專利名稱：流感病毒h1n1亞型神經(jīng)氨酸酶及其基因、其抑制劑篩選模型及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗流感病毒藥物篩選領(lǐng)域，具體涉及一種流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶及其基因并利用該酶構(gòu)建其抑制劑篩選模型及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感病毒長期以來一直嚴重威脅著人類的健康，近年來其H5m和Hmi亞型的相繼暴發(fā)加大了全世界對抗流感病毒藥物的需求。目前FDA許可的治療流感的藥物主要有四種金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)、奧司他韋(Oseltamivir)和扎那米韋(Zanamivir)。隨著耐藥病例的不斷增加，人類正面臨著流感病毒大規(guī)模爆發(fā)的嚴峻考驗，新型抗流感病毒藥物的研發(fā)勢在必行，這使得設(shè)計合成或從化合物庫中篩選新型神經(jīng)氨酸酶抑制劑成為當前研究的熱點和難點。在創(chuàng)制新藥的研究中，尋找和發(fā)現(xiàn)具有生物活性的先導(dǎo)化合物是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)之一，而對大量化合物進行活性篩選則是發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的主要手段和途徑。在目前流感病毒神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，·)抑制劑的多種篩選模型中，神經(jīng)氨酸酶主要由全病毒制備，制備過程比較繁瑣耗時，并存在安全問題。分子水平的藥物篩選模型具有材料用量少、藥物作用機制比較明確、可實現(xiàn)大規(guī)模的篩選等特點，已經(jīng)成為目前藥物篩選的主要方法。到目前為止，國內(nèi)外尚無利用畢赤酵母表達的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶構(gòu)建的模型大規(guī)模篩選抗流感病毒藥物得報道。異源表達是獲得靶點蛋白的一個有效途徑，相對于哺乳動物和昆蟲細胞表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達系統(tǒng)操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達量高、成本低；具有aox強啟動子，外源蛋白受甲醇嚴格誘導(dǎo)調(diào)控而表達；具有后修飾能力，可以對表達蛋白進行糖基化、蛋白磷酸化、折疊、信號序列加工、脂類酰化等一系列的后修飾，從而使其表達的蛋白具有生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的流感病毒Hmi亞型神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型中使用的神經(jīng)氨酸酶制備繁瑣耗時，并存在安全問題的不足，而提供一種甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶及其基因和制備方法，以及流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第一方面是提供一種甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶基因，其核苷酸序列是以下任何的一種1)序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明中，SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的神經(jīng)氨酸酶基因的核酸序列全長1407bp，編碼469個氨基酸，所用密碼子有利于NA基因在畢赤酵母中表達。
本發(fā)明中，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的蛋白為去除了全長NA蛋白N端的82個氨基酸，是截短NA。本發(fā)明的第二方面是提供含有如上所述的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶基因的重組載體。所述的重組載體的所用的載體是本領(lǐng)域的常規(guī)載體，優(yōu)選載體PPICZ α A。本發(fā)明的第三方面是提供含有如上所述的重組載體的轉(zhuǎn)化子。所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細胞是本領(lǐng)域常規(guī)的宿主細胞，優(yōu)選畢赤酵母，更優(yōu)選畢赤酵母ΚΜ71或者SMDl 168表達菌株。本發(fā)明的第四方面是提供一種重組的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。其為去除了 NA全長基因N端的82個氨基酸，是截短ΝΑ，具有神經(jīng)氨酸酶生物活性。本發(fā)明的第五方面是提供一種制備分泌表達甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌的方法，包括以下步驟1)合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的神經(jīng)氨酸酶基因；2)將神經(jīng)氨酸酶基因克隆入酵母表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母表達菌株獲得重組畢赤酵母，即得表達神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌。本發(fā)明中，步驟1)所述的神經(jīng)氨酸酶基因的合成方法可以常規(guī)方法，可以人工合成全長基因。