專利名稱：涉及編碼蛋白酪氨酸磷酸酶的基因的耐旱植物以及相關(guān)的構(gòu)建體和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物育種和基因?qū)W，并且具體地講涉及用于賦予植物抗旱性的 重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
非生物脅迫是世界范圍內(nèi)農(nóng)作物損失的主要因素，它引起主要農(nóng)作物平均超過 50% 的產(chǎn)量損失(Boyer，J.S. (1982) Science 218 443-448 ； Bray，E.A.等人(2000)， In Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Buchannan, B.B.等人編輯，Amer.Soc. Plant Biol.,第1158-1249頁)。在不同的非生物脅迫中，干旱是世界范圍內(nèi)限制農(nóng)作物 產(chǎn)量的主要因素。植物在不同發(fā)育階段暴露于水限制環(huán)境下似乎啟動多個生理和發(fā)育變 化。理解干旱脅迫的基本生物化學(xué)和分子機(jī)制，轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐受性是生物學(xué)中的主要挑戰(zhàn)。 已經(jīng)公布了非生物脅迫響應(yīng)和干旱脅迫耐受性的遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制的回顧(Valliyodan，B.和 Nguyen, H.T., (2006) Curr.Opin.Plant Biol.9 189-195； Wang, W.等人(2003) Planta 218 1-14) ； Vinocur，B.和 Altman, A. (2005) Curr.Opin.Biotechnol. 16 123-132; Chaves, M.M.禾Π Oliveira, Μ.Μ. (2004) J.Exp.Bot.55 2365-2384; Shinozaki, K.等 人(2003) Curr.Opin.Plant Biol.6 410-417; Yamaguchi-Shinozaki, K.禾Π Shinozaki, K. (2005) Trends Plant Sci.10 88-94)。通過差異和/或差減分析已經(jīng)完成了較早的對非生物脅迫分子方面的 研究工作(Bray，E.A. (1993) Plant Physiol.103 1035-1040 ； Shinozaki，K.和 Yamaguchi-Shinozaki，K. (1997) Plant Physiol. 115 327-334; Zhu, J._K.等人(1997) Crit. Rev.Plant Sci.16 253-277 ； Thomashow, M.F. (1999) Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.50: 571-599)。其他方法包括選擇候選基因并分析此類基因或其活性產(chǎn)物在脅迫下 的表達(dá)，或者通過在確切定義的脅迫體系中的功能互補(bǔ)(Xiong，L.和Zhu，J-K. (2001) PhysiologiaPlantaram 112 152-166)。此外，已經(jīng)使用涉及鑒定并分離調(diào)控基因的突變 的正向和反向基因研究提供用于在脅迫或暴露條件下的基因表達(dá)中觀察到的改變的證據(jù) (Xiong, L.和 Zhu，J.-K. (2001) Physiologia Plantaram 112 152-166)?？衫眉せ顦?biāo)記來鑒定能影響性狀的基因。已經(jīng)在模型植物擬南芥屬中使用該 方法(Weigel，D.等人(2000) Plant Physiol. 122 1003-1013)。插入轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件能夠 顯著激活和/或提高附近內(nèi)源基因的表達(dá)?？墒褂迷摲椒ㄟx擇涉及在農(nóng)學(xué)上重要的表型 (包括脅迫耐受性)中涉及的基因。發(fā)明概述本發(fā)明包括
在一個實(shí)施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，該重組DNA構(gòu) 建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所 述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ IDNO : 15、17、19、21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49和50進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組 DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。在另一個實(shí)施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，該重組DNA 構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽， 所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ IDNO 15、17、19、21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49和50進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組 DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。任選地，在水限制 條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種 農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物，其中所述植物是玉米植 物或大豆植物。在另一個實(shí)施方案中，增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構(gòu)建體弓I入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一 種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、33、34、 35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50% 的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述 轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；并且(c)獲得源自步驟(b)的所述 轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，并 且在與不包含所述DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。在另一個實(shí)施方案中，評估植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構(gòu)建體弓I入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一 種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、33、34、 35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50% 的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述 轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代 植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評價該子代植物 在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱性。在另一個實(shí)施方案中，測定植物至少一種農(nóng)學(xué)特征改變的方法，所述方法包 括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可 操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn) 基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(C)獲得源自 該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及 (d)測定該子代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一 種農(nóng)學(xué)特性的改變。任選地，所述測定步驟(d)包括測定所述轉(zhuǎn)基因植物在水限制條件 下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的 改變。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何方法，其中所述植物是玉米植 物或大豆植物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包 括(a)編碼具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列，或者(b)所述核苷酸序列 的全長互補(bǔ)序列，其中所述多肽的氨基酸序列在與SEQ ID NO: 25、37、40或41進(jìn)行比 較時具有至少90%的序列同一性，或者在與SEQ ID NO: 21或39進(jìn)行比較時具有至少 93%的序列同一性，或者所述氨基酸序列包含SEQ ID NO : 17、34、43或44 ；其中所述 全長互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補(bǔ)的。所述多肽 可包含 SEQ ID NO: 17、21、25、34、36、37、40、41、43 或 44 的氨基酸序列。所述 核苷酸序列可包含SEQ IDNO : 16、20、24、39或42的核苷酸序列。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含任何本發(fā)明的分離的多核苷酸的重組 DNA構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸可操作地連接至少一種調(diào)控序列，并且涉及包含重組 DNA構(gòu)建體的細(xì)胞、植物、和種子。附圖簡述和序列表根據(jù)以下的發(fā)明詳述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的發(fā)明 詳述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。圖 1A-1C 給出了如 SEQIDNO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、40、
43、45和46所示的蛋白酪氨酸磷酸酶的氨基酸序列的比對。在框中包括了在給定位點(diǎn) 與SEQ ID NO: 15的殘基相同的殘基。給出了共有序列，其中如果殘基在所有序列中相 同，它被示出，否則示出句號。圖2給出


圖1A-1C中給出的每對序列的序列同一性百分比和趨異值。圖 3 給出了如 SEQ ID NO 33，34、35、36、37、38、41、44、47、48、49 禾口 50所示的潛在細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸磷酸酶的每對序列的序列同一性百分比和趨異值。圖4A-4B示出對用PHP30853轉(zhuǎn)化的單個Gaspe Flint來源的玉米品系的評估。圖5A-5B示出對用PHP30853轉(zhuǎn)化的Gaspe Flint來源的玉米品系的綜合評估。SEQ ID NO 1是用于制備擬南芥屬種群的pHSbarENDs2活化標(biāo)記載體的核苷 酸序列。SEQ ID NO 2 是Gateway 供體載體 pDONR /Zeo 的核苷酸序列。attPl 位
點(diǎn)位于核苷酸570-801 ； attP2位點(diǎn)位于核苷酸2754-2985 (互補(bǔ)鏈)。SEQ ID NO 3是Gateway 供體載體pDONR 221的核苷酸序列。attPl位點(diǎn) 位于核苷酸570-801 ； attP2位點(diǎn)位于核苷酸2754-2985 (互補(bǔ)鏈)。SEQIDNO: 4是pBC-yellow的核苷酸序列，pBC-yellow是用于擬南芥屬的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸11276-11399(互補(bǔ)鏈)；attR2位點(diǎn)位于核苷酸 9695-9819 (互補(bǔ)鏈)。 SEQ ID NO 5是PHP27840的核苷酸序列，PHP27840是用于大豆的目的載體。
attRl位點(diǎn)位于核苷酸7310-7434 ； attR2位點(diǎn)位于核苷酸8890-9014。 SEQ ID NO 6 是 PHP23236 的核苷酸序列，PHP23236 是用于 GaspeFlint 來
源的玉米品系的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸2006-2130 ； attR2位點(diǎn)位于核苷酸
2899-3023。SEQ ID NO 7 是 PHP10523 的核苷酸序列(Komari 等人，Plant J.10
165-174(1996) ； NCBI 通用標(biāo)識符 59797027)。SEQ ID NO 8是PHP23235的核苷酸序列，PHP23235是用于構(gòu)建目的載體 PHP23236的載體，用于Gaspe Flint來源的品系。SEQ ID NO 9是PHP28647的核苷酸序列，PHP28647是用于玉米自交來源品 系的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸2289-2413 ； attR2位點(diǎn)位于核苷酸3869-3993。SEQ ID NO 10是attBl位點(diǎn)的核苷酸序列。SEQ ID NO 11是attB2位點(diǎn)的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是At3g44620_5，attB正向引物的核苷酸序列，包含attBl序 列，用于擴(kuò)增一部分At3g44620蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO 13是At3g44620_3，attB反向引物的核苷酸序列，包含attB2序 列，用于擴(kuò)增一部分At3g44620蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO 14對應(yīng)于編碼擬南芥屬蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白的核苷酸序列(基 因座 At3g44620)。SEQ ID NO 15 對應(yīng)于 NCBI GI No.79432726，它是由 SEQ ID NO 14 編碼的
擬南芥屬蛋白酪氨酸磷酸酶的氨基酸序列。^ 1編石馬g白酪氨,||磷的CDNA植物克隆命名*SEQ ID NO:SEQ ID NO:(核苷酸)(氨基酸)玉米cielc.pk001.nl3 (FIS)1617大豆重疊群1819sll.pk0004.cl2 ( FIS ) &GI No. 17401417大豆sdrlf.pk003.cl (FIS)2021大豆嵌合基因2223SEQ ID NO: 18 的 nt 6-26 &SEQ ID N0:20 的 nt 3-707糖用甜菜ebslc.pk003.kl4 (FIS)2425野莧菜easlc.pk002.d7 (FIS)3940葡萄重疊群4243vmblna.pk001.i3 (FIS)；vdblc.pk011.h24 (EST)*將完整的cDNA插入序列稱為“全長插入序列”(“FIS”)。SEQIDNO 26對應(yīng)于NCBI GI Νο.29367340，它是編碼來自大米的蛋白酪氨酸
磷酸酶樣蛋白的cDNA片段的核苷酸序列。SEQ ID NO 27 對應(yīng)于 NCBI GI Νο.29367341，它是由 SEQ ID NO 26 編碼的
大米蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 28 是在美國專利公布 US20040214272 的 SEQ IDNO 366863 中示
出的氨基酸序列，它對應(yīng)于玉米蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白。SEQ ID NO 29 是在美國專利公布 US20040031072-A1 的 SEQ IDNO 277487
中示出的氨基酸序列，它對應(yīng)于大豆蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白。SEQ ID NO 30是VC062引物的核苷酸序列，它包含Τ3啟動子和attBl位點(diǎn)， 用于擴(kuò)增克隆進(jìn)Bluescript IISK⑴載體(Stratagene)的cDNA插入序列。SEQ ID NO 31是VC063引物的核苷酸序列，它包含T7啟動子和attB2位點(diǎn)， 用于擴(kuò)增克隆進(jìn)Bluescript IISK⑴載體(Stratagene)的cDNA插入序列。SEQ ID NO 32是入門克隆PHP33257的核苷酸序列，并且包含來自cDNA克隆 cielc.pk001.nl3的玉米蛋白酪氨酸磷酸酶的編碼區(qū)。SEQ ID NO 33 對應(yīng)于 SEQ ID NO 15 的氨基酸 63-239。SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO
34對應(yīng)于SEQ ID NO 35對應(yīng)于SEQ ID NO 36對應(yīng)于SEQ ID NO
