專利名稱：用于治療青光眼的血清淀粉狀蛋白A的RNAi抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干擾RNA組合物用于抑制青光眼、尤其是原發(fā)性開角型青光眼中血清淀粉狀蛋白A(SAA)表達(dá)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青光眼是共有某些臨床特征的一組多樣的視神經(jīng)病。青光眼中視力損失的原因是神經(jīng)視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的選擇性死亡，該選擇性死亡在臨床上通過視野特征性改變、神經(jīng)纖維層缺陷和視神經(jīng)頭(ONH)進(jìn)行性杯化來診斷。青光眼發(fā)展的一個(gè)主要風(fēng)險(xiǎn)因素是高眼壓癥(升高的眼內(nèi)壓力，Ι0Ρ)的存在。需要足夠的眼內(nèi)壓力以維持眼的形狀并提供壓力梯度以允許房水流向無血管的角膜和晶狀體。IOP似乎還參與正常張力青光眼的發(fā)病機(jī)制，此時(shí)常認(rèn)為患者具有正常的Ι0Ρ。與青光眼相關(guān)的升高的IOP的原因是位于眼前房虹膜角膜角內(nèi)一小片特化組織-小梁網(wǎng)(TM)中升高的房水流出阻力。TM的青光眼性改變包括TM細(xì)胞的損失和胞外殘片(包括蛋白斑樣物質(zhì))沉積和聚集。此外，還發(fā)生青光眼性O(shè)NH的改變。在青光眼性眼中，ONM神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中存在形態(tài)學(xué)改變和運(yùn)動(dòng)性改變。作為對(duì)升高的IOP和/或短暫缺血性損傷的反應(yīng)，ONH胞外基質(zhì)組成發(fā)生改變以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。原發(fā)性青光眼因具有解剖學(xué)或生理學(xué)基礎(chǔ)的眼內(nèi)液體流動(dòng)紊亂造成。繼發(fā)性青光眼因眼的外傷或創(chuàng)傷或宿疾發(fā)生。原發(fā)性開角型青光眼(POAG)，也稱作慢性或單純性青光眼，占全部原發(fā)性青光眼的90%。POAG以小梁網(wǎng)的退化為特征，該退化導(dǎo)致對(duì)來自眼的液體排出有異常高的阻力。這種阻力的后果是IOP的增加，這種增加為推動(dòng)由眼正常產(chǎn)生的液體克服這種增加的阻力所需要。目前的抗青光眼療法包括通過使用房水形成抑制劑或增強(qiáng)葡萄膜鞏膜流出的藥劑降低Ι0Ρ、激光小梁成型術(shù)或作為旨在改善排出的濾過手術(shù)的小梁切除術(shù)。藥物抗青光眼方法已經(jīng)顯示出多種有害副作用。例如，縮瞳藥如毛果蕓香堿可以引起視力模糊和其它不利的視覺副作用。全身施用的碳酸酐酶抑制劑還可以引起惡心、消化不良、疲勞和代謝性酸中毒。另外，某些β-阻斷劑已經(jīng)日益與嚴(yán)重的肺部副作用相關(guān)，其原因是β-阻斷劑對(duì)肺組織中β-2受體的影響。擬交感神經(jīng)藥引起心動(dòng)過速、心律不齊和高血壓。此類副作用可以導(dǎo)致患者適從性降低或終止治療。更重要地是，目前的抗青光眼療法不直接解決持續(xù)無法緩解的對(duì)小梁網(wǎng)、視神經(jīng)的病理性損傷以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和軸突的損失。鑒于青光眼的重要性以及目前治療方法的不當(dāng)，擁有對(duì)付青光眼發(fā)展基礎(chǔ)性原因的治療青光眼的改良方法會(huì)受到歡迎。發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明涉及靶向SAA mRNA并因此干擾SAA mRNA表達(dá)的干擾RNA。本發(fā)明的干擾 RNA用于治療SAA相關(guān)性青光眼。本發(fā)明的實(shí)施方案提供減弱受試者眼中血清淀粉狀蛋白A mRNA表達(dá)的方法。該方法包括向受試者眼中施用包含有效量的19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA(如雙鏈(ds) siRNA或單鏈(ss)siRNA)和可藥用載體的組合物。雙鏈siRNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列和至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。此外，反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :3的mRNA的一部分雜交，并具有與分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域，其中SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO 3 是分別編碼 SAA1、SAA2 和 SAA4 的 DNA 的有義鏈(GenBank 參考號(hào)NM_000331、BC020795和NM_006512)。此組合物的施用減弱受試者眼中血清淀粉狀蛋白A mRNA的表達(dá)。當(dāng)干擾RNA是單鏈時(shí)，干擾RNA包含具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或 SEQ ID NO 3的mRNA的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將反義siRNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQ IDNO :1的mRNA 中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸處起始的核苷酸序列。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，將反義siRNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQ ID NO 2的mRNA中在43、 170、175、193、沈0、觀3、339或370位核苷酸處起始的核苷酸序列。