專利名稱：單純皰疹病毒Ⅱ型基因重組減毒活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠防治單純皰疹病毒II型感染所致疾病的基因重組減毒活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
單純皰疫病毒(herpes simplex virus, HSV)是一種經(jīng)皮膚和粘膜密切接觸傳播的病毒，包括單純皰疹病毒I型(簡稱HSV-1)和單純皰疹病毒II型(簡稱HSV-2)，兩種病毒具有83%以上的共同基因特征，50%以上的基 因同源性。其中I型在人群的感染率可高達80%以上，并長期潛伏于感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)，雖然大多數(shù)HSV-I感染者沒有明顯癥狀，但少數(shù)感染者可產(chǎn)生終生的反復(fù)發(fā)作的面口皰疹、致盲性很高的眼內(nèi)眼炎以及致命性的皰疹性肺炎和皰疹腦炎。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，占生殖器皰疹原發(fā)感染的90%以上。II單純皰疹病毒感染人類后主要引起生殖系統(tǒng)原發(fā)性和復(fù)發(fā)性皰疹，可以終生潛伏在神經(jīng)節(jié)內(nèi)，在機體免疫力降低時復(fù)發(fā)。孕婦感染HSV-II型病毒后易發(fā)生流產(chǎn)，也可致胎兒先天畸形或智力低下。新生兒在分娩時感染可導(dǎo)致高熱、呼吸困難或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，其中60% -70%的新生兒可能死亡。此外，有研究表明，生殖器皰疹可將艾滋病感染風(fēng)險增加2-3倍，并促進艾滋病病毒的傳播。研究表明安全套并不能有效預(yù)防皰疹病毒感染，世界范圍內(nèi)生殖器皰疹發(fā)病率在逐年上升，據(jù)美國最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國成人生殖器皰疹患病率已經(jīng)上升到了 16%以上，在紐約已經(jīng)上升至25%以上，目前并無單純皰疹病毒感染，尤其是復(fù)發(fā)性感染的特效治療方法，抗病毒藥物常規(guī)用藥雖能緩解一些臨床癥狀，但不能徹底清除體內(nèi)潛伏的病毒，也不能減少復(fù)發(fā)次數(shù)，因此迫切需要開發(fā)能有效防治單純皰疹病毒感染的疫苗。近數(shù)十年來世界各國HSV疫苗的研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位疫苗免疫原性弱，僅能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞免疫誘導(dǎo)效果較差；新型DNA疫苗雖能同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，但是其轉(zhuǎn)染效率較低，經(jīng)粘膜免疫誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答能力更低。而在單純皰疹病毒的免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞免疫和粘膜免疫發(fā)揮著更大的作用，但上述幾類疫苗均不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答，因此，到目前為止，尚無可以在臨床上應(yīng)用的疫苗上市，單純皰疹病毒疫苗基本上都處于臨床前或臨床研究階段。病毒減毒活疫苗是最為經(jīng)典的疫苗形式，這種類型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗等在人類抵抗感染性疾病的歷史上發(fā)揮了不可替代的作用，為人類的健康做出了不可磨滅的貢獻。減毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一樣的感染和復(fù)制特性，但沒有致病作用，此類疫苗可以有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，相對于其它種類的疫苗而言，免疫原性強，保護效果好。傳統(tǒng)的減毒活疫苗主要是通過連續(xù)培養(yǎng)篩選得到的，但這種方法耗時費力，用這種方法很難得到致病性降低的單純皰疹病毒毒株。近年來，研究者開始采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，將HSV基因組的特定基因進行敲除以獲得重組株。本發(fā)明則是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，以Genebank中的HSV-I和HSV-2基因組參考序列(HSV-1登錄號NC_001806，HSV-2登錄號NC_001798)為藍本，通過聯(lián)合敲除多個基因，篩選出了 HSV-I型和HSV-2型重組減毒株，它們的致病能力均發(fā)生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-I和HSV-2感染所
致疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠預(yù)防和治療單純皰疹病毒II感染所致疾病的重組減毒活疫苗及所述疫苗的制備方法。 本發(fā)明涉及的單純皰疹病毒II型重組株，均由野生HSV-2經(jīng)過重組、篩選和純化得來的。所采用的技術(shù)方案是取水泡較為明顯的口唇皰疹和生殖器皰疹患者的水泡液，分離鑒定出野生型HSV-I和HSV-2 ;擴大培養(yǎng)后提取病毒完整基因組；和含有熒光表達基因及擬定敲除的HSV基因左右兩側(cè)700bp至2000bp的同源側(cè)翼序列的穿梭載體共同轉(zhuǎn)染Veix)細(xì)胞；在熒光顯微鏡下使用一種或者聯(lián)合使用多種熒光蛋白基因作為標(biāo)記挑選出重組病毒，經(jīng)過空斑純化后可獲得所需要的重組減毒活疫苗?？梢垣@得一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基因組中的 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-2 重組株?？梢垣@得一種如上所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，在于聯(lián)合敲除了其基因組中的UL43 UL47基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片段的HSV-2重組株所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是US9 US12基因。用類似的方法在上述重組株的基礎(chǔ)上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一步減低的重組株。作用在小鼠身上可證明，上述的重組株病毒致病能力均有不同程度的減弱，可以保護小鼠免受致死量單純皰疹病毒I型或II型的攻擊；作用在豚鼠身上證明重組株可以預(yù)防和治療豚鼠生殖器皰疹。上述重組株可以作為重組單純皰疹病毒減毒活疫苗以防治單純皰疹病毒感染所致相關(guān)疾病。本發(fā)明用以構(gòu)建同源重組穿梭質(zhì)粒的pShuttle-CMV質(zhì)粒購自Stragene公司，序列和物理圖譜見該公司的產(chǎn)品目錄。本發(fā)明所用熒光標(biāo)記基因是綠色熒光蛋白表達盒和紅色熒光蛋白表達盒。本發(fā)明的有益效果相比傳統(tǒng)疫苗而言，本發(fā)明制備的減毒活疫苗均是經(jīng)過基因工程重組后的減毒活疫苗，不易發(fā)生毒力回復(fù)，其它生物學(xué)特性和野生型單純皰疹病毒相似，但進入機體后僅能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答而無致病作用，具有良好的安全性；本疫苗保留了單純皰疹病毒II型的大部分抗原，具有較高的免疫原性，能很好地模擬野生型HSV-2，有效地誘導(dǎo)機體粘膜和體液免疫應(yīng)答，構(gòu)建機體抵抗皰疹感染的第一道防線，降低人群發(fā)病率；激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，構(gòu)建機體的第二道防線，有可能清除已感染病毒，控制皰疹的復(fù)發(fā)和傳播。


圖I重組單純皰疹病毒減毒活疫苗的構(gòu)建策略示意2重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02L結(jié)構(gòu)示意圖
圖3重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02LS結(jié)構(gòu)示意圖
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案中單純皰疹病毒II型重組減毒活疫苗的總體構(gòu)建策略參見附圖I。提取野生型HSV-I和HSV-2完整基因組；構(gòu)建含有綠色或紅色熒光表達基因及擬定敲除的HSV基因左右兩側(cè)700bp至2000bp的側(cè)翼序列的同源重組穿梭載體，二者共同轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，在熒光顯微鏡下挑選表現(xiàn)相應(yīng)顏色熒光的重組病毒，經(jīng)過空斑純化后可獲得敲除了 HSV-I或HSV-2重組減毒活疫苗。其中敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因的HSV-2 重組株，命名為 JSH02L ；敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 與 US9、US10、USll 和 US12 基因的HSV-2重組株，命名為JSH02LS。用類似的方法在上述重組株的基礎(chǔ)上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一步減低的重組株。實施例I重組單純皰疹病毒II型減毒活疫苗JSH02L構(gòu)建I.按照本案原專利申請?zhí)枮?01010253601. 5的實施例I中HSV-1基因組提取方法提取HSV-2基因組。2.構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle_02L_GFP。