專利名稱：一種轉(zhuǎn)Bar基因水稻的溯源檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)Bar基因水稻及其初級加工品的安全與溯源檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)Bar基因水稻的溯源檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們對健康、環(huán)保和食品安全意識的提高，食品的溯源與安全檢測技術(shù)特別是轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)已成為亟需解決的問題。我國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國，常年水稻種植面積約3000萬公頃以上，占世界水稻總種植面積的20%，稻谷總產(chǎn)近20000萬噸，占世界稻谷總產(chǎn)的35. 7%，同時我國也是世界上最大的稻米消費國， 稻米產(chǎn)量對我國乃至世界農(nóng)業(yè)的穩(wěn)定有著極為重要的影響。由于常規(guī)育種難以克服物種親緣界限，難以滿足多樣化發(fā)展的需求，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破物種界限，實現(xiàn)傳統(tǒng)育種技術(shù)所不能做到的物種間的基因轉(zhuǎn)移，是近些年來的發(fā)展熱點也是未來的發(fā)展趨勢。2009年11 月27日，中國做出一項里程碑式的決定為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的兩種轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”頒發(fā)轉(zhuǎn)基因水稻安全證書，這對其他類型轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)展亦有著非凡的意義，而世界首例商業(yè)化轉(zhuǎn)基因水稻為轉(zhuǎn)Bar基因水稻，我國轉(zhuǎn)Bar基因水稻也因其擁有良好的應(yīng)用前景，已被批準進入環(huán)境釋放階段。但隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商品化速度的日益加快，社會公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性和風(fēng)險的關(guān)注程度與日俱增，同時近年國內(nèi)外的非法轉(zhuǎn)基因水稻污染事件時有發(fā)生，如2006年在香港及廣州市場發(fā)現(xiàn)亨氏嬰兒營養(yǎng)米粉中含有非法轉(zhuǎn)基因水稻成分。一直以來，我國對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的監(jiān)管十分重視，2002年衛(wèi)生部頒布了《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》，要求對轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品進行定性檢測，規(guī)定食品產(chǎn)品(包括原料及其加工的食品)中若含有基因修飾有機體或/和表達產(chǎn)物的，要進行標注，而同年開始實施的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》也明確指出“凡是列入標識管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)當進行標識；未標識和不按規(guī)定標識的，不得進口或銷售。”檢測是監(jiān)管的前提，因此有必要在轉(zhuǎn)Bar基因水稻商品化之前建立起一套有效的檢測措施，以配合未來的監(jiān)管工作，而PCR檢測技術(shù)是目前國際上主流的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)，但普通單重PCR檢測效率偏低，難以滿足實際檢測中高通量的需求，巢式PCR雖然具有高效率，但對于實驗條件及操作人員的技術(shù)要求較高，因此開發(fā)一種簡單、準確、高效的轉(zhuǎn) Bar基因稻米多重PCR檢測方法就顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種準確、簡捷、快速的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的溯源檢測方法。本發(fā)明采用的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，包括如下步驟(1)提取水稻基因組DNA ；(2)以步驟(1)提取的水稻基因組DNA為模板，對35S啟動子、NOS終止子、SPS水稻內(nèi)源基因、Bar基因進行多重PCR擴增；(3)將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，并根據(jù)電泳結(jié)果判定樣品判斷是否屬于轉(zhuǎn)Bar基因水稻或轉(zhuǎn)Bar基因水稻制品；其中，所述的多重PCR擴增引物為