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，將反義siRNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQ ID NO :2的mRNA中在252、271、276、325或343 位核苷酸處起始的核苷酸序列。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，將反義siRNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于 SEQ ID NO 3 的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、268、297、335、356、384、390、396、 406或423位核苷酸處起始的核苷酸序列。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是治療有此需要的受試者中血清淀粉狀蛋白A相關(guān)性青光眼的方法。該方法包括向受試者眼中施用包含有效量的19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾 RNA和可藥用載體的組合物，其中干擾RNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列和至少19 個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO=USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的一部分雜交，并具有與分別對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO =USEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 3的mRNA的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。血清淀粉狀蛋白A相關(guān)性青光眼因此得到治療。附圖簡(jiǎn)述

圖1提供SAAanRNA/18s rRNA比率的QPCR分析以檢查siRNA對(duì)用靶向SAA mRNA 的SMARTPOOL SiRNA轉(zhuǎn)染的NTM 765正常小梁網(wǎng)細(xì)胞中內(nèi)源性SAA mRNA的影響。 使用三個(gè)不同濃度的Dharmafect#l試劑將小梁網(wǎng)細(xì)胞用IOOnM siRNA轉(zhuǎn)染M小時(shí)Con 對(duì)照；處理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔處理的處理1 ；處理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔處理的處理 2 ；處理3 以0.4 μ 1/100 μ 1孔處理的處理3。圖2提供SAAanRNA/18s rRNA比率的QPCR分析以檢查siRNA對(duì)用靶向SAA mRNA 的SMARTPOOL siRNA轉(zhuǎn)染的GTM686青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞中內(nèi)源性SAA mRNA的影響。 使用三個(gè)不同濃度的Dharmafect#l試劑將小梁網(wǎng)細(xì)胞用IOOnM siRNA轉(zhuǎn)染M小時(shí)Con 對(duì)照；處理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔處理的處理1 ；處理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔處理的處理 2 ；處理3 以0. 4 μ 1/100 μ 1孔處理的處理3。* 通過單因素方差分析和Newman-Keuls多重比較檢驗(yàn)，相對(duì)于對(duì)照和處理Ip < 0. 05。圖3提供SAA siRNA處理對(duì)正常小梁網(wǎng)細(xì)胞(NTM 765-04)和青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞(GTM 686-03)的生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)影響的實(shí)時(shí)電子監(jiān)測(cè)(RE-CES )。使用三個(gè)不同濃度的 Dharmafect#l 試劑將細(xì)胞用 IOOnM 靶向 SAA mRNA 的SMARTPOOL siRNA 轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)T1 :0. 05 μ 1/100 μ 1 孔；Τ2 :0. 2 μ 1/100 μ 1 孔；Τ3 :0. 4 μ 1/100 μ 1 孑L。圖4提供經(jīng)siRNA處理的NTM765正常小梁網(wǎng)細(xì)胞裂解物中內(nèi)源性SAA蛋白水平的 ELISA測(cè)定結(jié)果。使用三個(gè)不同濃度的Dharmafect#l試劑將細(xì)胞用IOOnM靶向SAA mRNA 的SMARTPOOL SiRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)處理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔處理的處理1 ；處理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔處理的處理2 ；處理3 以0. 4 μ 1/100 μ 1孔處理的處理3。圖5提供經(jīng)siRNA處理的GTM686青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞裂解物中內(nèi)源性SAA蛋白水平的ELISA測(cè)定結(jié)果。使用三個(gè)不同濃度的Dharmafectiil試劑將細(xì)胞用IOOnM靶向SAA mRNA的SMARTPOOL siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)處理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔處理的處理 1 ；處理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔處理的處理2 ；處理3 以0. 