(I)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的UL43-UL47的序列，分別設(shè)計UL43基因的左側(cè)側(cè)翼序列和UL47基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。⑵UL43側(cè)翼序列的引物設(shè)計在UL43左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在UL43左側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。(3) UL47側(cè)翼序列的弓丨物設(shè)計UL47右側(cè)翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，UL47右側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。 (4) PCR擴增GFP表達質(zhì)粒pLKO-GFP (由本公司自己構(gòu)建)上的GFP表達盒，上游引物5’末端添加AseI位點和三個保護堿基，下游引物的5’末端添加PmeI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產(chǎn)物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切UL47偵^翼序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)分兩步將步驟2. 5)和2. 6)中回收的產(chǎn)物克隆至pShuttle-CMV載體即構(gòu)建成功 pShuttle-02-GFP。
3.同源重組生產(chǎn)HSV-2敲除株JSH02L(I)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle_02L_GFP質(zhì)粒。(2)用脂質(zhì)體2000將HSV-2基因組和pShuttle-02L_GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細(xì)胞。
(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細(xì)胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-I敲除株JSH02L(圖2)。(6)用Veix)細(xì)胞增殖后用TCID5tl法測定滴度。實施例2應(yīng)用綠色和紅色熒光標(biāo)記構(gòu)建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LSJSH02LS的構(gòu)建策略和方法類似本案原專利申請?zhí)枮?01010253601. 5的先前的JSHOILS的構(gòu)建方法，具體詳述如下 I.構(gòu)建US9、US10、US11和US12基因聯(lián)合敲除的HSV-2重組株JSH02S。(I)構(gòu)建同源重組穿梭載體pShuttle-02-RED。I. I)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的US區(qū)US9-US12的序列，分別設(shè)計US9基因的左側(cè)側(cè)翼序列和US12基因的右側(cè)側(cè)翼序列的擴增引物。I. 2)US9側(cè)翼序列的引物設(shè)計在US9左側(cè)翼序列上游引物的5’末端添加NotI位點和三個保護堿基，在US9左側(cè)翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。I. 3) US12側(cè)翼序列的引物設(shè)計US12右側(cè)翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位點和三個保護堿基，US12右側(cè)翼序列下游引物5’末端添加HindIII位點和三個保護堿基，PCR擴增30個循環(huán)后回收目的條帶。I. 4)用 BglII 和 BamHI 雙酶切 pDsredl-cl,連接,轉(zhuǎn)化,得 pDsredbb 質(zhì)粒。I. 5)用AseI和MluI切pDsredbb質(zhì)粒，電泳回收I. 5kb片段I. 6)用NotI和PmeI酶切US9側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，PmeI和HindIII酶切US12側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。I. 7)分兩步將I. 5)和I. 6)步驟中回收的產(chǎn)物克隆至pShuttle-CMV載體后即構(gòu)建成功 pShuttIe-012-REDo(2)同源重組生產(chǎn)HSV-2敲除株JSH02S2. I)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShutt I e_02L_RED質(zhì)粒。2. 