17的氨基酸89-274。 19的氨基酸59-240。 21的氨基酸54-235。
SEQ ID NO 37 對應(yīng)于 SEQ ID NO 25 的氨基酸 77-255。SEQ ID NO 38 對應(yīng)于 SEQ ID NO 27 的氨基酸 84-268。SEQ ID NO 41 對應(yīng)于 SEQ ID NO 40 的氨基酸 41-219。SEQ ID NO 44 對應(yīng)于 SEQ ID NO 43 的氨基酸 65-246。SEQ ID NO 45對應(yīng)于NCBI GI No.225436307,它是葡萄蛋白酪氨酸磷酸酶樣 蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 46對應(yīng)于來自美國專利公開7214786的SEQ IDNO 112865，它是 小麥蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 47 對應(yīng)于 SEQ ID NO 45 的氨基酸 65-246。SEQ ID NO 48 對應(yīng)于 SEQ ID NO 46 的氨基酸 81-265。SEQ ID NO 49 對應(yīng)于 SEQ ID NO 28 的氨基酸 89-274。SEQ ID NO 50 對應(yīng)于 SEQ ID NO 29 的氨基酸 59-240。序列描述以及關(guān)聯(lián)的序列表遵循如37 C.F.R. § 1.821-1.825中所列出的管理專利 申請中的核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)則。序列表包含核苷酸序列字符的單字母碼以及氨基酸的三字母碼，如遵照 IUPAC-IUBMB 標(biāo)準(zhǔn)所定義的，該標(biāo)準(zhǔn)在 Nucleic Acids Res. 13 3021-3030(1985)以及在 Biochemical J.219 (No.2) 345-373(1984)中有所描述，這兩篇文獻(xiàn)以引用的方式并入本 文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C.F.R. § 1.822中列出的規(guī)則。 發(fā)明詳述
本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容的全文均以引用的方式并入本文。 如本文所用的并在所附權(quán)利要求書中的單數(shù)形式“一個”和“所述”包括復(fù)數(shù) 除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株該類 “一個細(xì)胞”的涵義包括一個或多個細(xì)胞及其本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物，
如本文所用
蛋白酪氨酸磷酸酶(“PTP”或“PTPase”)屬于一類從蛋白的磷酸化的酪氨 酸殘基上除去磷酸基團(tuán)的酶。包括蛋白酪氨酸磷酸酶的植物蛋白磷酸酶已經(jīng)由Luan(2003 Annual Rev.Plant Biol.54 63-92)描述。除非另外指明，“擬南芥屬”和“擬南芥”本文互換使用?！氨磉_(dá)序列標(biāo)簽”(“EST”)是得自cDNA文庫的DNA序列，并且因此是已 經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的序列。EST通常通過cDNA插入序列單程測序獲取。將完整的cDNA插入序 列稱為“全長插入序列”(“FIS”)。 “重疊群”序列是由選自但不限于EST、FIS和 PCR序列的兩個或更多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為“完 全基因序列”(“CGS”)，該序列可得自FIS或重疊群?！稗r(nóng)學(xué)特性”是可測量的參數(shù)，包括但不限于綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物 量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮 量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種 子游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、 種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、在低溫脅迫下的早期幼苗活力和幼苗出苗率?！稗D(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的 任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以 及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn) 基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重 組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組 或染色體外基因組)改變?！盎蚪M”在用于植物細(xì)胞時不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體DNA，而且還 包括存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(如線粒體、質(zhì)粒)中的細(xì)胞器DNA。“植物”包括整個植株、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及同一植株 的子代。植物細(xì)胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細(xì)胞種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū) 域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。“子代”包括植物的任何后續(xù)世代。“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷 酸被穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨(dú) 地或作為重組DNA構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。針對序列而言的“異源”意指來自外來物種的序列，或者如果來自相同物種， 則指通過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列?！岸嗪塑账帷薄ⅰ昂怂嵝蛄小薄ⅰ昂塑账嵝蛄小被颉昂怂崞巍笨苫Q使用 并且是任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合 物。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)通過如下它們的單個字母名稱來指 代“A”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對應(yīng)RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧 胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，
“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)， “K”表示G或T，“H”表示 A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨 基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基 酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“多 肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾形式，包括但不限于糖基 化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥化和ADP-核糖基化?！靶攀筊NA(mRNA) ”指無內(nèi)含子并且可通過細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！癱DNA”指與mRNA模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。 cDNA可為單鏈的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式?！俺墒臁钡鞍踪|(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級翻譯產(chǎn)物中 的任何前肽或原肽的多肽?！扒绑w”蛋白質(zhì)指mRNA的翻譯初級產(chǎn)物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前 肽和原肽可為并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號?！胺蛛x的”指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán) 境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在的宿主細(xì)胞中純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于 獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸?！爸亟M體”指(例如)通過化學(xué)合成或者通過用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片 段來實(shí)現(xiàn)的兩個原本分離的序列片段的人工組合?！爸亟M體”也包括指已經(jīng)通過引入異 源核酸而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然 發(fā)生的事件(如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對細(xì)胞或載體的改變，例如沒有蓄意 人為干擾而發(fā)生的那些?！爸亟MDNA構(gòu)建體”指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因 此，重組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以 不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語“入門克隆”和“入門載體”本文可互換使用?！罢{(diào)控序列”指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編 碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。 調(diào)控序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。術(shù)語
“調(diào)控序列”和“調(diào)控元件”在本文中可互換使用?！皢幼印敝改軌蚩刂屏硪缓怂崞无D(zhuǎn)錄的核酸片段?！爸参飭幼庸δ堋笔悄軌蚩刂浦参锛?xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其是否來源 于植物細(xì)胞?！敖M織特異性啟動子”和“組織優(yōu)選啟動子”可互換使用，并且指主要但非必 須專一地在一種組織或器官中表達(dá)，而是也可在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。“發(fā)育調(diào)控啟動子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動子。術(shù)語“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個核酸片段的 功能受到另一個核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動子能夠調(diào)節(jié)核酸片段的轉(zhuǎn)錄時，該啟動 子與該核酸片段進(jìn)行了可操作地連接。“表達(dá)”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，核酸片段的表達(dá)可指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如 生成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)?！氨硇汀币庵讣?xì)胞或生物體的可檢測的特征。有關(guān)將核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的“導(dǎo)入”是指“轉(zhuǎn)染” 或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中 核酸片段可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)變成自主 的復(fù)制子或瞬時表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)?！稗D(zhuǎn)化細(xì)胞”是將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體)導(dǎo)入其中的任何細(xì)胞。本文所用的“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化兩者?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。 一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中?！八矔r轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的核中或包含DNA的細(xì)胞器中，引 起基因表達(dá)而沒有基因穩(wěn)定遺傳?！暗任换颉笔钦紦?jù)染色體上給定位點(diǎn)的基因的幾種供選擇形式的其中一種。 當(dāng)二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不 同，則該植物在該基因座處是雜合的。如果轉(zhuǎn)基因存在于二倍體植物中一對同源染色體 中的其中之一上，則該植物在該基因座處是半合子的。“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”是與蛋白協(xié)同翻譯并將蛋白導(dǎo)向葉綠體或在其中制備蛋白 的細(xì)胞中存在的其它質(zhì)體類型。“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)序列”指編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸 序列?！靶盘栯摹笔且环N與蛋白協(xié)同翻譯并將蛋白導(dǎo)向分泌器官體系的氨基酸序列 (Chrispeels, M. (1991) Ann.Rev.PlantPhys.Plant Mol.Biol.42 21-53)。如果將所述蛋白導(dǎo) 向液泡，可另外加上液泡靶向信號(同上)，或者如果將所述蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可加上內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)駐留信號(同上)。如果將蛋白導(dǎo)向細(xì)胞核，將移除任何存在的信號肽并用以核定位 信號替代(Raikhel (1992)Plant Phys. 100 : 1627-1632)。 “線粒體信號肽”是引導(dǎo)前體蛋 白進(jìn)入線粒體的氨基酸序列(Zhang 和 Glaser (2002) Trends Plant Sci 7 14-21)。序列比對和同一性百分比可用設(shè)計用于檢測同源序列的多種比較方法來測 定，這些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息計算包(DNASTAR Inc.， Madison, WI)的Megalign 程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用 Clustal V 比對方法(Higgins 和 Sharp, 1989，CABIOS.5 151-153)采用默認(rèn)參數(shù)(空位 罰分=10，空位長度罰分=10)執(zhí)行。用Clustal V方法進(jìn)行成對比對和蛋白質(zhì)序列的 同一性百分比計算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE = 1、空位罰分(GAP PENALTY) = 3、窗口 (WINDOW) = 5并且DIAGONALS SAVED = 5。而對于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE = 2，空位罰分=5，窗口 = 4并且DIAGONALS SAVED = 4。用Clustal V程序比對序列 后，可通過查看同一程序中的“序列距離”表來獲得“同一性百分比”和“趨異”值。 除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計算。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中 有更全面的描述Sambrook, J., Fritsch, E.F.禾口 Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual ； Cold Spring HarborLaboratory Press Cold Spring Harbor, 1989 (下文 稱為 “Sambrook”)?