4 μ 1/100 μ 1孔處理的處理3。 * 通過方差分析和Bonferroni ‘ s多重比較檢驗(yàn)，相對(duì)于對(duì)照ρ < 0. 05 ； * * 相對(duì)于對(duì)照 ρ < 0. 01。發(fā)明詳述稱作“RNAi”的RNA干擾是用于降低受單鏈或雙鏈小RNA分子作用的靶基因表達(dá)的方法。干擾RNA包括雙鏈或單鏈的小干擾RNA (ds siRNA或ss siRNA)、微RNA (miRNA)、 小發(fā)夾RNA(shRNA)及其它。不希望受理論的約束，RNA干擾似乎在體內(nèi)發(fā)生，伴隨著dsRNA 前體被切割成為長(zhǎng)度約20至25個(gè)核苷酸的小RNA。切割由RNA酶III-RNA解螺旋酶Dicer 完成。siRNA的“有義”鏈(即與靶mRNA序列完全相同的鏈)被除去，留下與靶mRNA互補(bǔ)的“反義”鏈以發(fā)揮降低mRNA表達(dá)的作用。siRNA的反義鏈似乎將稱作RISC (RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合體)的蛋白質(zhì)復(fù)合體引導(dǎo)至mRNA，該復(fù)合體隨后通過RISC的Argonaute蛋白質(zhì)切割 mRNA,因而降低通過該mRNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。干擾RNA是催化性的并且降低mRNA的表達(dá)可以用相對(duì)于mRNA而言亞化學(xué)計(jì)量數(shù)量的干擾RNA實(shí)現(xiàn)。mRNA表達(dá)的降低還可以通過翻譯和轉(zhuǎn)錄機(jī)制實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明涉及干擾RNA用于在眼病中抑制血清淀粉狀蛋白A(SAA)表達(dá)的用途。根據(jù)本發(fā)明，外源提供的siRNA在眼結(jié)構(gòu)中引起SAA mRNA沉默。本發(fā)明人先前已經(jīng)證實(shí)在青光眼性TM組織和細(xì)胞中血清淀粉狀蛋白A(SAA)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著上調(diào)(于2003 ip 12 ^ 17 HiItiiW^^ "Use of Serum Amyloid A Gene in Diagnosis and Treatment ofGlaucoma and Identification of Anti-Glaucoma Agents" W^M^i^W^H^^JΦ 請(qǐng)USSN 60/530, 430) 0本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)使用Affymetrix基因芯片通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR)觀察到差異性mRNA表達(dá)并通過SAA ELISA觀察到增加的SAA蛋白質(zhì)水平 (如上提及的懸而未決的美國(guó)專利申請(qǐng)，本文中完整地引用作為參考)。除非另外說明，本文中提及的核酸序列以5'至3'方向書寫。術(shù)語“核酸”，如本文中所用，指DNA或RNA或其修飾的形式，包含存在于DNA中的嘌呤或嘧啶堿基(腺嘌呤 “A”、胞嘧啶“C”、鳥嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”)或存在于RNA中的嘌呤或嘧啶堿基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鳥嘌呤“G”、尿嘧啶“U”)。雖然“T”堿基未天然地存在于RNA中，但本文中提供的干擾RNA包含“T”堿基，尤其在端包含“T”堿基?！昂怂帷卑ㄐg(shù)語“寡核苷酸” 和“多核苷酸”并且可以指單鏈分子或雙鏈分子。雙鏈分子通過A和T堿基、C和G堿基以及A和U堿基之間的Watson-Crick堿基配對(duì)形成。雙鏈分子的鏈可以具有彼此部分的、大部分的或完全的互補(bǔ)性并且形成雜種雙鏈體，其結(jié)合強(qiáng)度取決于堿基序列互補(bǔ)性的性質(zhì)和程度。mRNA序列通過獲知編碼該mRNA的DNA的有義鏈或反義鏈序列容易地加以確定。例如，SEQ ID NO 1提供對(duì)應(yīng)于血清淀粉狀蛋白Al mRNA的DNA的有義鏈序列。mRNA的序列與將“T”堿基換成“U”殘基后的DNA有義鏈的序列完全相同。因此，血清淀粉狀蛋白Al的 mRNA序列從SEQ ID NO 1中獲知，血清淀粉狀蛋白A2的mRNA序列從SEQ ID NO :2中獲知， 血清淀粉狀蛋白A4的mRNA序列從SEQ ID NO 3中獲知。血清淀粉狀蛋白A mRNA 人血清淀粉狀蛋白A包含眾多差異性表達(dá)的小的脫脂載脂蛋白，其由位于11號(hào)染色體短臂上的基因編碼。SAA存在四種同種型。在ncbi.nlm.nih.gov上的國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBmk數(shù)據(jù)庫提供血清淀粉狀蛋白Al的信使RNA的相應(yīng)DNA序列，參考號(hào)NM—000331，作為SEQ ID NO :1提供如下。血清淀粉狀蛋白Al的編碼序列來自核苷酸 2邪-593。SAAl :SEQ ID NO 1
6
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30
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aaggctcagt cagcacagat ctttcccaac taccattctg gcctggtttt gcgaggcttt attacatcgg gacctggggg tctttggcca gtggcaaaga cttcactctg gagagggtac aa
ataaatagca caggtgagga aagattatca aaggtgtctt ctgctccttg tgatggggct ctcagacaaa tgcctgggct tggtgcggag ccccaatcac ctctcaggag acaatgggta