2)用脂質(zhì)體2000將HSV-2基因組和pShutt I e_02L-RED質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細(xì)胞。2. 3)在倒置熒光顯微鏡下將紅色CPE處的細(xì)胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。2. 4)將EP管在_80°C -37°C反復(fù)凍融三次。2. 5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微鏡下挑出紅色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02S。2. 6)用Vero細(xì)胞擴增JSH02S后提取基因組備用。2.構(gòu)建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LS——同源重組生產(chǎn)HSV-2敲除株JSH02LS(I)用Axygen質(zhì)粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle_02L_GFP質(zhì)粒。
(2)用脂質(zhì)體2000將JSH02S基因組和pShutt I e_02L_GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至vero細(xì)胞。(3)在倒置熒光顯微鏡下將綠色CPE處的細(xì)胞吸出，轉(zhuǎn)移至含有IML培養(yǎng)基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反復(fù)凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在熒光顯微鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化后獲得HSV-2敲除株JSH02LS，參見附圖3。實施例3重組單純皰疹病毒II型活疫苗對小鼠的免疫保護實驗I.實驗材料
野生型單純皰疹病毒II型和重組單純皰疹病毒減毒活疫苗同上述實施例。正常細(xì)胞裂解液培養(yǎng)皿中正常培養(yǎng)的Veix)細(xì)胞刮下后在_80°C和37°C反復(fù)凍融后過濾。普通級別實驗小白鼠50只，雌性，體重20 土 2g，每一只都在其身體的不同部位做好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-50共50個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為10只/組，分為陰性組、JSH02L、JSH02LS 組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量106TCID50重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-2進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。3.操作步驟(I)小鼠隨機分組后，陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于50微升正常細(xì)胞裂解液，其它組分別給于50微升JSH02L、JSH02LS，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；I)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-2 病毒(含 IO6IU)。2)小鼠腹腔內(nèi)注射HSV-2 0. 1ml。3)觀察小鼠情況4、結(jié)果陰性對照組小鼠攻毒后第5天開始出現(xiàn)死亡情況，第13后全部死亡，其它組全部存活。其它組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例4重組單純皰疹病毒II型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫保護實驗I、實驗材料野生型單純皰疹病毒II型用Vero細(xì)胞擴增HSV-2后測定滴度，滴度約為IX 107IU/ml ;重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、:用Vero細(xì)胞擴增后將滴度均調(diào)整約為I X 107IU/ml ；普通級別實驗豚鼠50只，雌性，體重275 土 5g，每一只都在其身體的不同部位做好標(biāo)記，在將相應(yīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為1-50共50個阿拉伯?dāng)?shù)字，按隨機化原則分為10只/組，分為對照組、JSH02L、JSH02LS 組。2、免疫及攻毒方案免疫劑量=IO5TCID5tl重組活疫苗；途徑鼻腔滴注，在0周實施初次免疫，2周(14天)以后進行加強免疫一次，再過兩周以后，即第5周(35天)用野生型HSV-2進行攻擊試驗，計算豚鼠外陰皮損累計積分，確定保護效果。3、操作步驟(I)第0周，初次免疫豚鼠隨機分組后陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于50微升細(xì)胞裂解液；陽性組同樣方法分別給于50微升JSH02L、JSH02LS，觀察豚鼠情況。(2)第2周，加強免疫陰性對照組經(jīng)鼻腔滴注途徑給于100微升細(xì)胞裂解液；陽性組同樣方法給于100微升JSH02L、JSH02LS,觀察豚鼠情況。(3)第5周，攻毒實驗；I)用棉簽蘸生理鹽水擦洗豚鼠外陰。2)用ImL注射器配上灌胃針頭吸取0. 2mlHSV_2病毒(含IO6IU)。
