癌細(xì)胞株的同一細(xì)胞株各區(qū)域的癌癥進(jìn)展過(guò)程中特征性地觀察到的組織結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的組織塊的步驟； (4)觀察組織塊中癌細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及 (5)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。
17.權(quán)利要求15的用于治療或預(yù)防人類癌癥疾病的藥物的評(píng)價(jià)方法，其特征在于該評(píng)價(jià)方法包含下述(1)-(4)的步驟 (1)在體外條件下培養(yǎng)NOG確立癌細(xì)胞株，再現(xiàn)各癌癥進(jìn)展過(guò)程的特征結(jié)構(gòu)、或其生物學(xué)特性的步驟； (2)用受檢物質(zhì)對(duì)(I)的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟； (3)觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的步驟；以及 (4)對(duì)被受檢物質(zhì)抑制的癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)形成、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定的步驟。
18.使用移植了NOG確立癌細(xì)胞株的非人動(dòng)物或NOG確立癌細(xì)胞株作為再現(xiàn)癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程、或其生物學(xué)特性的癌癥模型動(dòng)物或細(xì)胞株的方法。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供癌癥病態(tài)非人動(dòng)物模型及其利用方法，其特征在于可以再現(xiàn)人類癌癥組織的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程或其生物學(xué)特性。本發(fā)明人為了解決上述課題，首先將NOG確立癌細(xì)胞株移植至NOG小鼠中，形態(tài)學(xué)觀察其組織構(gòu)建。結(jié)果證實(shí)，該非人動(dòng)物模型保有與人類癌癥疾病類似的病態(tài)(癌細(xì)胞的等級(jí)結(jié)構(gòu)、癌癥進(jìn)展過(guò)程或其生物學(xué)特性)。即，本發(fā)明人成功地制備了保有與人類癌癥疾病更為類似的病態(tài)的非人動(dòng)物模型、或顯示與人類癌癥疾病更為類似的細(xì)胞形態(tài)的體外條件下的NOG確立癌細(xì)胞株培養(yǎng)體系。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102821600SQ20108006476
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者鈴木雅實(shí), 松原亨一, 加藤淳彥, 加藤千惠, 小林慎太, 陳玉昭, 山崎雅輝 申請(qǐng)人:藥物研究私人有限公司, 中外制藥株式會(huì)社, 株式會(huì)社實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所