gccaccgctc gcacaccaag tttcctttaa atctcctctg gtcctgggtg cgggacatgt tacttccatg gcagaagtga gactcgctgg ttccgacctg atctggctgt
cctggcaggc gagtgatttt aaaaaatagt atctagagag tcagcagccg ggagagccta ctcgggggaa tcagcgatgc ctgatcaggc ctggcctgcc gaggccctca acttaagagg
agggacccgc taaaacttac tatcctgggg caccatgaag aagcttcttt ctctgacatg ctatgatgct cagagagaat tgccaatgaa tgagaaatac gggcagggat tggaaaaaaa
agctcagcta tctgttttct catacagcca cttctcacgg tcgttccttg agagaagcca gccaaaaggg atccagagat tggggcagga tgagcttcct acaaagcggg上述SAAlmRNA序列的等效物是可變剪接形式、等位基因形式或其同族形式。同族形式是來自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的與SEQ ID N0:1同源的血清淀粉狀蛋白AlmRNA。 與SEQ ID NO 1相關(guān)的SAAl核酸序列是具有GenBank登錄號(hào)NM_009117 (來自小鼠)、NM_199161 (人轉(zhuǎn)錄變體 2)、BC007022. 1、BG533276. 1、BG567902. 1、BQ691948. 1、 CD102084. 1、M10906. 1、M23698. 1、X51439. 1、X51441. 1、X51442. 1、X51443. 1 和 X56652. 1 的那些SAAl核酸序列。GenBank數(shù)據(jù)庫提供血清淀粉狀蛋白A2的信使RNA的相應(yīng)DNA序列，參考號(hào)NM_ BC020795 JtSSEQ ID NO :2提供如下。血清淀粉狀蛋白A2的編碼序列來自核苷酸38-406。SAA2 :SEQ ID NO 2
1agggacccgcagctcagctacagcacagatcagcaccatgaagcttctcaCgggCCtggt
61tttctgctccttggtcctgagtgtcagcagccgaagcttcttttcgttccttggcgaggc
121ttttgatggggctcgggacatgtggagagcctactctgacatgagagaagccaattacat
181cggctcagacaaatacttccatgctcgggggaactatgatgctgccaaaaggggacctgg
241gggtgcctgggccgcagaagtgatcagcaatgccagagagaatatccagagactcacagg
301ccatggtgcggaggactcgctggccgatcaggctgccaataaatggggcaggagtggcag
361agaccccaatcacttccgacctgctggcctgcctgagaaatactgagcttcctcttcact
421ctgctctcaggagacctggctatgaggccctcggggcagggatacaaagttagtgaggtc
481tatgtccagagaagctgagatatggcatataataggcatctaataaatgcttaagaggtc
541上述SAA2mRNA序列的等效物是可變剪接形式、等位基因形式或其同族形式。同族形式是來自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的與SEQ ID N0:2同源的血清淀粉狀蛋白A2mRNA。與 SEQ ID NO 2相關(guān)的SAA2核酸序列是具有GenBank登錄號(hào)NM_0307M (人)、BC058008. 1、 J03474.1、L05921.1、M23699.1、M23700.1、M26152. 1、X51440. 1、X51444. 1、X51445. 1 和 X56653. 1的那些SAA2核酸序列。SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)產(chǎn)物(SAA1和SAA2)稱作急性期反應(yīng)物并且類似于C反應(yīng)蛋白，它們由促炎癥細(xì)胞因子顯著上調(diào)。SAAl和SAA2蛋白質(zhì)在氨基酸水平 93. 5%相同并且基因在核苷酸水平96. 7%相同。GenBank數(shù)據(jù)庫提供血清淀粉狀蛋白A4的信使RNA的相應(yīng)DNA序列，參考號(hào) NM_006512，作為SEQ ID NO :3提供如下。血清淀粉狀蛋白A4的編碼序列來自核苷酸 76-468。SAA4:SEQ ID NO3
1tatagctccacggccagaagataccagcagctctgcctttactgaaatttcagctggaga
61aaggtccacagcacaatgaggcttttcacaggcattgttttctgctccttggtcatggga
121gtcaccagtgaaagctggcgttcgtttttcaaggaggctctccaaggggttggggacatg
181ggcagagcctattgggacataatgatatccaatcaccaaaattcaaacagatatctctat
241gctcggggaaactatgatgctgcccaaagaggacctgggggtgtctgggctgctaaactc
301atcagccgttccagggtctatcttcagggattaatagactactatttatttggaaacagc
361agcactgtattggaggactcgaagtccaacgagaaagctgaggaatggggccggagtggc
421aaagaccccgaccgcttcagacctgacggcctgcctaagaaatactgagcttcctgctcc
481tctgctctcagggaaactgggctgtgagccacacacttctccccccagacagggacacag
541ggtcactgagctttgtgtccccaggaactggtatagggcacctagaggtg