3 5 S-F5，-TAAC AGAACTCGCCGTAAAG-3，SEQ ID No. 13 5 S-R5，-ATAGTGGGATTGTGCGTC AT-3，SEQ ID No.2NOS-F5，-AAGATTGAATCCTGTTGCCG-3，SEQIDNo.3NOS-R5，-TAGTAAC ATAGATGACACCG-3，SEQ ID No.4Bar-F5，--CC AGAAACCC ACGTC ATGCC-3，SEQ ID No. 5Bar-R5，-C AGGAACCGC AGGAGTGGA-3，SEQIDNo.6SPS-F5，-TTGCGCCTGAACGGATAT-3 ‘SEQIDNo.7SPS-R5，-GGAGAAGC ACTGGACGAGG-3，SEQ ID No. 8。所述判斷依據(jù)為如果凝膠電泳能夠檢測出35S啟動子、Bar基因或NOS終止子以及SPS水稻內(nèi)源基因特異性擴增產(chǎn)物條帶則說明該樣品為轉(zhuǎn)Bar基因水稻或轉(zhuǎn)Bar基因水稻。所述的多重PCR擴增反應(yīng)體系為12. 5 μ L預(yù)混液，濃度均為10 μ mol/L的35S， NOS, Bar, SPS 引物分別為 0. 5,0. 5,0. 2，1. 0 μ L，IOOng 模板 DNA,加無菌水至 25 μ L ；其中所述的預(yù)混液由 12. 5U 的 DNA 聚合酶；dNTP 各 0. 4mmol/L ；50mmol/L KCl ； IOmmol/L Tris-HCl (pH8. 4) ；1. 5mmol/L MgCl2 組成。所述的多重PCR擴增反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 5min;變性94°C lmin，退火57°C lmin，延伸 72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C延伸 7min。所述的水稻基因組DNA提取包括以下步驟(A)稱取2011^樣品，粉碎后置于1.51^離心管中，加入20μ L 0. 25mol/L NaOH溶液，95°C 20s ；(B)加入 150 μ L 0. 25mol/L HCL 溶液和 150 μ L 0. 5mol/L Tris-HCL (pH = 8· 0)， 85 °C 3min ；(C)加入400 μ L的三氯甲烷，顛倒混勻離心管2-3次，靜置10min ； 12000g離心 5min,上清液即為水稻基因組DNA提取液。DNA提取也可按照“GB/T 19495. 3-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法”提取。步驟(1)提取的水稻基因組DNA提取液中水稻基因組20ng/μ 1以上，純度達到在 Α260/280在1. 5-2. 0之間才能作為步驟O)多重PCR擴增反應(yīng)模板。所述的樣品為水稻稻米或稻米的初級加工品。所述的稻米的初級加工品為初級加工品為大米、米粉、米飯、米線、米酒酒糟等。所述步驟(3)中使用的凝膠電泳為使用3.0%的瓊脂糖凝膠在85V條件下電泳 30mino
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明針對轉(zhuǎn)Bar基因稻米的35S啟動子、NOS終止子、 SPS水稻內(nèi)源基因、Bar基因設(shè)計了特異性引物，利用這四對引物對待檢樣品的DNA提取液進行四重PCR可以一次性完成目標基因的擴增，從而判定待測樣品是否為轉(zhuǎn)bar基因水稻或轉(zhuǎn)bar基因水稻制品。本發(fā)明檢測方法是一種bar基因的高通量檢測方法，在保證檢測準確性的同時，能一次性完成對轉(zhuǎn)Bar基因稻米的定性檢測，操作簡單，減少了假陽性檢測結(jié)果，縮短了檢測時間，降低了檢測成本，具有實際意義。


圖1、陽性樣品(轉(zhuǎn)Bar基因米粉)的四重PCR檢測結(jié)果。M :DL2000 ；K 空白對照；N 陰性樣品；T 陽性樣品。圖2、轉(zhuǎn)Bar基因酒糟四重PCR檢測結(jié)果。M :DL2000 ；K 空白對照；N 陰性樣品；S 轉(zhuǎn)Bar基因酒糟；T 陽性樣品。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明展開進一步的說明實施例11、實驗材料陽性樣品由香125S/Bar68-l抗除草劑轉(zhuǎn)基因稻(中科院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所)制作的米粉；陰性樣品武育粳3號(江蘇省農(nóng)墾米業(yè)有限公司)；待檢樣品1 由轉(zhuǎn)Bar基因水稻制作的酒糟；試劑GoTaqGreen Master Mix(2X), DL2000 分子質(zhì)量標準。2、實驗儀器儀器穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(DY602S，生興生物技術(shù)有限公司)；凝膠成像儀 (Universal HoodII型，BIO-RAD公司)；高速臺式離心機(TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)；核酸蛋白分析儀(NAN0DR0P-2000,Thermo Scientific公司)；基因擴增儀(9902型， Applied Biosystems ) ；巨(SG403AM, The Baker company)。3、實驗具體步驟(1)模板DNA的提取(A)稱取20mg樣品(陰性材料及陽性材料需粉碎至8目以上)置于1. 5mL離心管中，加入 200yL 0. 25mol/LNa0H 溶液，95°C 20s ； (B)加入 150yL 0. 25mol/LHCL 溶液和 150 μ L 0. 5mol/LTris-HCL (pH = 8. 0),85 °C 3min ； (C)加入 400 μ L 的三氯甲烷，顛倒混勻離心管2-3次，靜置IOmin ； 12000g離心5min，上清液可作PCR模板。以無菌水代替樣品為
空白對照。(2) DNA樣品濃度的測定 用NAN0DR0P-2000核酸蛋白分析儀檢測所提DNA模板的質(zhì)量濃度和純度。
陰性樣品DNA模板的質(zhì)量濃度為38. 5ng/ μ 1，Α260/280為1. 61 ；陽性樣品DNA模板的質(zhì)量濃度為42. 2ng/y 1, A260/280為1. 73 ；待檢樣品DNA模板的質(zhì)量濃度為40. 7ng/ μ 1，Α260/280 為 1. 58。
(3) PCR擴增反應(yīng)依次添加反應(yīng)體系12. 5 μ L預(yù)混液(包括12. 5U的DNA聚合酶，dNTP各0. 4mmol/ L，2XPCR緩沖液)；35S, NOS, Bar, SPS引物分別為0. 5，0. 5，0. 2，1. 0 μ L(引物濃度均為 10 μ mol/L)，IOOng DNA 模板，加無菌水至 25 μ L。引物信息如下表