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)向?qū)嵤┓桨笇?shí)施方案包括分離的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重組DNA構(gòu)建體、包 含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的 方法。分離的多核苷酸和多肽本發(fā)明包括如下分離的多核苷酸和多肽分離的多核苷酸，其包括(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序 列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO: 17、21、25、34、36、37、40、41、43 或 44 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%的序列同一性；或者(ii)⑴的核酸序列的全 長互補(bǔ)序列，其中所述全長互補(bǔ)序列和ω的核酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補(bǔ)的。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括抑 制DNA構(gòu)建體)。所述多肽優(yōu)選地是蛋白酪氨酸磷酸酶。分離的多肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 17、21、25、34、36、37、40、41、43 或 44 進(jìn)行比較時具有至少 50 %、51%、 52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、 64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、 76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%, 95%、96%、97%、98%、99%、或 100 %的序列同一性。所述多肽優(yōu)選地是蛋白酪氨酸磷酸酶。分離的多核苷酸，其包括(i)基于Clustal V比對方法在與SEQ IDNO 16、 20、24、39 或 42 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%的序列同一性的核酸序列；或 (ii)(i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組 DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。分離的多核苷酸優(yōu)選地編碼蛋白酪氨酸磷酸酶。重組DNA構(gòu)津體和抑制DNA構(gòu)津體在一個方面，本發(fā)明包括重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。在一個實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列 (如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括ω核酸序列， 所述核酸序列編碼的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 17、21、25、 34、36、37、40、41、43 或 44 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100% 的序列同一性；或 (ii) G)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。在另一個實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列 (如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括ω核酸序列， 所述核酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO : 16、20、24、39或42進(jìn)行比較 時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性；或(ii) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。在另一個實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序 列(如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼蛋白酪氨酸 磷酸酶。蛋白酪氨酸磷酸酶可來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、煙豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)禾口 短絨野大豆 (Glycinetomentella)。在另一方面，本發(fā)明包括抑制DNA構(gòu)建體。抑制DNA構(gòu)建體可包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)， 該調(diào)控序列可操作地連接至(a)以下序列的全部或部分ω編碼多肽的核酸序列， 所述多肽具有的氨基酸序列基于ClustalV比對方法在與SEQ IDNO 17、21、25、34、 36、37、40、41、43 或 44進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、
8081 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100% 的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；或者(b)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的區(qū) 域，所述區(qū)域具有的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的有義鏈或反 義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、
8182 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān) 注的靶基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶；或(C)以下序列的全部或部分(i)核酸序列，所述 核酸序列基于ClustalV比對方法在與SEQ ID NO : 16、20、24、39或42進(jìn)行比較時具有 至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%%, 9、68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%, 99%或100%的序列同一性，或(ii) (c) (i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。抑制DNA 構(gòu)建體可包含共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、莖環(huán)抑 制構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體、RNAi構(gòu)建體或小RNA構(gòu)建體(如，siRNA構(gòu)建體 或miRNA構(gòu)建體)。應(yīng)當(dāng)理解(正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的)，本發(fā)明不僅僅涵蓋這些具體的示 例性序列。導(dǎo)致給定位點(diǎn)處產(chǎn)生化學(xué)上等價的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的 核酸片段中的改變是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一種疏水性氨基酸)的 密碼子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性較強(qiáng)的殘基(例如纈氨 酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似地，導(dǎo)致一個帶負(fù)電荷的殘基替換為另一 個帶負(fù)電荷的殘基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個 帶正電荷的殘基(例如，賴氨酸替換精氨酸)的改變也可預(yù)期產(chǎn)生功能上等價的產(chǎn)物。導(dǎo) 致多肽分子的N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化也將預(yù)計不會改變多肽的活性。 所提出的修飾中的每一種均完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，如測定所編碼的產(chǎn)物的生物活性 的保留?！耙种艱NA構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時，導(dǎo)致該植物中的靶基因“沉默”的重組DNA構(gòu)建體。對該植物來說，該靶基因可為內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因 的。如本文針對靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達(dá)的mRNA或蛋白質(zhì)/ 酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使 用的術(shù)語“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、減少、減退、減小、抑制、消 除或防止?！俺聊被颉盎虺聊辈淮_定機(jī)理并且包括但不限于反義、共抑制、病 毒_抑制、發(fā)夾抑制、莖_環(huán)抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA構(gòu)建體可包含源自所關(guān)注的靶基因的區(qū)域并且可包含所關(guān)注的靶基 因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決于所要利用的方法，該區(qū)域可 與所關(guān)注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100%相同或者具有少于100%同一性 的同一性(如，具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%, 96%, 97%, 98%,或 99%的同一性)。抑制DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域所熟知的，一旦選定所關(guān)注的靶基因就很容易構(gòu)建， 并且包括但不限于共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒-抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、 莖-環(huán)抑制構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體，以及更通常的是，RNAi (RNA干擾)構(gòu)建 體和小RNA構(gòu)建體，例如SiRNA(短干擾RNA)構(gòu)建體和miRNA(微RNA)構(gòu)建體?！胺戳x抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺?義RNA”指與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)，并阻斷分離的靶核酸片段表達(dá) 的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利號5,107,065)。反義RNA可與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分， 即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補(bǔ)。“共抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物?！坝?義” RNA指包括mRNA并且可在細(xì)胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。此前，已 通過著眼于以有義方向過表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列(其導(dǎo)致與過表達(dá)的 序列具有同源性的所有RNA減少)設(shè)計出了植物中的共抑制構(gòu)建體(參見Vaucheret等 人，Plant J., 16: 651-659(1998)；以及 Gura，Nature 404 804-808(2000))。另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導(dǎo)對近端mRNA編碼序列的抑制(于 1998年8月20日公開的PCT公開WO 98/36083)。RNA干擾是指由短干擾性RNA(SiRNA)介導(dǎo)的動物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉 默的過程(Fire等人，Nature 391 806 1998)。在植物中的對應(yīng)過程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因 沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也稱為阻抑作用(quelling)。據(jù)信轉(zhuǎn)錄后基因 沉默過程是用于防止外來基因表達(dá)的進(jìn)化保守性細(xì)胞防御機(jī)制，并且通常由不同植物區(qū) 系和門所共有(Fire 等人，Trends Genet. 15 358 (1999))。小RNA在控制基因表達(dá)中起重要作用。很多發(fā)育過程(包括開花)的調(diào)節(jié)是由 小RNA控制的。現(xiàn)在有可能通過使用在植物中產(chǎn)生小RNA的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體來以工程手 段改變植物基因的基因表達(dá)。小RNA似乎是通過與互補(bǔ)RNA或DNA靶序列堿基配對來行使功能的。當(dāng)與 RNA結(jié)合時，小RNA或者引發(fā)靶序列的RNA裂解或者引發(fā)翻譯抑制。當(dāng)與DNA靶序列結(jié)合時，據(jù)信小RNA可介導(dǎo)靶序列的DNA甲基化。無論具體機(jī)制是什么，這些事件 的后果是基因表達(dá)受到抑制。微RNA (miRNA)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經(jīng)在動物和植物中鑒 定出的非編碼 RNACLagos-Quintana 等人，Science2M 853-858 2001, Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12 735-739(2002) ； Lau 等人，Science 294 858-862(2001) ； Lee 和 Ambros, Science294 862-864(2001) ； Llave 等人，Plant Cell 14 1605-1619(2002)； Mourelatos 等人，Genes.Dev.16: 720-728 (2002) ； Park 等人，Curr.Biol.12 1484-1495(2002) ； Reinhart 等人，Genes.Dev.16 1616-1626(2002))。它們是由大小為 大約70至200nt的較長的前體轉(zhuǎn)錄物加工生成的，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物能夠形成穩(wěn)定的 發(fā)夾結(jié)構(gòu)。微RNA(miRNA)看起來通過與位于由這些基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物中的互補(bǔ)序列結(jié)合 來調(diào)節(jié)靶基因?？雌饋碛锌赡躮iRNA可進(jìn)入至少兩條靶基因調(diào)控途徑(1)翻譯抑制； 和(2) RNA裂解。進(jìn)入RNA裂解途徑的微RNA類似于在動物中的RNA干涉作用(RNAi) 和植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)期間生成的21-25nt的短干涉RNA(SiRNA)，并且可 能摻入了 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，該復(fù)合物與RNAi相似或相同。調(diào)控序列本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)可包含至少一種調(diào)控序列。調(diào)控序列可為啟動子。多種啟動子可用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體中?？筛鶕?jù)所需結(jié)果來選擇啟動 子，并且可包括用于在宿主生物體中表達(dá)的組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導(dǎo)型 啟動子或其他啟動子。一般將引起基因在多數(shù)細(xì)胞類型中在多數(shù)情況下表達(dá)的啟動子稱為“組成型啟 動子”。雖然候選基因當(dāng)通過組成型啟動子驅(qū)動表達(dá)時可預(yù)測其效應(yīng)，但候選基因在35S 或UBI啟動子控制下的高水平、組成型表達(dá)可具有多重效應(yīng)。使用組織特異和/或脅迫 特異啟動子可消除不需要的效應(yīng)但保留耐旱性的能力。在擬南芥屬中已經(jīng)觀察到了該效 應(yīng)(Kasuga 等人(1999) Nature Biotechnol. 