601gtttgtcaaattgaSAA4是低水平組成型表達(dá)的基因。上述SAA4mRNA序列的等效物是可變剪接形式、 等位基因形式或其同族形式。同族形式是來自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的與SEQ ID N0:3同源的血清淀粉狀蛋白A4mRNA。與SEQID NO :3相關(guān)的SAA4核酸序列是具有GenBank登錄號(hào) BC007026、M81349. 1 和 S48983. 1 的那些 SAA4 核酸序列。減弱mRNA的表達(dá)短語“減弱mRNA的表達(dá)”，如本文中所用，意指施用一定量的干擾RNA以在細(xì)胞中引起靶基因的全長(zhǎng)mRNA水平減少，因而與具有雜亂序列的對(duì)照mRNA相比，減少mRNA翻譯成為蛋白質(zhì)。降低mRNA表達(dá)通常稱作“敲低”mRNA。通過本文中實(shí)施方案預(yù)期敲低的表達(dá)量包括并且在50%至100%之間。然而，為了本發(fā)明的目的，無需實(shí)現(xiàn)此敲低水平。此外，兩套干擾RNA可以各自適度有效地進(jìn)行敲低，然而共同施用時(shí)，可以顯著更有效地進(jìn)行敲低。 在一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)ds siRNA有效地敲低達(dá)70%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩種或多種 ds siRNA共同有效地敲低達(dá)70%。敲低通常由通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR)擴(kuò)增測(cè)定的mRNA水平或通過蛋白質(zhì)印跡或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定的蛋白質(zhì)水平測(cè)量。蛋白質(zhì)水平的分析提供對(duì)因 RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合體(RISC)和翻譯抑制所致的mRNA降解的評(píng)估。其它用于測(cè)量敲低的技術(shù)包括RNA溶液雜交、核酸酶保護(hù)、RNA印跡雜交、逆轉(zhuǎn)錄、用微陣列監(jiān)測(cè)基因表達(dá)、抗體結(jié)合、放射免疫測(cè)定和熒光激活的細(xì)胞分析。 SAA的抑制還在人或哺乳動(dòng)物中因觀察到青光眼癥狀的改善，例如眼內(nèi)壓力的改善、視野損失的改善或視神經(jīng)頭改變的改善加以推測(cè)。本發(fā)明實(shí)施方案的干擾RNA以催化方式起作用，即干擾RNA能夠以化學(xué)計(jì)量的量實(shí)現(xiàn)靶mRNA的抑制。與反義治療相比，需要顯著較少量的干擾RNA以產(chǎn)生治療效果。雙鏈干擾RNA 雙鏈干擾RNA(又稱作ds siRNA)，如本文中所用，具有有義核苷酸序列和反義核苷酸序列，有義序列和反義序列包含至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。干擾RNA 的長(zhǎng)度包含19至49個(gè)核苷酸，并且可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 或 49 個(gè)核苷酸。ds siRNA 的反義序列在生理?xiàng)l件下與SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的一部分雜交，并且具有與分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的雜交部分有至少19 個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。siRNA的反義鏈?zhǔn)莝iRNA活性的定向劑，因?yàn)榉戳x鏈結(jié)合至細(xì)胞內(nèi)的RISC復(fù)合體， 并引導(dǎo)結(jié)合的復(fù)合體在與反義RNA序列互補(bǔ)的序列處特異性地結(jié)合至mRNA，因而允許隨后通過結(jié)合的復(fù)合體切割mRNA。用來選擇siRNA 的靶序列的技術(shù)通過 Tuschl，Τ.等“The siRNA UserGuide”(2004 年5月6日修訂，在洛克菲勒大學(xué)網(wǎng)站上可獲得)、通過Ambion公司網(wǎng)站上的506號(hào)技術(shù)公報(bào)“siRNA Design Guidelines”、通過 Invitrogen 網(wǎng)站(使用參數(shù)G/C 含量最小 35%，最大55% )以及通過Dharmacon網(wǎng)站提供。靶序列可以位于mRNA的編碼區(qū)內(nèi)或5'或3'非翻譯區(qū)內(nèi)。用于SAAl的DNA靶序列的實(shí)施方案存在于SEQ ID NO 1的核苷酸531至549處5' -TGGGGCAGGAGTGGCAAAG-3‘ SEQ ID NO :4。用于靶向SEQ DD NO 4的相應(yīng)mRNA序列并在每一鏈上具有3' UU突出端的本發(fā)明雙鏈siRNA是5' -UGGGGCAGGA⑶GGCAAA⑶U-3‘ SEQ ID NO 53' -UUACCCCGUCCUCACC⑶UUC-5‘ SEQ ID NO :6。該3'突出端可以具有多個(gè)“U”殘基，例如在2、3、4、5和6間并包含2、3、4、5和6 個(gè)的多個(gè)“U”殘基。5'端還可以具有5'核苷酸突出端。用于靶向SEQ DD NO :4的相應(yīng)mRNA序列并在每一鏈上具有3' TT突出端的本發(fā)明雙鏈siRNA是5' -UGGGGCAGGA⑶GGCAAAGTT-3‘ SEQ ID NO 73' -TTACCCCGUCCUCACC⑶UUC-5‘ SEQ ID NO :8。雙鏈siRNA的鏈可以通過發(fā)夾環(huán)連接以形成如下單鏈siRNA
權(quán)利要求
1.包含有效量的19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA以及可藥用載體的組合物在制造用于治療有此需要的受試者中血清淀粉狀蛋白A相關(guān)性青光眼的藥物中的用途；所述干擾 RNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列以及在有義序列和反義序列間有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的一部分雜交，并具有與分別對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO =USEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 3的mRNA的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1中所述的用途，其中組合物經(jīng)局部途徑、玻璃體內(nèi)途徑或經(jīng)鞏膜途徑施用。