步驟幻所述的神經(jīng)氨酸酶基因可以是步驟1)合成的經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的神經(jīng)氨酸酶基因，也可以以序列表中SEQ ID No. 1所示的神經(jīng)氨酸酶基因為模板，利用引物擴增擴增獲得截短的僅含有功能區(qū)域，去除了可能與催化活性無關(guān)區(qū)域的神經(jīng)氨酸酶基因，較佳的是利用引物擴增獲得編碼氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神經(jīng)氨酸酶基因；所述的利用引物擴增獲得截短的神經(jīng)氨酸酶基因的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，以步驟1)所合成的神經(jīng)氨酸酶基因為模板擴增得到編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神經(jīng)氨酸酶基因。所述的引物較佳的是上游引物NA_F的序列為5，-GCCTCGAGAAAAGAGTTAAGTTGGCTGG-3，(如序列表中 SEQ ID No. 3 所示)，下游引物 NA_R 的序列為 5 ’ -GCTCTAGACCCTTGTCAATGGTGAATGG-3 ’(如序列表中SEQ ID似.4所示)，分別具有》!01和)0^1酶切位點。所述的酵母表達載體較佳的是質(zhì)粒PPICZ α Α。所述的畢赤酵母表達菌株較佳的是畢赤酵母KM71或者SMD1168。KM71或者SMD1168兩種重組子表達的截短NA分泌至胞外時均經(jīng)Kex2切割而具有天然的N端序列，無額外增加的氨基酸。所述的將截短的神經(jīng)氨酸酶基因克隆入酵母表達載體的克隆方法是本領(lǐng)域常規(guī)方法。較佳的，如上利用引物NA_F和NA_R擴增獲得截短NA基因，通過BioI和^CbaI酶切位點構(gòu)建含有截短NA基因的重組載體pPICZ α A-NAS,然后用電轉(zhuǎn)化法將McI酶切線性化的pPICZ α A-NAS導(dǎo)入畢赤酵母中，利用kocin 抗性篩選重組菌株，最后誘導(dǎo)重組畢赤酵母分泌表達截短NA。本發(fā)明的第六方面是提供如上所述的方法制備得到的分泌表達甲型流感病毒HlNl亞型的神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌。本發(fā)明的第七方面是提供如上所述的重組的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶在神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型中的應(yīng)用。本發(fā)明的第八方面是提供一種神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟將所述的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶基因克隆入酵母表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母表達菌株獲得重組畢赤酵母，即獲得分泌表達甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌，培養(yǎng)后得到具有生物活性的神經(jīng)氨酸酶，在反應(yīng)體系中加入該截短神經(jīng)氨酸酶、底物4-MUNANA和待篩選的抑制劑，溫育后在360nm的激發(fā)光和460nm的發(fā)射光下檢測熒光強度的變化。其中，獲得分泌表達甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌的較佳方法如上文所述，即所述的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶基因的核苷酸序列是以下任何的一種1)序列表中SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，幻編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列；所述的畢赤酵母優(yōu)選畢赤酵母KM71或者 SMD1168 表達菌株。而化合物 4-MUNANAG-methylumbelliferyl-N-acetyl- α -D_neuralminic acid)是神經(jīng)氨酸酶的特異性底物，在神經(jīng)氨酸酶作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物4-MU(4-methylumbelliferone)被360nm照射光激發(fā)可以產(chǎn)生460nm熒光，熒光強度的變化可以靈敏地反應(yīng)神經(jīng)氨酸酶活性。本發(fā)明優(yōu)化神經(jīng)氨酸酶的酶量、底物濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)體系PH值、鈣離子濃度和反應(yīng)溫度等條件，從而建立一種神經(jīng)氨酸酶抑制劑的高通量篩選模型。較佳的所述的反應(yīng)體系為32. 5mM pH6. 5 MES緩沖液，4mM CaCl2 ；底物較佳的為100 μ M4-MUNANA ；溫育溫度較佳的是37°C。本發(fā)明中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明用畢赤酵母分泌表達甲型流感病毒Hmi亞型神經(jīng)氨酸酶，獲得了具有生物活性的神經(jīng)氨酸酶，避免了繁瑣耗時且存在安全問題的由全病毒制備NA的操作過程。特別的是去除了 NA全長序列N端的82個氨基酸的截短神經(jīng)氨酸酶，截短的基因僅含有功能區(qū)域，去除了可能與催化活性無關(guān)的部分，蛋白的分泌表達效率高。本發(fā)明還利用該酶構(gòu)建甲型流感病毒Hmi亞型神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型，具有藥物作用機制明確、材料用量少、篩選速度快、靈敏度高、可實現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1為擴增截短NA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，1、2 截短NA基因(引物NA_F 和 NA_R) ,3,4 截短 NA 基因(引物 NA_F2 和 NA_R2)，M 分子量 Marker DL2000。