17 287-91)；適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動子包括(例如)Rsyn7啟動子的核心啟動子和 在WO 99/43838和美國專利6,072,050中公開的其他組成型啟動子；CaMV 35S核心啟 動子(Odell 等人，Nature 313 810-812(1985))；稻肌動蛋白(McElroy 等人，Plant Cell 2 163-171(1990))；泛素啟動子(Christensen 等人，Plant Mol.Biol.12 619-632(1989) 和 Christensen 等人，Plant Mol.Biol. 18 675-689(1992)) ； pEMU(Last 等人，Theor.Appl. Genet.81 581-588(1991)) ； MAS (Velten 等人，EMBO J.3 2723-2730(1984)) ； ALS 啟動子(美國專利5,659,026)等。其他組成型啟動子包括例如在美國專利5,608,149、 5,608,144, 5,604,121, 5,569,597, 5,466,785, 5,399,680, 5,268,463, 5,608,142 禾P 6,177,611中公開的那些啟動子。在選擇啟動子用于本發(fā)明方法時，可能有利的是使用組織特異性啟動子或發(fā)育 調(diào)節(jié)啟動子。組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子是這樣的DNA序列，其調(diào)節(jié)DNA序列選擇性地在對雄穗發(fā)育、結(jié)籽或兩者重要的植物細(xì)胞/組織中表達(dá)，并限制這種DNA序列 只在植物的雄穗發(fā)育或種子成熟期間表達(dá)。任何引起所需時空表達(dá)的可鑒定啟動子均可 用于本發(fā)明的方法中。種子或胚特異性的并且可用于本發(fā)明的啟動子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制 劑(Kti3，Jofuku 和 Goldberg，Plant Cell 1 1079-1093 (1989))、patatin (馬鈴薯塊莖) (Rocha-Sosa, Μ.等人，1989，EMBOJ.8 23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋 白(豌豆子葉)(Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259 149-157 ； Newbigin, E.J.等人，1990，Planta 180 461-470 ； Higgins, T.J.V.等人，1988，Plant.Mol. Biol.ll 683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7 1249_1255)、菜豆蛋白(菜豆子葉)(Segupta-Gopalan，C.等人，I985，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.82 3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子葉)(Voelker，Τ.等人，1987， EMBO J.6 3571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子葉)(Chen，Z_L等人， 1988，EMBOJ.7 297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(Marris， C.等人，1988，Plant Mol.Biol. 10 359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳) (Colot, V.等人，1987，EMBO J.6 3559-3564)和甘薯貯藏蛋白(sporamin)(甘薯塊 根)(Hattori，Τ.等人，1990，Plant Mol.Biol. 14 595-604) 可操作地連接至嵌合基 因構(gòu)建體異源編碼區(qū)的種子特異性基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時空表達(dá) 模式。這樣的實(shí)施例包括在擬南芥和甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)種子中表達(dá)腦啡肽 的擬南芥屬2S種子儲藏蛋白基因啟動子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7 L929-932(1989))、表達(dá)熒光素酶的菜豆凝集素和β -菜豆蛋白啟動子(Riggs等人，Plant Sci.63 47-57(1989))，以及表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的小麥谷蛋白啟動子(Colot等人， EMBO J6 3559-3564(1987))?？烧T導(dǎo)啟動子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如，通過化合物(化學(xué)誘導(dǎo) 劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號和/或發(fā)育信號而選擇性表達(dá)可操縱連接的DNA序 列?？烧T導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動子包括(例如)受光、熱、脅迫、水澇或干旱、植物激素、 創(chuàng)傷或諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學(xué)品調(diào)控的啟動子。用于本發(fā)明的啟動子包括以下啟動子1)脅迫誘導(dǎo)型RD29A啟動子(Kasuga等 人，1999，Nature Biotechnol.l7 287-91) ； 2)大麥啟動子 B22E; B22E 的表達(dá)是發(fā)育 中的玉米籽粒中的柄所特異性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed inlmmature Aleurone Layers(在未成熟糊粉層中差異表達(dá)的新大麥基因的一級結(jié) 構(gòu))”。Klemsdal, S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2) 9-16(1991))；和 3)玉米啟 動子，Zag2 ( “ Identification and molecularcharacterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floralhomeotic gene AGAMOUS " , Schmidt, R.J.等人，Plant Cell 5 (7) 729-737 (1993) ； "Structural characterization, chromosomal localizationand phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-Iike MADS-boxgenes from maize”， Theissen 等人， Gene 156(2) 155-166(1995) ； NCBI GenBank 登錄號 X8O2O6))。Zag2 轉(zhuǎn)錄物可在授粉 前5天至授粉后(DAP)7至8天被檢測到，并且引導(dǎo)Ciml在發(fā)育中的雌花序的心皮中表 達(dá)，Ciml對發(fā)育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml轉(zhuǎn)錄物在授粉前4至5天至 授粉后6至8天被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達(dá)與發(fā)育中的雌小花母系相關(guān)的基因的任何啟動子。用于調(diào)控本發(fā)明的核苷酸序列在植物中表達(dá)的啟動子是莖特異性啟動子。這種 莖特異性啟動子包括苜蓿S2A啟動子(GenBank登錄號EF030816 ； Abrahams等人， Plant Mol.Biol.27 513-528(1995))和 S2B 啟動子(GenBank 登錄號EF030817)等等， 這些文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。啟動子可以整個源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的啟動子的不同元 件組成，或者甚至包括合成的DNA片段。用于本發(fā)明的啟動子可包括以下啟動子RIP2、mLIP15、ZmCORU Rabl7、 CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM 合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh>
蔗糖合成酶、R-等位基因、維管組織優(yōu)選啟動子S2A(Genbank登錄號EF030816)和 S2B(Genbank登錄號EF030817)及來自玉米的組成型啟動子GOS2。其他啟動子包括根優(yōu) 選的啟動子，例如玉米NAS2啟動子、玉米Cyclo啟動子(US 2006/0156439，公開于2006 年7月13日)、玉米ROOTMET2啟動子(W005063998，公開于2005年7月14日)、 CRlBIO 啟動子(W006055487，公開于 2006 年 5 月 26 日)、CRWAQ81 (W005035770, 公開于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47啟動子(NCBI登錄號U38790 ； GI No. 1063664)、本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體也可包括其他調(diào)控序列，包括但不限于翻譯前導(dǎo)序 列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組DNA 構(gòu)建體還包括增強(qiáng)子或沉默子。內(nèi)含子序列可加至5’非翻譯區(qū)、蛋白編碼區(qū)或3’非翻譯區(qū)以增加積聚在 胞漿中的成熟信息的量。已經(jīng)顯示，在植物和動物兩者的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中 包含可剪接內(nèi)含子可使基因表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均增強(qiáng)高達(dá)1000倍。參 見 Buchman 和 Berg, Mol.Cell Biol.8 4395-4405(1988) ； Callis 等人，Genes Dev.l 1183-1200(1987)。任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的調(diào)控序列和蛋 白酪氨酸磷酸酶基因。適用于分離基因和調(diào)控序列的靶植物的實(shí)例應(yīng)該包括但不限于苜 蓿、蘋果、杏、擬南芥屬、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑 莓、藍(lán)莓、西蘭花、抱子甘藍(lán)、卷心菜、卡諾拉、香瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、 芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑桔類、克萊門氏小柑橘類、三葉草、椰子、咖啡、玉米、 棉、蔓越莓、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、 葡萄、柚子樹、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、生菜、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、 芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅果、燕麥、油棕、油菜、秋葵、橄欖樹、洋蔥、橙、觀賞 植物、棕櫚、木瓜樹、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃樹、花生、梨樹、胡椒、柿樹、松 樹、菠蘿、大蕉、李樹、石榴樹、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿
卜、油菜、樹莓、稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、 向日葵、甘薯、楓香樹、柑橘、茶、煙草、蕃茄、黑小麥、草皮草、蕪菁、葡萄樹、西 瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。組合物本發(fā)明的組合物是其基因組中包含本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括任何抑制DNA構(gòu)建體)(例如上面所討論的任何一種構(gòu)建體)的植物。組合物也包括任何植物 的子代，以及獲取自植物或其子代的任何種子，其中所述子代或種子在其基因組中包含 重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而 獲得的連續(xù)世代。子代也包括雜交種和自交系。在雜交種子繁殖的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可自花授粉而產(chǎn)生純合的自交 系植物。該自交系植物產(chǎn)生含有新導(dǎo)入的重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的種 子。這些種子可生長而產(chǎn)生將會表現(xiàn)出改變的農(nóng)學(xué)特性(例如，任選地在水限制條件下 農(nóng)學(xué)特性增加)的植物，或者可用于育種程序以產(chǎn)生雜交種子，這些雜交種子可生長而 產(chǎn)生將會表現(xiàn)出如改變的農(nóng)學(xué)特性的植物。所述種子可為玉米種子。植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如玉米或大豆植物，如玉米雜種植物或 玉米自交系植物。植物還可為向日葵、高梁、卡諾拉(canola)、小麥、苜蓿、棉花、水 稻、大麥或黍。重組DNA構(gòu)建體可穩(wěn)定地整合進(jìn)植物的基因組中。實(shí)施方案尤其包括但不限于以下實(shí)施方案1.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重組 DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多 肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述植物在與不 包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。在與該對照植物 比較時，該植物還可表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。2.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，該重組 DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼蛋 白酪氨酸磷酸酶，并且其中在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時，所述植 物表現(xiàn)出增加的耐旱性。在與該對照植物比較時，該植物還可表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性 的改變。3.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(在例如玉米或大豆植物)，該重組 DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼蛋 白酪氨酸磷酸酶，并且其中在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時，所 述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。4.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重組 DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多 肽，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述植物在與不 包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。5.在基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑 制DNA構(gòu)建體包含至少一種可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的 全部或部分的區(qū)域的調(diào)控元件，所述區(qū)域具有的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所 述區(qū)域所來源的有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時具有至少50%、51%, 52%, 53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、 65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、 77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列 同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶，并且其中在與不包含所 述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。6.