3.如權(quán)利要求1中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID N0:1的 mRNA中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸處起始的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO 2的 mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸處起始的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸處起始的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求1中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO 3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、洸8、四7、335、；356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸處起始的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求1中所述的用途，其還包括向受試者眼中施用第二干擾RNA，所述第二干擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列以及在有義序列和反義序列間有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中第二干擾RNA的反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的mRNA的第二部分雜交，并且具有與分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA的第二雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。
8.如權(quán)利要求1中所述的用途，其中組合物包含有效量的至少四種干擾RNA的混合物和可藥用載體，其中每一干擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且每一干擾RNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列以及在四種干擾RNA的每一干擾RNA的有義序列和反義序列間有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中混合物的反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2的mRNA中分別在175、252、276和325位核苷酸處起始的一部分雜交， 并具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 2的mRNA中分別在175、252、276和325位核苷酸處起始的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。
9.包含有效量的19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA和可藥用載體的組合物在制造用于治療有此需要的受試者中血清淀粉狀蛋白A相關(guān)性青光眼的藥物中的用途；其中干擾RNA 包含具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1、SEQID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA中的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求9中所述的用途，其中組合物經(jīng)局部途徑、玻璃體內(nèi)途徑或經(jīng)鞏膜途徑施用。
11.如權(quán)利要求9中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO=I的 mRNA中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸處起始的核苷酸序列。
12.如權(quán)利要求9中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO 2的mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸處起始的核苷酸序列。
13.如權(quán)利要求9中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO 2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸處起始的核苷酸序列。
14.如權(quán)利要求9中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、洸8、四7、335、；356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸處起始的核苷酸序列。
15.如權(quán)利要求9中所述的用途，其還包括向受試者眼中施用第二干擾RNA，所述第二干擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并包含具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或 SEQ ID NO 3的mRNA中的第二雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域的第二核苷酸序列。