圖2為重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖，其中，M 分子量Marker DL2000,1 未酶切的重組質(zhì)粒 pPICZ α A-NAS, 2 經(jīng) Xho I 和 Xba I 雙酶切的 pPICZ α A-NAS, 3 經(jīng) EcoR I 和 NotI 雙酶切的 pPICZ α A-NAS2。圖3為重組菌株誘導(dǎo)發(fā)酵上清液的酶活測定結(jié)果，其中，1 空載體pPICZ α A轉(zhuǎn)化KM71的重組菌株，2 4 重組質(zhì)粒pPICZ α A-NAS轉(zhuǎn)化ΚΜ71的重組菌株，5 7 重組質(zhì)粒pPICZ α A-NAS2轉(zhuǎn)化ΚΜ71的重組菌株，8 10 重組質(zhì)粒pPICZ α A-NA轉(zhuǎn)化ΚΜ71的重組菌株，11 空載體pPICZ α A轉(zhuǎn)化SMDl 168的重組菌株，12 14 重組質(zhì)粒pPICZ α A-NAS轉(zhuǎn)化SMDl 168的重組菌株，15 17 重組質(zhì)粒pPICZ α A-NAS2轉(zhuǎn)化SMDl 168的重組菌株，18 20 重組質(zhì)粒pPICZ α A-NA轉(zhuǎn)化SMDl 168的重組菌株。圖4為奧司他韋、扎納米韋、金剛烷胺和金剛乙胺對截短NA的抑制實驗結(jié)果。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。 實施例1重組質(zhì)粒pPICZ α A-NAS的構(gòu)建1)從NCBI網(wǎng)站獲得2009年4月至2010年3月報道的16 條甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶氨基酸序列，經(jīng)CluxtalX軟件比對分析后，選取最有代表性的病毒株A/ffisconsin/629-S0247/2009 (HlNl) (GenBank :CY051377)作為研究對象，該基因的核酸全長為1407bp，編碼469個氨基酸。根據(jù)畢赤酵母的表達習(xí)慣將該基因進行密碼子優(yōu)化，密碼子優(yōu)化的NA全長基因的序列見序列表SEQ ID NO. 1所示。對優(yōu)化后的基因采用化學(xué)合成的方法進行全基因合成，把合成的全長基因連接到克隆載體PUC57上得克隆載體PUC57-NA，序列測定驗證完全正確(委托上海閃晶生物合成)。2)設(shè)計用于PCR擴增截短NA基因的引物，上游弓丨物NA_F5，-GCCTCGAGAAAAGAGTTAAGTTGGCTGG-3，(如序列表中 SEQ ID No. 3 所示)，下游引物NA_R 5，-GCTCTAGACCCTTGTCAATGGTGAATGG-3，(如序列表中SEQ ID No. 4所示)，該截短NA基因去除了其N端的82個氨基酸的編碼序列，截短NA基因編碼的氨基酸序列見SEQ ID NO. 2。3)以含有密碼子優(yōu)化的全長NA基因的克隆載體PUC57-NA為模板，利用引物NA_F和NA_R在LA Taq(TaKaRa)的催化下進行PCR擴增，獲得1. 2kb的截短NA基因片段。擴增的程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸1. 5min，共30個循環(huán)；72°C再延伸lOmin)，擴增結(jié)果如圖1所示。4)用B10I和^CbaI分別對擴增的截短NA基因片段和畢赤酵母表達載體pPICZciA(購自Invitrogen)進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用T4連接酶(TaKaRa)于16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α并涂布于含有25mg/L kocin 的低鹽LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12 16h。5)挑取抗性平板上生長的單菌落10個接種5mL含有25mg/L zeocin 的低鹽LB液體培養(yǎng)基，200rpm 37°C條件下過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以BioI和^CbaI進行雙酶切鑒定，得到含有截短NA基因的重組質(zhì)粒pPICZ α A-NAS,對酶切正確的質(zhì)粒進行測序，酶切電泳結(jié)果如圖2所示。實施例2重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建及截短NA的誘導(dǎo)表達1)制備ΚΜ71和SMDl 168感受態(tài)，具體步驟包括a.挑取30 °C下YPD平板生長的KM71 (購自hvitrogen)和SMDl 168 (購自Invitrogen)單菌落，接種20mL YPD液體培養(yǎng)基250rpm 30°C過夜培養(yǎng)。b.取0. 1 0. 5mL過夜培養(yǎng)物，接種含有500mL新鮮培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜培養(yǎng)至 0D600 = 1. 3 1. 5.c.在4°C下，1500g離心5min收集細胞，用500mL預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞。d.如上離心，用250mL預(yù)冷的滅菌水懸浮細胞。