在基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑 制DNA構(gòu)建體包含至少一個可操作地連接以下序列的全部或部分的調(diào)控元件(a)編碼 多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(b) (a) 的核酸序列的全長互補(bǔ)序列，并且其中在與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行 比較時，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。7.上述實(shí)施方案1-6中的植物的任何子代、上述實(shí)施方案1-6中的植物的任何種 子、上述實(shí)施方案1-6中的植物的子代的任何種子以及來自上述實(shí)施方案1-6中的植物以 及它們的子代的細(xì)胞。在上述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任一其他實(shí)施方案中的任一項(xiàng)中，蛋白酪氨酸 磷酸酶可來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycine max)、煙豆 (Glycine tabacina)、里予大豆(Glycinesoja)或短絨里予大豆(Glycine tomentella)。在上述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任一其他實(shí)施方案中的任一項(xiàng)中，重組DNA構(gòu) 建體(或抑制DNA構(gòu)建體)可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調(diào)控序列。在上述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任一其他實(shí)施方案中的任一項(xiàng)中，至少一種農(nóng) 學(xué)特性的改變是增加或減少。在任一前述的實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任一其他實(shí)施方案中，至少一種農(nóng)學(xué)特 性可選自綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實(shí)產(chǎn) 量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織中的含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸 含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、 耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、在低溫脅迫下 的早期幼苗活力和幼苗出苗率。例如，至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變可為產(chǎn)量、綠度或生物 量的增加。在任一上述實(shí)施方案1-7或本發(fā)明的任一其他實(shí)施方案中，在與不包含所述重 組DNA構(gòu)建體(或所述抑制DNA構(gòu)建體)的對照植物在水限制條件下進(jìn)行比較時，植物 可表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變?！案珊怠敝钢参锟衫玫乃蛔悖绕涫钱?dāng)時間延長時，能夠引起植物損傷或 阻止其正常發(fā)育(例如限制植物生長或種子產(chǎn)量)?！澳秃敌浴敝钢参镌诟珊禇l件下存活較長時間并且基本上不表現(xiàn)出生理或物理 退化的特性。植物的“耐旱性增加”相對于參比植物或?qū)φ罩参镞M(jìn)行測量，它是植物在干旱 條件下存活較長時間，并且相對于在相似干旱條件下生長的參比或?qū)φ罩参锘旧喜槐?現(xiàn)出相同程度的生理或物理退化的特性。通常當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA 構(gòu)建體或抑制DNA構(gòu)建體時，它相對于參比或?qū)φ罩参锉憩F(xiàn)出增加的耐旱性，所述參比 或?qū)φ罩参镌谄浠蚪M中不包含重組DNA構(gòu)建體或抑制DNA構(gòu)建體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉模擬干旱條件并評價植物耐旱性的規(guī)程，所述植物 已經(jīng)遭受了模擬的或天然存在的干旱條件。例如，技術(shù)人員可通過向植物提供比正常需 求較少的水或在一定時期內(nèi)不提供水來模擬干旱條件，并且技術(shù)人員可通過尋找在生理 和/或物理?xiàng)l件上的差異來評價耐旱性，包括但不限于活力、生長、大小、或根長、或 具體地講葉片顏色或葉片面積大小。用于評價耐旱性的其他技術(shù)包括測量葉綠素?zé)晒狻?光合作用速率和換氣速率。干旱脅迫實(shí)驗(yàn)可涉及慢性脅迫(即緩慢干燥)和/或可涉及兩種急性脅迫(即突 然除去水)，它們由一天或兩次恢復(fù)分開。慢性脅迫可持續(xù)8-10天。急性脅迫可持續(xù) 3-5天。在對轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)對照植物進(jìn)行干旱脅迫以及良好灌溉處理期間可測量以下
變量變量“％面積也§_慢性開始-急性2”是介于慢性脅迫第一天和第二次急性脅 迫那一天之間的、通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度變量“％面積也§_慢性開始-慢性結(jié)束”是介于慢性脅迫第一天和慢性脅迫最 后一天之間的、通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度變量“％面積也§_慢性開始收獲”是介于慢性脅迫第一天和收獲那一天之間 的、通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度變量“％面積chgjg性開始-恢復(fù)24小時”是介于慢性脅迫第一天和恢復(fù)24 小時(急性脅迫2之后24小時)之間的、通過遠(yuǎn)可見光譜成像測定的總面積百分比變化
的量度變量“psii_急性1”是在第一次急性脅迫末期的光系統(tǒng)II(PSII)效率的量度。 它提供對PSII天線吸光效率的評估，并且直接涉及葉片內(nèi)部的二氧化碳同化。變量“psii_急性2”是在第二次急性脅迫末期的光系統(tǒng)II(PSII)效率的量度。它提供對PSII天線吸光效率的評估，并且直接涉及葉片內(nèi)部的二氧化碳同化。變量“fv/fm_急性1”是在第一次急性脅迫末期的最佳量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的量 度_(最大和最小熒光之間的可變熒光差值/最大熒光)變量“fv/fm_急性2”是在第二次急性脅迫末期的最佳量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的量 度_(最大和最小熒光之間的可變熒光差值/最大熒光)變量“葉片卷曲_收獲”是在收獲日的頂部圖像對側(cè)面圖像的比率的量度。變量“葉片卷曲_恢復(fù)24小時”是恢復(fù)24小時頂部圖像對側(cè)面圖像的比率的量度。變量“比生長速率(SGR) ”指植物總表面積經(jīng)過單獨(dú)一天的變化(通過Lemna Tec Instrument 測量)(Y (t) = Y0*ert)。Y (t) = Y0*ert 等同于在 Y/ Δ t 中的 ％變化，其 中的單個術(shù)語如下所述Y(t)=在t時的總表面積；YO=初始總表面積(估計的)；r = 比生長速率天―1，并且t=種植后的天數(shù)(“DAP” )變量“苗干重”是將苗置于104°C烘箱96小時后的苗重量的量度變量“苗鮮重”是從植物切除后立即稱重的苗重量的量度下文實(shí)例描述一些用于模擬干旱條件和/或評價耐旱性的代表性規(guī)程和技術(shù)。也可通過在田間測試中比較植物在模擬的或天然存在的干旱條件下(例如通過 測量與非干旱條件下相比，在干旱條件下基本等同的產(chǎn)量，或測量與對照或參比植物相 比，在干旱條件下更少的產(chǎn)量損失)保持足夠產(chǎn)量(至少75%、76%, 77%、78%, 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%產(chǎn)量)的能力來評價 耐旱性。在評估或測量其中利用了對照或參照植物的本發(fā)明任何實(shí)施方案(如，如本文 描述的組合物或方法)中的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將 很容易認(rèn)識到要利用的合適對照植物。例如，通過如下非限制性示例來說明1.轉(zhuǎn)化的植物的子代，該植物對于重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)來說 是半合子的，使得該子代分離成包含或不包含該DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植 株包含該重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代將通常相對于不包含該重組 DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代來進(jìn)行測量(即，不包含該重組DNA構(gòu)建體 (或抑制DNA構(gòu)建體)的子代是對照或參照植株)。2.重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)基因摻入至自交系中，例如在玉米 中，或基因摻入進(jìn)變體中，例如在大豆中基因摻入品系將通常相對于親本自交系或變 種品系進(jìn)行測量(即，親本自交系或變種品系是對照或參照植物)。3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個親本自交系產(chǎn)生，而第二雜交系由相同的 兩個親本自交系產(chǎn)生，不同的是其中一個親本自交系含有重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA 構(gòu)建體)第二雜交系通常將相對于第一雜交系進(jìn)行測量(即第一雜交系為對照植物或參 照植物)。4.包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植株該植株可相對于這 樣的對照植株進(jìn)行評估或測量，該對照植株不包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建 體)，但具有與該植株相當(dāng)?shù)倪z傳背景(例如，與包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植株相比較，核遺傳物質(zhì)具有至少90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性)。存在許多可用于分析、比較和表征植 物遺傳背景的基于實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)；其中這些技術(shù)是同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、DNA擴(kuò) 增指紋(DAF)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP )和也稱為 微衛(wèi)星的簡單序列重復(fù)(SSR)。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識到，評估或測量轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特 性或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經(jīng)針對所需的農(nóng)學(xué)特性或表型，通過 誘變或轉(zhuǎn)化而選擇的植物。方法方法包括但不限于用于提高植物耐旱性的方法、用于評價植物耐旱性的方 法、用于改變植物農(nóng)學(xué)特性的方法、用于測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法、和用于制備種 子的方法。所述植物可為單子葉或雙子葉植物，例如玉米或大豆植物。植物還可為向日 葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥或黍。所述種子可為玉米或大豆種 子，例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。方法包括但不限于如下方法用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。也包括通 過這種方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或 植物細(xì)胞，或原核，例如細(xì)菌。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體 來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從轉(zhuǎn)化過的植物細(xì)胞中再生轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也涉及由該方法制備 的轉(zhuǎn)基因植物，以及從該轉(zhuǎn)基因植物中獲取的轉(zhuǎn)基因種子。用于從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基中分離本發(fā)明的多肽的方法，其中所述細(xì)胞包含重組 DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的本發(fā)明的多核苷 酸，并且其中所述轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞在適于重組DNA構(gòu)建體表達(dá)的條件下生長。改變本發(fā)明多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平的方法包括(a)用本發(fā)明的重組 DNA構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及(b)使轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞在適于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體 的條件下生長，其中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的本發(fā)明多肽 水平的改變。增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生 的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物 中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有 至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%, 62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%, 99%或100%的序列同一性；和(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與 不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。所述方法可進(jìn) 一步包括(C)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重 組DNA構(gòu)建體并且在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時表現(xiàn)出增加的耐旱 性。增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能 的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序 列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100% 的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序 列的全長互補(bǔ)序列；和(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物， 其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體并且在與不包含該抑制DNA構(gòu) 建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。所述方法可進(jìn)一步包括(C)獲得源自 該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體并且在 與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生 的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的 啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或 部分的區(qū)域，所述區(qū)域的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的有義鏈 或反義鏈的全部或部分比較時具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān) 注的靶基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶；和(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生 出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體并且在與不包含 該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。所述方法可進(jìn)一步包括 (C)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含抑制DNA 構(gòu)建體并且在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。評價植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生 的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物 中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%,