3)將針頭伸入陰道內(nèi)陰道穹隆后將病毒液注入，緩慢退出。4)用明膠海棉塞住陰道維持病毒液體24h。豚鼠出現(xiàn)癥狀紅腫、起皰、潰瘍、結(jié)痂。評分標(biāo)準(zhǔn)0無癥狀0.5，僅輕微紅腫；I. 0,紅腫明顯，無水皰；I. 5，單個小水皰(彡2mm)；2. 0，單個大水皰(> 2mm)；2. 5，多個小水皰和/或陰道潰瘍(出血)；3.0，多個大水皰；3. 5，嚴(yán)重外陰腫脹；4. 0，多個小/大疤融合；4. 5，后肢癱瘓；5.0，外陰潰瘍，后肢癱瘓4、實驗結(jié)果預(yù)期攻毒后陰性對照組發(fā)病情況攻毒后3天全部出現(xiàn)初發(fā)感染癥狀，大約6 7天，豚鼠皮損程度最嚴(yán)重，逐漸減輕，第10天后基本消失。中間偶有豚鼠病重死亡。初次發(fā)病后13天后出現(xiàn)復(fù)發(fā)感染，整體評分較大；各陽性組預(yù)期偶有豚鼠出現(xiàn)輕微紅腫癥狀，無其它明顯癥狀，整體評分較小。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可預(yù)防生殖器皰疹。實施例5重組單純皰疹病毒I I型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫治療實驗I、實驗材料同上述實施例2、實驗方法用HSV-2病毒攻擊豚鼠后第5天，將豚鼠隨機分為5組，分別經(jīng)鼻腔途徑給予JSH02L、JSH02LS各50微升；第一次免疫治療后的14天，同途徑和劑量進行第二次免疫治療，兩周后再免疫一次，待豚鼠初發(fā)感染癥狀消退后用紫外燈照射豚鼠外陰10分鐘以誘發(fā)復(fù)發(fā)感染，觀察豚鼠復(fù)發(fā)情況，計算皮損指數(shù)。3、實驗結(jié)果預(yù)期給藥后對照組復(fù)發(fā)癥狀明顯，評分較大，各陽性組復(fù)發(fā)癥狀輕微，評分較小，本疫苗在豚鼠身上對復(fù)發(fā)型生殖器皰疹有一定的治療作用，可以減輕復(fù)發(fā)癥狀。
權(quán)利要求
1.一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因組中的UL43 UL47基因。
2.一種如權(quán)利要求I所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特征在于聯(lián)合敲除了其基因組中的UL43到UL47基因和其它復(fù)制或感染非必需基因片段；所述其它復(fù)制或感染非必需基因片段是US9到US12基因。
3.一種如權(quán)利要求I或2所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗的制備方法，其特征在于 步驟ー取皰疹患者的水泡液，分離鑒定出野生單純皰疹病毒II型； 步驟ニ 擴大培養(yǎng)后提取病毒完整基因組設(shè)計引物擴增出單純皰疹病毒II型病毒基因組的UL43基因左側(cè)700bp至2000bp的同源側(cè)翼序列和單純皰疹病毒II型病毒基因組的UL47基因右側(cè)700bp至2000bp的同源側(cè)翼序列； 步驟三將步驟ニ所述同源側(cè)翼序列和熒光蛋白基因克隆至PShuttle-CMV載體，使熒光蛋白基因位于同源側(cè)翼序列之間，再和單純皰疹病毒II型基因組共轉(zhuǎn)染至Veix)細(xì)胞中，進行同源重組； 步驟四在熒光顯微鏡下使用ー種或者聯(lián)合使用多種熒光蛋白基因作為標(biāo)記挑選出重組病毒；經(jīng)過空斑純化后可獲得單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗及其制備方法，在于敲除了其基因組中的UL43～UL47基因。采用取水泡較為明顯的口唇皰疹和生殖器皰疹患者的水泡液，分離鑒定出野生型HSV-1和HSV-2；擴大培養(yǎng)后提取病毒完整基因組；和含有熒光表達基因及擬定敲除的HSV基因左右兩側(cè)700bp至2000bp的同源側(cè)翼序列的穿梭載體共同轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞；在熒光顯微鏡下使用一種或者聯(lián)合使用多種熒光蛋白基因作為標(biāo)記挑選出重組病毒，經(jīng)過空斑純化后可獲得所需要的重組減毒活疫苗。本疫苗有效地誘導(dǎo)機體粘膜和體液免疫應(yīng)答，降低人群發(fā)病率；激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，有可能清除已感染病毒，控制皰疹的復(fù)發(fā)和傳播。
文檔編號A61P31/22GK102671193SQ20121015932
公開日2012年9月19日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者劉景偉 申請人:鄭州金森生物科技工程有限公司