權(quán)利要求
1. 一種轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，包括如下步驟(1)提取水稻基因組DNA；(2)以步驟(1)提取的水稻基因組DNA為模板，對35S啟動子、NOS終止子、SPS水稻內(nèi)源基因、Bar基因進行多重PCR擴增；(3)將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，并根據(jù)電泳結(jié)果判斷樣品是否屬于轉(zhuǎn)Bar基因水稻或轉(zhuǎn)Bar基因水稻制品；其特征在于所述的多重PCR擴增引物為3 5 S-F5，-TAAC AGAACTCGCCGTAAAG-3，SEQ ID No. 13 5 S-R5，-ATAGTGGGATTGTGCGTC AT-3，SEQ ID No.2NOS-F5，·-AAGATTGAATCCTGTTGCCG-3 ‘SEQIDNo.3NOS-R5，-TAGTAAC ATAGATGACACCG-3，SEQ ID No.4Bar-F5，--CC AGAAACCC ACGTC ATGCC-3，SEQ ID No. 5Bar-R5，-C AGGAACCGC AGGAGTGGA-3，SEQIDNo.6SPS-F5，-TTGCGCCTGAACGGATAT-3 ‘SEQIDNo.7SPS-R5，-GGAGAAGC ACTGGACGAGG-3，SEQ ID No. 8所述判斷依據(jù)為如果凝膠電泳能夠檢測出35S啟動子、Bar基因或NOS終止子以及 SPS水稻內(nèi)源基因特異性擴增產(chǎn)物條帶則說明該樣品為轉(zhuǎn)Bar基因水稻或轉(zhuǎn)Bar基因水稻制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，其特征在于所述的多重PCR擴增反應(yīng)體系為12. 5 μ L預(yù)混液，濃度均為10 μ mol/L的35S，NOS, Bar, SPS 引物分別為0. 5,0. 5,0. 2，1. 0 μ L，IOOng模板DNA，加無菌水至25 μ L ；其中所述的預(yù)混液由 12. 5U 的 DNA 聚合酶；dNTP 各 0. 4mmol/L ；50mmol/L KCl ； 10mmol/L pH8. 4 Tris-HCl ； 1. 5mmol/L MgCl2 組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，其特征在于所述的多重PCR擴增反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 5min;變性94°C lmin，退火57°C lmin，延伸72°C lmin，40 個循環(huán)；72°C延伸 7min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，其特征在于所述的水稻基因組DNA提取包括以下步驟(A)稱取20mg樣品，粉碎后置于1.5mL離心管中，加入200 μ L 0. 25mol/L NaOH溶液， 95°C 20s ；(B)加入150 μ L 0. 25mol/L HCL溶液和 150 μ L 0. 5mol/L ρΗ8· OTris-HCL, 85°C 3min ；(C)加入400μ L的三氯甲烷，顛倒混勻離心管2-3次，靜置IOmin ； 12000g離心5min， 上清液即為水稻基因組DNA提取液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，其特征在于步驟 (1)提取的水稻基因組DNA濃度達到20ng/l·! 1以上，純度達到在A26(V280在1. 5-2. 0之間才能作為步驟(2)多重PCR擴增反應(yīng)模板。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，其特征在于所述的樣品為水稻稻米或稻米的初級加工品。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，其特征在于所述的稻米的初級加工品為大米、米飯、米粉、米線或米酒酒糟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)Bar基因水稻的多重PCR溯源檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中使用的凝膠電泳為使用3. 0%的瓊脂糖凝膠在85V條件下電泳30min。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)Bar基因水稻及其初級加工品的安全與溯源檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種轉(zhuǎn)Bar基因水稻的溯源檢測方法。該檢測方法包括如下步驟(1)提取水稻基因組DNA；(2)利用引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.8以步驟(1)提取的水稻基因組DNA為模板，對35S啟動子、NOS終止子、SPS水稻內(nèi)源基因、Bar基因進行多重PCR擴增；(3)將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，分析并判斷結(jié)果。本發(fā)明具有高通量的特點，在保證檢測準確性的同時，能一次性完成對轉(zhuǎn)Bar基因稻米的定性檢測，操作簡單，減少了假陽性檢測結(jié)果，縮短了檢測時間，降低了檢測成本，具有實際意義。
文檔編號C12Q1/68GK102154491SQ20111005425
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者周光宏, 宋尚新, 沈崇鈺, 肖紅梅, 邱良焱, 高峰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)