626364656667686970 717273747576777879808182 838485868788899091929394 95969798%,99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生
出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評 價該轉(zhuǎn)基因植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱性。該方法 可進(jìn)一步包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中 包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(e)評價該子代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對 照植物進(jìn)行比較時的耐旱性。評價植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能 的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序 列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序 列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其 中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)評價該轉(zhuǎn)基因植物在與 不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱性；該方法可進(jìn)一步包括(d) 獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建 體；以及(e)評價該子代植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐 旱性。評價植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生 的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動 子)，該調(diào)控序列可操作地連接至來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區(qū)域，所述區(qū)域具有的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的有義 鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，并且其中所 述所關(guān)注的靶基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞 再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(c) 評價該轉(zhuǎn)基因植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱性；該方 法可進(jìn)一步包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)評價該子代植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的 對照植物進(jìn)行比較時的耐旱性。評價植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生 的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物 中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有 至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 56%, 62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%, 99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生 出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(C)獲得源 自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體； 以及(d)評價該子代植物在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱 性。評估植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再 生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能 的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序 列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 15、17、19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、 48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii) (a) (i)的核酸序 列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其 中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的 子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評價該子代 植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱性。評價植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生 的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動 子)，該調(diào)控序列可操作地連接至來源于所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部 分的區(qū)域，所述區(qū)域具有的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源的有義 鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、 68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞 再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(C)獲得 源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體； 以及(d)評價該子代植物在與不包含該抑制DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱 性。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到 可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例 如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行 比較時具有至少 50%、51%、52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、 72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96%, 97%, 98%, 99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的 植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建 體；以及(C)測定所述轉(zhuǎn)基因植物任選地在水限制條件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體 的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法可進(jìn)一步包括(d)獲 得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建 體；以及(e)測定所述子代植物任選地在水限制條件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的 對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到 可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有 功能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核 酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 15、17、 19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii) (i)的核酸 序列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物， 其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)測定所述轉(zhuǎn)基因植物 任選地在水限制條件下與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少 一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法可進(jìn)一步包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物， 其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)測定所述子代植物任選 地在水限制條件下與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種 農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功 能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全 部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域具有的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源 的有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，并且 其中所述所關(guān)注的靶基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植 物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以 及(C)測定所述轉(zhuǎn)基因植物任選地在水限制條件下與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照 植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法可進(jìn)一步包括(d)獲得源自 該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及 (e)測定所述子代植物任選地在水限制條件下與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物 比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。 測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到 可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例 如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行 比較時具有至少 50%、51%、52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%,
605662 %、63 64656667 6869 %、70 %、71727374 %、75 76777879 8081 %、82 %、83848586 %、87 88899091 9293 %、94 %、9596%,97%,98%,99%或100%的序列同-一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的
植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建 體；(C)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組 DNA構(gòu)建體；以及(d)測定所述子代植物任選地在水限制條件下與不包含所述重組DNA 構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。 測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到 可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有 功能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核 酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 15、17、 19、 21、 23、 25、 27、 28、 29、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 40、 41、 43、 44、 45、 46、 47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有至少 50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或 100%的序列同一性，或者(ii)⑴的核酸序列的全長互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后，從該可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物， 其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(C)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物 的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)測定所述 子代植物任選地在水限制條件下與不包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表 現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到 可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功 能的啟動子)，所述調(diào)控序列可操作地連接源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全 部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域具有的核酸序列基于Clustal V比對方法在與所述區(qū)域所來源 的有義鏈或反義鏈的全部或部分進(jìn)行比較時具有至少50%、51%, 52%, 53%, 54%, 55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%、66%、 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %或 100% 的序列同一性，并 且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶；(b)在步驟(a)之后，從該可再生 的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建 體；(C)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制 DNA構(gòu)建體；以及(d)測定所述子代植物任選地在水限制條件下與不包含所述抑制DNA 構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。產(chǎn)生種子(例如可作為提供耐旱性的產(chǎn)品銷售的種子)的方法，該方法包括任一 上述的方法，并且還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種子在其基因組中包含所 述重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。在任一前述方法或本發(fā)明方法的任一其他實(shí)施方案中，在所述導(dǎo)入步驟中所述 可再生的植物細(xì)胞可包括愈傷組織細(xì)胞、胚胎愈傷組織細(xì)胞、配子細(xì)胞、分生細(xì)胞或未 成熟胚芽細(xì)胞?？稍偕闹参锛?xì)胞可來自近交系玉米植物。