專利名稱：產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基丙酸共聚物的重組菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程菌，尤其涉及一種產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基丙酸共聚物的重組菌及其應(yīng)用。聚羥基烷酸(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是由許多微生物在不平衡生長條件下在胞內(nèi)積累的，具有熱可塑性、生物相容性、光學(xué)活性和壓電特性等優(yōu)良性能的一類聚合物，在自然界中可被微生物完全降解生成水和二氧化碳。它完全有可能取代日益嚴(yán)重污染
環(huán)境的化學(xué)塑料，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、精細(xì)化學(xué)等方面也極具有應(yīng)用價值。其結(jié)構(gòu)式如式I所示
權(quán)利要求
1.重組菌的一種構(gòu)建方法，包括如下步驟將1，3-丙二醇脫氫酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因、3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因和PHA聚合酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌，得到重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述1，3-丙二醇脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列10 ； 所述醛脫氫酶的氨基酸序列為序列表中序列11 ； 所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶的氨基酸序列為序列表中序列12 ； 所述PHA聚合酶的氨基酸序列為序列表中序列13。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述1，3-丙二醇脫氫酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1 ； 所述醛脫氫酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ； 所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3 ； 所述PHA聚合酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4 ；所^！出發(fā)菌為大腸桿菌，具體為 Escherichia coli Trans 5 α、Escherichia coliTransl-Tl 5 Escherichia coli S17_l。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述1，3_丙二醇脫氫酶編碼基因和所述醛脫氫酶編碼基因通過重組載體A導(dǎo)入所述出發(fā)菌中；所述3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因和所述PHA聚合酶編碼基因通過重組載體B 導(dǎo)入所述出發(fā)菌中；所述重組載體A為將啟動子PKe插入pZL-dhaT-aldD的多克隆識別位點得到的載體； 所述重組載體B為將3-羥基丙酸輔酶A的編碼基因插入到pBHR68的多克隆識別位點得到的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于 所述啟動子Plte的核苷酸序列為序列表中的序列5。
6.由權(quán)利要求1-5中任一所述的方法構(gòu)建的重組菌。
7.—種生產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基丙酸共聚物的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求6所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基丙酸共聚物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵溫度為30°C -40°C;所述發(fā)酵的溶氧量為10% -30% (體積百分含量)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為6-8 ；所述發(fā)酵溫度具體為30°C、37°C或40°C ；所述發(fā)酵的溶氧量具體為10^^20%或30% (體積百分含量)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH具體為6、7或8 ；所述發(fā)酵過程中，在所述重組菌進入穩(wěn)定期起至發(fā)酵結(jié)束，向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中分批補加1，3-丙二醇和/或1，4- 丁二醇，使每L發(fā)酵產(chǎn)物中的1，3-丙二醇或1，4- 丁二醇含量均不高于30g。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述每L發(fā)酵產(chǎn)物中的1，3_丙二醇或1，4_ 丁二醇含量均為lg/L-30g/L ；所述每L發(fā)酵產(chǎn)物中的1，3-丙二醇或1，4_ 丁二醇含量均具體為lg/L-10g/L、10g/ L-20g/L 或 20-30g/L ；所述發(fā)酵時間為32h-50h，所述發(fā)酵時間具體為3 !、44h或50h ； 所述3-羥基丙酸共聚物為3-羥基丙酸和4-羥基丁酸共聚物。
10. 一種生產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基丙酸共聚物的載體組合物，由權(quán)利要求4所述的方法中的重組載體A和重組載體B組成；所述3-羥基丙酸共聚物為3-羥基丙酸和4-羥基丁酸共聚物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)3-羥基丙酸均聚物和/或3-羥基丙酸共聚物的重組菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組菌的一種構(gòu)建方法，包括如下步驟將1，3-丙二醇脫氫酶編碼基因、醛脫氫酶編碼基因、3-羥基丙酸輔酶A連接酶編碼基因和PHA聚合酶編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌，得到重組菌。本發(fā)明的實驗證明該工程菌可高效表達3-羥基丙酸輔酶A連接酶及PHA聚合酶基因，使3-羥基丙酸經(jīng)過3-羥基丙酰輔酶A最終被聚合為3-羥基丙酸均聚物(P(3HP))。小型發(fā)酵罐實驗表明將本發(fā)明的工程菌在6L發(fā)酵罐中發(fā)酵后，P(3HP)的產(chǎn)量最高可達8.9g/L以上，P(3HP)最高可達細(xì)胞干重的91.5％。且本發(fā)明的生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12P7/62GK102174542SQ20111004472
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者吳瓊, 周琴, 孟德川, 石振宇, 陳國強, 陳金春 申請人:清華大學(xué)