16.如權(quán)利要求9中所述的用途，其中組合物包含有效量的至少四種干擾RNA的混合物，每一干擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且混合物包含具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 2 的mRNA中的分別在175、252、276和325位核苷酸處起始的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域的第一、第二、第三和第四核苷酸序列。
17.包含有效量的19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA以及可藥用載體的組合物在制造用于減弱受試者眼中血清淀粉狀蛋白A mRNA表達(dá)的藥物中的用途；所述干擾RNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列以及在有義序列和反義序列間有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2或 SEQID NO :3的mRNA的一部分雜交，并具有與分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的mRNA的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。
18.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中受試者患有青光眼。
19.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中受試者具有發(fā)展成為青光眼的風(fēng)險(xiǎn)。
20.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中反義序列具有與對(duì)應(yīng)于SEQIDNO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA的雜交部分有至少21至23個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域，并且在有義序列和反義序列各自的3’端包含額外的TT序列。
21.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中有義核苷酸序列和反義核苷酸序列由核苷酸序列環(huán)連接。
22.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中將組合物制備成用于經(jīng)局部途徑、玻璃體內(nèi)途徑或經(jīng)鞏膜途徑的施用。
23.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中將反義序列設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :1的 mRNA中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸處起始的核苷酸序列。
24.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中將反義序列設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :2的 mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸處起始的核苷酸序列。
25.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中將反義序列設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸處起始的核苷酸序列。
26.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中將反義序列設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、洸8、四7、335、；356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸處起始的核苷酸序列。
27.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中反義序列包含CUUUGCCA⑶CCUGCCCCA(SEQID NO 37)、UCGGAAGUGAUUGGGGUCU (SEQ ID NO 38)、UUUGUCUGAGCCGAUGUAA (SEQ IDNO 39)、AACCAGGCCCGUGAGAAGC(SEQ ID NO :40)、CUGAGCCGAUGUAAUUGGC(SEQIDNO41)、GCCACUCCUGCCCCAUUUA(SEQ IDNO:69)、CCCCCGAGCAUGGAAGUAU (SEQIDNO42)、CUCUGGCAUUGCUGAUCAC(SEQ IDNO:43)、GCCUGUGAGUCUCUGGAUA(SEQIDNO44)、GCCACUCCUGCCCCAUUUA(SEQ IDNO:45)、GCCAGCAGGUCGGAAGUGA(SEQIDNO46)、AGUCUCUGGAUAUUCUCUC(SEQ IDNO:47)、UUUAUUGGCAGCCUGAUCG (SEQIDNO48)、UUGCUGAUCACUUCUGCGG (SEQIDNO 49)、CUGGAUAUUCUCUCUGGCA(SEQIDNO:50)、UCUGCCACUCCUGCCCCAU(SEQIDNO:51)、AACCCCUUGGAGAGCCUCC(SEQIDNO:52)、UGCCCAUGUCCCCAACCCC(SEQIDNO:53)、AUAGAGAUAUCUGUUUGAA(SEQIDNO:54)、CGAGCAUAGAGAUAUCUGU(SEQIDNO:55)、CUUUGGGCAGCAUCAUAGU(SEQIDNO :56)、AGACACCCCCAGGUCCUCU(SEQIDNO:57)、CCUGGAACGGCUGAUGAGU(SEQIDNO ；:58)、CCAAAUAAAUAGUAGUCUA(SEQIDNO:59)、UCCAAUACAGUGCUGCUGU(SEQIDNO:60)、CUCAGCUUUCUCGUUGGAC(SEQIDNO:61)、CCAUUCCUCAGCUUUCUCG(SEQIDNO :62)、CCGGCCCCAUUCCUCAGCU(SEQIDNO 63)、CUUUGCCACUCCGGCCCCA(SEQ ID NO :64)或UCUGAAGCGGUCGGGGUCU(SEQ ID NO :65)。