e.如上離心，用20mL預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細胞。f.如上離心，用ImL預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細胞，至終體積約1. 5mL。2)線性化pPICZ α A-NAS電轉(zhuǎn)化ΚΜ71和SMDl 168，具體步驟包括a.用McI對表達載體pPICZ α A-NAS進行線性化，線性化片段經(jīng)乙醇沉淀回收。b.混合80 μ L感受態(tài)細胞和約10 μ g線性化的pPICZ α A-NAS片段并轉(zhuǎn)移至0°C預(yù)冷的0. 2cm電擊杯，冰上靜置5min。c.根據(jù)BioRad電轉(zhuǎn)化儀操作手冊電轉(zhuǎn)化，電擊參數(shù)為電壓2. 5KV，電阻200 Ω，電容20kF。d.電擊結(jié)束后立刻加入ImL冰冷IM山梨醇至電擊杯并轉(zhuǎn)移至離心管中。e.將離心管靜置于30°C溫育60 90min。f.以100-30(^17平板涂布于10011^/1 Zeocin YPDS平板，30°C培養(yǎng)至單菌落形成。3)利用引物 5，AOXl (5，-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3，)禾Π 3，AOXl (5，-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ )進行菌落PCR鑒定，菌落PCR的模板為經(jīng)凍融法處理的菌體，擴增條件為:94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸3min，共30個循環(huán)；72°C再延伸 IOmin04)分別挑取PCR鑒定且測序正確的單菌落，接種于25mL BMGY培養(yǎng)基中，在280C 250rpm的搖床中用500mL三角瓶進行培養(yǎng)，直至細胞濃度達到0D600 = 2 6。室溫4000rpm條件下離心5min，收集細胞，倒掉上清后用20mL BMMY培養(yǎng)基重懸細胞，280C 250rpm下誘導(dǎo)表達，每24h加甲醇至終濃度為0. 5 %繼續(xù)誘導(dǎo)，分別在Mh，48h，72h和96h取樣。實施例3NA活性測定及抑制實驗0. 5%甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母分泌表達截短NA，誘導(dǎo)表達96h的菌液在12000rpm下離心5min，取上清液做為粗酶液用于NA活性測定實驗，同時利用超濾濃縮離心管將粗酶液濃縮約10倍，用于奧司他韋、扎納米韋、金剛烷胺和金剛乙胺對截短NA的抑制實驗，實驗儀器為BioTek多功能酶標儀和96孔黑色酶標板。NA活性測定取30 μ 1發(fā)酵上清液，加入75 μ 1反應(yīng)底物(終濃度為32. 5mM MES緩沖液，pH6. 5，4mM CaCl2,100 μ M底物4-MUNANA)，動力法在360nm的激發(fā)光和460nm的發(fā)射光下檢測熒光強度的變化。以倍比稀釋至適當濃度的4-MU做為標準品繪制標準曲線用于定量截短NA的酶活性，一個單位的酶活定義為37°C下每分鐘催化底物4-MUNANA生成一微摩爾4-MU的酶量?；钚詼y定結(jié)果如圖3所示。奧司他韋、扎納米韋、金剛烷胺和金剛乙胺抑制實驗將四種試劑用水倍比稀釋，取15 μ 1，加入30 μ 1 NA粗酶液，75 μ 1反應(yīng)底物，37°C下反應(yīng)30min，混勻后在360nm的激發(fā)光和460nm的發(fā)射光下檢測熒光強度。抑制實驗結(jié)果如圖4所示。實施例4 (對比例)重組載體pPICZ α A-NAS2的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及截短NAS2的活性測定1)設(shè)計引物(上游引物 NA_F2 5，~GCGAATTCGTTAAGTTGGCTGGTAACTCC~3‘和下游引物 NA_R25，-AATGCGGCCGCCTTGTCAATGGTGAATG-3‘)用于 PCR 擴增截短 NAS2 基因，該截短NAS2基因同樣去除了神經(jīng)氨酸酶N端的82個氨基酸，酶切位點分別為EcoR I和Not 1(下劃線處)。由于采用的酶切位點與實施例1不同，用此對引物擴增的產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母，重組子分泌表達的蛋白不具有天然的N端，會多出6個氨基酸(EAEAEF)，這6個氨基酸的存在直接導(dǎo)致表達的神經(jīng)氨酸酶沒有催化活性。2)以含有密碼子優(yōu)化的NA基因的克隆載體PUC57-NA為模板，利用引物NA_F2和NA_R2在LA Taq (TaKaRa)的催化下進行PCR擴增，獲得1. 2kb的截短NA基因片段。擴增的程序為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸1. 5min，共30個循環(huán)；72°C再延伸IOmin)，電泳結(jié)果如圖1所示。3)用EcoR I和Not I分別對擴增的截短NA基因片段和畢赤酵母表達載體pPICZ α A進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用Τ4連接酶(TaKaRa)于16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a并涂布于含有25mg/I^e0CinTM的低鹽LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng) 12 16h。4)挑取抗性平板上生長的單菌落10個接種5mL含有25mg/L zeocin 的低鹽LB液體培養(yǎng)基，200rpm 37°C條件下過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以EcoR I和Not I進行雙酶切鑒定，得到含有截短NA基因的重組質(zhì)粒pPICZ a A-NAS2，對酶切正確的質(zhì)粒進行測序。5)重組質(zhì)粒pPICZ a A_NAS2轉(zhuǎn)化KM71和SMDl 168感受態(tài)，篩選重組菌株，培養(yǎng)并誘導(dǎo)重組菌株表達NAS2，測定NAS2活性，具體步驟同實施例1、2和3，活性測定結(jié)果如圖3所示。實施例5 (對比例)重組載體pPICZ a A-NA的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及全長NA的活性測定1)用EcoR I和Not I分別對含有密碼子優(yōu)化的全長NA基因的克隆載體pUC57_NA和畢赤酵母表達載體pPICZ a A進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用T4連接酶(TaKaRa)于16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5a并涂布于含有25mg/L kocin 的低鹽LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12 16h。2)挑取抗性平板上生長的單菌落10個接種5mL含有25mg/L zeocin 的低鹽LB液體培養(yǎng)基，200rpm 37°C條件下過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以EcoR I和Not I進行雙酶切鑒定，得到含有截短NA基因的重組質(zhì)粒pPICZ a A_NA，對酶切正確的質(zhì)粒進行測序。3)重組質(zhì)粒pPICZ a A-NA轉(zhuǎn)化KM71和SMDl 168感受態(tài)，篩選重組菌株，培養(yǎng)并誘導(dǎo)重組菌株表達全長NA，測定NA活性，具體步驟同實施例1、2和3，活性測定結(jié)果如圖3所