在任意上述方法或本發(fā)明方法的任意其他實(shí)施方案中，所述再生步驟可包括以 下步驟ω在包含促進(jìn)胚發(fā)生的激素的培養(yǎng)基中培育所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞直至觀察到愈 傷組織；Gi)將所述步驟ω的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含促進(jìn)組織機(jī)體形成的激素的第 一培養(yǎng)基；以及Gii)在第二培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)步驟(ω后的所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以允 許嫩芽伸長、根發(fā)育或這兩者同時發(fā)生。在任一上述方法或本發(fā)明方法的任一其他實(shí)施方案中，至少一種農(nóng)學(xué)特性優(yōu)選 選自綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種 子產(chǎn)量、總植物氮含量、果實(shí)氮含量、種子氮含量、營養(yǎng)組織中的氮含量、總植物游離 氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織中的氨基酸含量、 總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織中的蛋白質(zhì)含量、耐 旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植物高度、穗高、穗長、在低溫脅迫下的 早期幼苗活力和幼苗出苗率。至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變可為產(chǎn)量、綠度或生物量的增 加。在任一上述方法或本發(fā)明的任一其他方法中，在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體(或所述抑制DNA構(gòu)建體)的對照植物在水限制條件下進(jìn)行比較時，植物可表現(xiàn)出至少 一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在任一前述方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，存在供選擇的替代方案 用于將包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的 植物細(xì)胞中。例如，可將調(diào)控序列(例如一種或多種增強(qiáng)子、任選地作為轉(zhuǎn)位因子的部 件)引入到可再生的植物細(xì)胞中，然后篩選其中將所述調(diào)控序列可操作地連接至編碼本 發(fā)明多肽的內(nèi)源基因的事件。將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物可通過任何合適的技術(shù)來進(jìn)行，這些技術(shù) 包括但不限于引導(dǎo)DNA攝取、化學(xué)處理、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、感染、載體介導(dǎo) 的DNA轉(zhuǎn)移、轟擊或農(nóng)桿菌Agrobacterium介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)已經(jīng)在 國際專利公布W02009/006276中進(jìn)行了描述，其內(nèi)容以引用方式并入本文。含有編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的外來的外源性分離的核酸片段的植物的發(fā)育或再生是 本領(lǐng)域所熟知的。可將再生的植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘撸瑢⒌?自再生植物的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的品系的產(chǎn)生種子的植株進(jìn)行雜交。相反，將來自這些 重要品系的植物用于給再生植物授粉。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法培育含有所需 多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明，其中份數(shù)和百分比是以重量計并且度 數(shù)是攝氏度，除非另外說明。應(yīng)該理解，盡管這些實(shí)施例說明了本發(fā)明的實(shí)施方案，但 僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定 本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明做出多種改 變和修飾，以使其適用于多種用法和條件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之 外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。 這些修改形式也旨在屬于附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實(shí)施例1泡丨備H有激活標(biāo)記基因白射以南芥屬種群構(gòu)建18.5kb 的 T-DNA 基二元構(gòu)建體，pHSbarENDs2 (SEQ ID NO 1)包含四個
來源于花椰菜花葉病毒35S啟動子的四個多聚增強(qiáng)子元件(對應(yīng)于序列-341至-64，如 Odell等人Nature 313 810-812所述(1985))。該構(gòu)建體也包含允許質(zhì)粒救援的載體序 列(pUC9)和多接頭、再動員T-DNA的轉(zhuǎn)座子序列(Ds)、以及允許草胺磷選擇轉(zhuǎn)基因植 物的bar基因。原則上，僅將從右邊界(RB)至左邊界(LB)包含的10.8kb片段轉(zhuǎn)移到寄 主植物基因組中。因?yàn)樵鰪?qiáng)子元件位于靠近RB處，它們可誘導(dǎo)T-DNA整合后的基因組 位點(diǎn)順式激活。通過整個植株的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化制備擬南芥屬激活標(biāo)記種群。將pHSbarENDS2構(gòu)建 體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株C58中，在25°C下在LB中培養(yǎng)至OD600 1.0。然后離心沉 淀細(xì)胞，并重懸在相等體積的5%蔗糖/0.05% Silwet L-77 (OSI Specialties，Inc)中。在
早期抽薹時，培育擬南芥生態(tài)型Col-O的土壤使用農(nóng)桿菌懸浮液進(jìn)行頂部灌溉。一周后， 相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行頂部灌溉。然后將該植物的種子設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)。所得Tl種子在土壤中播種，通過噴灑草胺磷(FINALE 丨AgrEvo ； Bayer Environmental Science)選擇轉(zhuǎn)基因幼苗。選擇了總計100,000個草胺磷抗性Tl幼苗。分 開保存來自每個品系的T2種子。實(shí)施例2篩詵以鑒定耐旱件增加的品系定量的干旱篩選將來自96,000個單獨(dú)的Tl激活標(biāo)記品系的九個草胺磷抗性T2 植物每個播種在單個罐中，在Scotts Metro-Mix 200土壤上生長。每個淺箱配置8個 方形罐。每個方形罐裝滿土壤至頂部。以3X3的陣列在每個罐(或小隔間)中播種以 制備9個草胺磷抗性幼苗。土壤澆水至飽和，然后植物在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(即，16小時光照，8小時黑暗的 循環(huán)；22°C; 60%的相對濕度)。不提供附加的水。在可見的干旱脅迫癥狀出現(xiàn)時拍攝植物的數(shù)字圖像。每天拍攝圖像一次(在每 天的相同時間)，直至植物變干。通常收集連續(xù)四天的數(shù)據(jù)。使用顏色分析鑒定潛在的耐旱性品系。可使用顏色分析測量進(jìn)入黃色區(qū)的葉片 面積百分比的增加。使用色調(diào)、飽和度和強(qiáng)度數(shù)據(jù)(“HSI”)，黃色區(qū)由色調(diào)35至45 組成。葉片面積的保持也被用作鑒定潛在耐旱性品系的另一個標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)閿M南芥屬葉 片在干旱脅迫期間萎蔫。葉片面積的保持可用蓮座型葉叢面積隨時間的減少來測量。葉片面積根據(jù)使用LemnaTec成像系統(tǒng)獲取的綠色像素數(shù)目進(jìn)行測量。激活標(biāo)記 和對照(例如野生型)植物在淺箱中并列生長，淺箱包含72株植物(9株/罐)。當(dāng)萎蔫 開始時，拍攝圖像多日以監(jiān)控萎蔫過程?；谶B續(xù)四天獲取的綠色像素數(shù)，從這些數(shù)據(jù) 中測定激活標(biāo)記植物和伴隨的對照植物的萎蔫特征圖。該特征圖選自發(fā)生最大程度萎蔫 的四天中的一系列測量結(jié)果。耐旱能力通過激活標(biāo)記植物與對照植物相比的抗萎蔫傾向 來測量。使用LemnaTec HTSBonitUV軟件分析CCD圖像。根據(jù)綠色像素數(shù)目獲取對擬
南芥屬植物的葉片面積的評估。對每張圖像的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均化以獲取對激活標(biāo)記植物和 對照植物的綠色像素值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的評估。噪聲函數(shù)的參數(shù)通過對平均像素數(shù) 平方偏差的線性回歸獲得，使用同一批中的所有圖像數(shù)據(jù)。平均像素數(shù)數(shù)據(jù)的誤差估計 使用噪聲函數(shù)的擬合參數(shù)進(jìn)行計算。激活標(biāo)記植物和野生型植物的平均像素數(shù)相加以獲 取每張圖像的總?cè)~片面積的評估。具有最大萎蔫的四天間隔通過選擇對應(yīng)于植物生長最 大差異的間隔獲得。激活標(biāo)記植物和野生型植物的單個萎蔫響應(yīng)通過歸一化使用間隔第 一天的綠色像素數(shù)值的數(shù)據(jù)獲得。激活標(biāo)記植物與野生型植物相比的耐旱性通過相加經(jīng) 過兩天至四天的激活標(biāo)記植物和野生型植物間的萎蔫響應(yīng)的加權(quán)差值來評分；加權(quán)數(shù)通 過傳遞數(shù)據(jù)誤差進(jìn)行評估。耐旱性評分為正，對應(yīng)于激活標(biāo)記植物與野生型植物相比萎 蔫更慢。激活標(biāo)記植物和野生型植物之間的萎蔫響應(yīng)的差異顯著性從平方偏差的加權(quán)和 獲取。將在與整個淺箱的平均值進(jìn)行比較時具有黃色積聚顯著延遲和/或蓮座型葉叢 面積顯著保持的品系命名為Phase 1 hits。在相同分析條件下進(jìn)行Phase 1 hits的重復(fù)試樣 再篩選。當(dāng)Phase 2平行測定的其中一個或全部顯示與整個淺箱的平均值有顯著差異時(評分大于0.9)，則認(rèn)為該品系是經(jīng)驗(yàn)證的耐旱性品系。實(shí)施例3鑒定激活標(biāo)記基因使用下述兩個標(biāo)準(zhǔn)程序中的一個或兩個鑒定側(cè)接導(dǎo)致耐旱性的T-DNA插入序列 的基因(1)熱不對稱交錯(TAIL)PCR(Liu 等人，(1995)，Plant J.8 457-63)；以及 (2) SAIFF PCR(Siebert 等人，(1995)Nucleic Acias Res.23 1087-1088)。至于復(fù)雜的多 聚T-DNA插入序列，TAIL PCR和SAIFF PCR可能均不足以鑒定候選基因。在這些情 況下，可使用包括反式PCR、質(zhì)粒拯救和/或基因組文庫構(gòu)建在內(nèi)的其他程序。成功的結(jié)果是其中單個TAIL或SAIFF PCR片段包含T-DNA邊界序列和擬南芥 屬基因組序列。一旦獲取側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列標(biāo)記，通過與公開可用的擬南芥屬 基因組的序列比對來鑒定候選基因。具體地講，最靠近35S增強(qiáng)子元件/T-DNA RB的注釋基因是激活的基因的候選基因。為了驗(yàn)證鑒定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合偽克隆的 可能性，用一個T-DNA中的寡核苷酸和一個候選基因特異性的寡核苷酸進(jìn)行對基因組 DNA的診斷PCR。將提供PCR產(chǎn)品的基因組DNA樣本理解為表示T-DNA插入序列。 該分析也驗(yàn)證了其中一種以上的插入事件發(fā)生在相同品系中的情況，例如，在TAIL和/ 或SAIFF PCR分析中鑒定是否有多個不同基因組片段。實(shí)施例4A鄉(xiāng)·還分析了顯示耐旱性的激活標(biāo)記品系(Νο.116089)。提取來自該品系的DNA， 并且在突變品系中側(cè)接T-DNA插入序列的基因通過SAIFFPCR (Siebert等人，Nucleic Acids Res.23 1087-1088 (1995))進(jìn)行鑒定。鑒定一個PCR擴(kuò)增的片段，它包含T-DNA 邊界序列和擬南芥屬基因組序列。獲取側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列，并且通過與 完全擬南芥屬基因組的序列比對鑒定候選基因。就給定的T-DNA整合事件而言，最靠近 35S增強(qiáng)子元件/T-DNA RB的注釋基因是品系中的活化候選基因。在品系116089的情 況下，T-DNA插入基因At3g44610中。將在整合位點(diǎn)的35S增強(qiáng)子導(dǎo)向At3g44620 (SEQ ID NO 14)，編碼蛋白酪氨酸磷酸酶(SEQ ID NO 15; NCBI GI No.79432726)。實(shí)施例4B候選耐旱性基因表達(dá)水平的測定功能性的激活標(biāo)記等位基因?qū)?dǎo)致在其中它正常表達(dá)的組織中的候選基因上 調(diào)、在其中它通常不表達(dá)該基因的組織中異常表達(dá)、或者兩種情況都發(fā)生。比較在同源突變品系和野生型品系中的候選基因的表達(dá)水平。使用標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR 程序如QuantiTect Reverse Transcription試劑盒，購自Qiagen 。使用肌動蛋白基因的 RT-PCR作為對照物以顯示來自突變品系和野生型的樣本的擴(kuò)增和載入是相似的。最優(yōu)化各個基因的測定條件。在成熟的蓮座型葉中檢查表達(dá)水平。如果激活標(biāo) 記等位基因?qū)е略谄渌M織(例如根)中的異常表達(dá)，通過該檢測分析法它不被檢出。同 樣地，陽性結(jié)果是有用的，但是陰性結(jié)果不排除基因不需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
實(shí)施例5肖維·她44620(舶_麵_ )可將候選基因轉(zhuǎn)化到擬南芥屬中并在35S啟動子作用下過表達(dá)。如果在轉(zhuǎn)基因 品系中觀察到與親本激活標(biāo)記品系相同或相似的表型，則將該候選基因認(rèn)為是擬南芥屬 中驗(yàn)證過的“前導(dǎo)基因”。用以下方法測試候選擬南芥屬蛋白酪氨酸磷酸酶基因(At3g44620; SEQ ID NO 14)賦予耐旱性的能力。用緊接Invitrogen Gateway Cl轉(zhuǎn)化插入序列上游的1.3-kb的35S啟動子構(gòu)建 16.8-kb 的 T-DNA 基二元載體，稱為 pBC_yellow(SEQ IDNO 4)。該載體也包含 RD29a
啟動子，該啟動子驅(qū)動基因表達(dá)ZS-YellowdNVITROGEN )，它賦予轉(zhuǎn)化過的種子黃色熒光。通過RT-PCR擴(kuò)增At3g44620cDNA蛋白編碼區(qū)的534個核苷酸的片段，使用以 下引物(l)At3g44620-5，attB 正向引物(SEQ ID NO 12) TTAAACAAGTTTGTACA AAAAAGCAGGCTCAACAATGGCGACTCCTCCTCCGACG(2)At3g44620-3，attB 反向引物(SEQ ID NO 13) TTAAACCACTTTGTACA AGAAAGCTGGGTTCAACTTTGCGCAGTGATACT將通過以上引物擴(kuò)增的534個核苷酸的片段命名為AAt3g44620，它編碼由SEQ ID NO 15的氨基酸63-239組成的截短的蛋白酪氨酸磷酸酶。該截短蛋白的177個氨基 酸的序列如SEQ ID NO 33所示，并且它缺失全長擬南芥屬蛋白酪氨酸磷酸酶(SEQ ID NO 15)的氨基末端的62個氨基酸。正向引物包含attBl 序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ； SEQ ID
NO 10)和共有的Kozak序列(CAACA)鄰近蛋白編碼區(qū)的21個核苷酸(以位于SEQ ID NO 14的核苷酸216的ATG密碼子開頭)。反向引物包含attB2 序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ； SEQ ID NO 11)，該序列鄰近SEQ ID NO : 14蛋白編碼區(qū)的反向互補(bǔ)序列的后21個核苷酸(以 終止密碼子的反向互補(bǔ)序列開頭)。使用Invitrogen Gateway CLONASETM 技術(shù)，用 pDONRTM/Zeo (SEQ ID