28.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中干擾RNA包含在堿基部分、在糖部分或在磷酸部分上的修飾。
29.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中組合物還包含第二干擾RNA，所述第二干擾RNA 具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列以及在有義序列和反義序列間有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中第二干擾RNA的反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA的第二部分雜交， 并且具有與分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3的mRNA的第二雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。
30.如權(quán)利要求17中所述的用途，其中組合物包含有效量的至少四種干擾RNA的混合物和可藥用載體，其中每一干擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且每一干擾RNA包含有義核苷酸序列、反義核苷酸序列以及在四種干擾RNA的每一干擾RNA的有義序列和反義序列間有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域；其中混合物的反義序列在生理?xiàng)l件下與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2的mRNA中分別在175、252、276和325位核苷酸處起始的一部分雜交，并具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2的mRNA中分別在175、252、276和325位核苷酸處起始的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域。
31.包含有效量的19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的干擾RNA和可藥用載體的組合物在制造用于減弱受試者眼中血清淀粉狀蛋白A mRNA表達(dá)的藥物中的用途；其中干擾RNA包含具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA中的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域的核苷酸序列。
32.如權(quán)利要求31中所述的用途，其中將組合物制備成用于經(jīng)局部途徑、玻璃體內(nèi)途徑或經(jīng)鞏膜途徑施用。
33.如權(quán)利要求31中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID N0:1的 mRNA 中在 230、357、362、380、447、470、527、531、548 或 557 處開始的核苷酸序列。
34.如權(quán)利要求31中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :2的mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸處起始的核苷酸序列。
35.如權(quán)利要求31中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸處起始的核苷酸序列。
36.如權(quán)利要求31中所述的用途，其中將干擾RNA設(shè)計(jì)成靶向?qū)?yīng)于SEQID NO :3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、268、297、3；35、356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸處起始的核苷酸序列。
37.如權(quán)利要求31中所述的用途，其中組合物還包含第二干擾RNA，所述第二干擾RNA 具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并包含具有與對(duì)應(yīng)于SEQID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 3的mRNA中的第二雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域的第二核苷酸序列。
38.如權(quán)利要求31中所述的用途，其中組合物包含有效量的至少四種干擾RNA的混合物，每一干擾RNA具有19至49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，并且混合物包含具有與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 2 的mRNA中的分別在175、252、276和325位核苷酸處起始的雜交部分有至少19個(gè)核苷酸接近完全連續(xù)互補(bǔ)的區(qū)域的第一、第二、第三和第四核苷酸序列。
39.權(quán)利要求17至38中任一項(xiàng)所述的用途，其中受試者患有血清淀粉狀蛋白A相關(guān)性青光眼。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療青光眼的血清淀粉狀蛋白A的RNAi抑制。本發(fā)明提供用于在涉及SAA表達(dá)的青光眼中抑制血清淀粉狀蛋白A mRNA表達(dá)的RNA干擾。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102172407SQ20111003534
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者A·F·克拉克, L·麥克納特, 王萬恒 申請(qǐng)人:愛爾康公司