權(quán)利要求
1.一種甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶基因，其特征在于，其核苷酸序列是以下的任何一種1)序列表中SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)編碼氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。
2.含有如權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶基因的重組載體。
3.含有如權(quán)利要求2所述的重組載體的轉(zhuǎn)化子。
4.一種重組的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶，其特征在于，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。
5.一種制備分泌表達甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步驟1)合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如序列表中SEQID No. 1所示的神經(jīng)氨酸酶基因；2)將神經(jīng)氨酸酶基因克隆入酵母表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母表達菌株獲得重組畢赤酵母，即得表達神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟幻所述的神經(jīng)氨酸酶基因是以序列表中SEQ ID No. 1所示的神經(jīng)氨酸酶基因為模板，利用引物擴增獲得編碼氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的截短的神經(jīng)氨酸酶基因；所述的引物是上游引物NA_F的序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，下游引物NA_R的序列如序列表中SEQ ID No. 4所示；所述的酵母表達載體是質(zhì)粒PPICZ α A ；所述的畢赤酵母表達菌株是畢赤酵母KM71或者SMDl168。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法制備得到的分泌表達甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌。
8.如權(quán)利要求2所述的重組的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶在神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型中的應(yīng)用。
9.一種神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟將如權(quán)利要求1所述的甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶基因克隆入酵母表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母表達菌株獲得重組畢赤酵母，即獲得分泌表達甲型流感病毒Hmi亞型的神經(jīng)氨酸酶的基因工程菌，培養(yǎng)后得到具有生物活性的神經(jīng)氨酸酶，在反應(yīng)體系中加入該截短神經(jīng)氨酸酶、底物4-MUNANA和待篩選的抑制劑，溫育后在360nm的激發(fā)光和460nm的發(fā)射光下檢測熒光強度的變化。
10.權(quán)利要求9所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的反應(yīng)體系為32.5mM pH6. 5MES緩沖液，4mM CaCl2 ；底物為100 μ M 4-MUNANA ；溫育溫度是37°C。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)及其基因和制備方法，以及流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選模型的構(gòu)建方法。尤其用畢赤酵母分泌表達甲型流感病毒H1N1亞型神經(jīng)氨酸酶，獲得了具有生物活性的神經(jīng)氨酸酶，特別的是去除了NA全長序列N端的82個氨基酸的截短神經(jīng)氨酸酶，避免了繁瑣耗時且存在安全問題的由全病毒制備NA的操作過程。本發(fā)明還利用該酶構(gòu)建甲型流感病毒H1N1亞型神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型，具有藥物作用機制明確、材料用量少、篩選速度快、靈敏度高、可實現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)點。
文檔編號C12N1/19GK102586295SQ201110002029
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者朱寶泉, 林軍, 胡又佳, 胡海峰 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院