NO 2)進(jìn)行BP重組反應(yīng)。這種方法將細(xì)菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM) 從pDONRTM/Zeo移除并定向地克隆了該在旁側(cè)具有attBl和attB2位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物而得 到入門克隆(entry clone)PHP30192。該入門克隆與目的載體一起用于隨后的LR重組反 應(yīng)如下。用緊接INVITROGEN GATEWAY Cl轉(zhuǎn)化插入序列上游的1.3_kb35S 啟動子構(gòu)建稱為pBC_yellow(SEQ ID NO 4)的16.8-kb T-DNA基的二元載體 (目的載體)，所述插入序列包含ccdB細(xì)菌致死基因以及側(cè)接attRl和attR2序 列的氯霉素抗性基因(CAM)。 該載體也包含RD29a啟動子，該啟動子驅(qū)動 基因表達(dá)ZS-Yell0W (INVITROGEN )，它賦予轉(zhuǎn)化過的種子黃色熒光。使用 Invitrogen Gate way 技術(shù)，對包含定向克隆PCR產(chǎn)物和pBC-yellow的PHP30192入門克隆進(jìn)行LR重組反應(yīng)。這允許迅速地定向克隆在pBC-yellow中的35S啟動子后的候選 基因以制備35S啟動子A At3g44620表達(dá)構(gòu)建體，pBOYellow-A At3g44620。申請人:然后使用如實(shí)施例1所述的相同農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化程序，將35S啟動子 A At3g44620表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入野生型擬南芥屬生態(tài)型Col_0。轉(zhuǎn)基因T1種子通過黃色熒 光進(jìn)行選擇，并且將T1種子緊鄰著野生型種子種植并在水限制條件下生長。生長條件和 成像分析如實(shí)施例2所述。發(fā)現(xiàn)來自激活標(biāo)記的初始耐旱性表型可在用其中AAt3g44620 通過35S啟動子直接表達(dá)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過的野生型擬南芥屬植物中重現(xiàn)。通過實(shí)施例2 的方法測定的耐旱性評分是4.3。實(shí)施例6cdna f^^ffen^n CDNA ^M^AmmmmcDNA文庫可通過許多可用的方法中的任一種制備。將擴(kuò)增的DNA插入序列 或質(zhì)粒DNA在引物標(biāo)記法測序反應(yīng)(dye-primer sequencingreaction)中進(jìn)行測序，以產(chǎn) 生部分cDNA序列(表達(dá)序列標(biāo)記或“EST” ；參見Adams等人，1991，Science 252 1651-1656)。用改進(jìn)的轉(zhuǎn)座規(guī)程來產(chǎn)生全長插入序列(FIS)數(shù)據(jù)。將確認(rèn)的模板通過基于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Tyl轉(zhuǎn)座因子(Devine 和 Boeke，1994，Nucleic Acids Res.22 3765-3772)的 Primer Island 轉(zhuǎn)座試劑盒(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)進(jìn)行轉(zhuǎn)座。隨后將轉(zhuǎn)座的DNA用于通過電穿孔 轉(zhuǎn)化 DH10B 電-感受態(tài)細(xì)胞(Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。轉(zhuǎn)座因 子含有另外的可選標(biāo)記(稱為 DHFR; Fling 和 Richards，1983，Nucleic Acids Res. 11 5147-5158)，使得能在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉(zhuǎn)座子的那些亞克隆。從每 次轉(zhuǎn)座反應(yīng)隨機(jī)地選擇多個亞克隆，通過堿性裂解制備質(zhì)粒DNA，并用對轉(zhuǎn)座子內(nèi)的結(jié) 合位點(diǎn)特異性的獨(dú)特引物從轉(zhuǎn)座事件位點(diǎn)向外進(jìn)行測序(ABI PRISM dye-terminator ReadyReaction mix)。收集序列數(shù)據(jù)(ABIPrism Collections)并用 Phred和 Phrap(Ewing，等人，1998， Genome Res.8 175-185 ； Ewing 禾口 Green，1998，Genome Res.8 186-194)進(jìn)行裝配。 通過Consed序列編輯器(Gordon等人，1998，Genome Res.8 195-202)檢查裝配序列。在一些克隆中，cDNA片段可對應(yīng)基因的3’ -端的一部分并且不會涵蓋整個開 放閱讀框。為了獲得上游信息，使用兩種不同規(guī)程中的一者。這兩種方法中的第一種 方法導(dǎo)致產(chǎn)生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二種方法導(dǎo)致產(chǎn)生含有整個開 放閱讀框的片段。這兩種方法均使用兩輪PCR擴(kuò)增以從一個或多個文庫獲得片段。有 時基于以前的知識(特定的基因應(yīng)該存在于某些組織中)選擇文庫，有時則進(jìn)行隨機(jī)地 選擇。獲得相同基因的反應(yīng)可平行地在若干文庫中進(jìn)行，或者在文庫池中進(jìn)行。文庫 池通常用3至5個不同的文庫制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴(kuò)增 中，兩種方法均使用載體特異性的(正向)引物，同時還使用基因特異性的(反向)引 物，該正向引物對應(yīng)位于克隆5’ -端處的載體的一部分。一第一種方法使用與已知基 因序列的一部分互補(bǔ)的序列，而第二種方法使用與3’ -非翻譯區(qū)(也稱為UTR)的一 部分互補(bǔ)的基因特異性引物。在第二輪擴(kuò)增中，兩種方法均使用套式引物組。按照生 產(chǎn)商的說明書，用市售試劑盒將所得DNA片段連接進(jìn)pBLUESCRIPT 載體中。該試劑盒選自可得自包括 Invitrogen (Carlsbad, CA)、Promega Biotech (Madison, WI)和 Gibco-BRL (Gaithersburg，MD)在內(nèi)的一些供應(yīng)商的許多試劑盒。如上所述，將質(zhì)粒 DNA通過堿性裂解方法分離并進(jìn)行測序和用Phred/Phrap進(jìn)行裝配。實(shí)施例7cDNA克降的鑒定編碼受關(guān)注的多肽的cDNA克隆能通過BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool ； Altschul等人(1993)J.Biol.215 403-410 ；還可參見國立衛(wèi)生研究院國家醫(yī)學(xué)圖
書館的國家生物技術(shù)信息中心的萬維網(wǎng)址上對BLAST算法的解釋)進(jìn)行鑒定，尋找與 BLAST "nr"數(shù)據(jù)庫中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻譯序列、源 自3-維結(jié)構(gòu)Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)、SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù) 據(jù)庫的最新的主要版本、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫的序列)的相似性。在所有的閱讀框中翻 譯來自克隆的DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，1993，Nat.Genet.3 266-272)比較與‘‘nr”數(shù)據(jù)庫中包含的所有可公開獲得的蛋白質(zhì)序列的相似性。采用國 家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列編碼的多肽與包含在 “nr”數(shù)據(jù)庫中的所有可公開獲得的氨基酸序列的相似性。為方便起見，通過BLAST計 算僅僅偶然觀察到cDNA序列與所搜索的數(shù)據(jù)庫中所包含序列的匹配的P值(概率)或E 值(期望值)，在本文報導(dǎo)為“pLog”值，它代表所報導(dǎo)的P值或E值的負(fù)對數(shù)。一因 此，pLog值越大，cDNA編碼的序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越 大。EST序列能與如上所述的Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。通過使用BLASTn算法 (Altschul等人，Nucleic Acids Res.25 3389-3402 (1997))對杜邦專利數(shù)據(jù)庫比較具有序
列同源共有區(qū)域或重疊區(qū)域的核苷酸序列，可找到含更5'端或3'端序列的EST。在兩 個或更多個核酸片段之間存在共有或重疊序列時，該序列可裝配成單一的連續(xù)核苷酸序 列，從而使最初的片段在5'或3'初始方向上延伸。一旦確定了最5'的EST后，可以 如上所述，通過全長插入序列來確定其完整的序列?？捎胻BLASTn算法，通過將已知基 因(來自專有來源或公開數(shù)據(jù)庫的已知基因)的氨基酸序列對EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，可找 到屬于不同物種的同源基因。tBLASTn算法對所有6個閱讀框都翻譯了的核苷酸數(shù)據(jù)庫 進(jìn)行氨基酸查詢的搜索。該搜索允許不同物種之間的核苷酸密碼子使用的差異，并且允 許密碼子簡并。實(shí)施例8表征編碼蛋白酪氨酸磷酸酶的cDNA克隆制備提供來自玉米、大豆、糖用甜菜、野莧菜(Amanmthusretroflexus)和葡萄的
不同組織的mRNA的cDNA文庫，并且鑒定編碼蛋白酪氨酸磷酸酶的cDNA克隆。下面 描述了該文庫的特征。MJl來自玉米、大豆、糖用甜菜、野莧菜和葡萄的cDNA文庫
權(quán)利要求
1.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連 接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQID NO: 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有 至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物 進(jìn)行比較時表現(xiàn)出增加的耐旱性。
2.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連 接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸 序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQIDNO 15、17、19、21、23、25、27、28、29、 33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比較時具有 至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物 進(jìn)行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
3.權(quán)利要求2的植物，其中所述至少一種農(nóng)學(xué)特性為選自下列的至少一種綠度、 產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植 物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、 種子游離氨基酸含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱 性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、在低溫脅迫下的早 期幼苗活力和幼苗出苗率。
4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的植物，其中在水限制條件下與未包含所述重組DNA構(gòu) 建體的所述對照植物比較時，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種農(nóng)學(xué)特性的所述改變。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
6.增加植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可 操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比 較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因 植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(C)獲得源自步驟(b)的所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組 中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較 時表現(xiàn)出增加的耐旱性。
7.評價植物耐旱性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可 操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比 較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(C)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評價所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時的耐旱性。
8.測定植物的至少一種農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可 操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有 的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 15、17、19、21、23、25、27、 28、29、33、34、35、36、37、38、40、41、43、44、45、46、47、48、49 和 50 進(jìn)行比 較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因 植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(C)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體；以及(d)測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn) 出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述測定步驟(d)包括測定所述轉(zhuǎn)基因植物在水限制條 件下與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改 變。
10.權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法，其中所述至少一種農(nóng)學(xué)特性為選自下列的至少 一種綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種 子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離 氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白 質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、在低 溫脅迫下的早期幼苗活力和幼苗出苗率。
11.權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。
12.分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含(a)編碼具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對 方法，成對比對的默認(rèn)參數(shù)KTUPLE = 1，空位罰分=3，窗口 =5，并且DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ IDNO 25、37、40或41進(jìn)行比較時 具有至少90%的序列同一性，或者在與SEQ ID NO: 21或39進(jìn)行比較時具有至少93% 的序列同一性，或者所述氨基酸序列包含SEQ ID NO: 17、34、43或44 ；或者(b)所述(a)的核苷酸序列的全長互補(bǔ)序列。
13.權(quán)利要求12的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDNO: 17、21、 25、 34、 36、 37、 40、 41、 43 或 44。
14.權(quán)利要求12的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO : 16、20、24、39 或42。
15.包含重組DNA構(gòu)建體的植物或種子，其中所述重組DNA構(gòu)建體包含權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接至少一種調(diào)控序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸和多肽，以及用于提供耐旱性的重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至植物中有功能的啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼蛋白酪氨酸磷酸酶。
文檔編號A01H5/10GK102016014SQ200980114283
公開日2011年4月13日 申請日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者H·薩凱, J·馬倫, R·W·威廉斯, S·M·艾倫, S·V·廷蓋, S·盧克, S·西瓦?？?申請人:先鋒高級育種國際公司, 納幕爾杜邦公司