專(zhuān)利名稱：人淋巴細(xì)胞抑制性受體基因ctla-4和pd-1的6條序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，6個(gè)基因靶點(diǎn)序列具有能特異結(jié)合核酸藥物的功能，對(duì)核酸類(lèi)藥物先導(dǎo)物的設(shè)計(jì)在腫瘤治療、和在免疫相關(guān)疾病調(diào)節(jié)治療中基因干預(yù)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞増殖失能直接導(dǎo)致免疫低下，而CTLA-4抑制性受體表達(dá)是増殖失能的直接原因。因此降低CTLA-4的表達(dá)可提高T免疫細(xì)胞増殖因而提高細(xì)胞免疫功能。淋巴細(xì)胞凋亡也導(dǎo)致免疫低下，τ淋巴細(xì)胞ro-i的表達(dá)引起τ淋巴細(xì)胞凋亡造成免疫失能，引起感染和腫瘤細(xì)胞發(fā)生。因此抑制T淋巴細(xì)胞的ro-i，可以強(qiáng)化免疫細(xì)胞識(shí)別 殺滅新生感染原和腫瘤細(xì)胞，保持機(jī)體正常。因此，以CTLA-4和Η)-1兩個(gè)抑制性受體為靶進(jìn)行藥物研發(fā)，對(duì)免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療具有很好的臨床治療意義和前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用技術(shù)(在申請(qǐng)專(zhuān)利)，從人CTLA-4和TO-Ι兩個(gè)基因篩選出6個(gè)序列，這些序列經(jīng)過(guò)驗(yàn)證能高效結(jié)合寡核苷酸藥物，可以用作藥物研發(fā)設(shè)計(jì)候選結(jié)構(gòu)應(yīng)用。


圖I :靶點(diǎn)1-3的結(jié)合能力圖(#1，#2，#3分別表示1，2，3靶點(diǎn)處的切割反應(yīng))圖2 :靶點(diǎn)1-3的細(xì)胞內(nèi)作用結(jié)果(流式細(xì)胞儀分析CTLA-4受體表達(dá))圖3 :4_6號(hào)靶點(diǎn)(即TO-Ι靶點(diǎn)1-3)的結(jié)合能力圖(AS1#，2#, 3#分別表示I3D-I的1，2，3靶點(diǎn)切割效果，AS對(duì)照為非靶點(diǎn)處的切割效果)圖4 =PD-I靶點(diǎn)1-3的細(xì)胞內(nèi)作用結(jié)果(RT-PCR分析H)_l受體表達(dá))(1-4分別表示I3D-I未處理細(xì)胞mRNA的RT PCR擴(kuò)增的分別擴(kuò)增35、33、31、28循環(huán)產(chǎn)物，5表示TO-Ι經(jīng)非靶點(diǎn)對(duì)照表達(dá)Ribozyme慢病毒處理細(xì)胞mRNA的RT PCR擴(kuò)增25循環(huán)的產(chǎn)物，6-8分別表示I3D-I經(jīng)靶點(diǎn)1、2、3構(gòu)建表達(dá)Ribozyme慢病毒處理細(xì)胞mRNA的RTPCR擴(kuò)增25循環(huán)的產(chǎn)物。6-8表明與5號(hào)對(duì)照組相比靶點(diǎn)均有效抑制并降低了基因的表達(dá)，3號(hào)抑制效果最強(qiáng)，2號(hào)其次，I號(hào)尚可。圖中M表示DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，最小帶型為IOOObp)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施的實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果(結(jié)合附圖闡述)I. 1-3號(hào)靶點(diǎn)對(duì)CTLA-4 mRNA作用及性能I、1-3靶點(diǎn)對(duì)CTLA-4基因mRNA分子的作用經(jīng)過(guò)液相固定mRNA和文庫(kù)雜交篩選，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)相關(guān)反義核酸結(jié)合RNase H切割驗(yàn)證，與對(duì)照反義核酸相比3個(gè)靶點(diǎn)的反義核酸均能誘導(dǎo)RNase H對(duì)基因mRNA發(fā)生切割；同時(shí)經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)DNAzyme直接切割驗(yàn)證，結(jié)果對(duì)照DNAzyme相比3個(gè)靶點(diǎn)的DNAzyme均能對(duì)基因mRNA發(fā)生切割。因此獲得CTLA-4基因3條靶點(diǎn)序列為有效靶點(diǎn)(如圖I)。2、祀點(diǎn)1-3設(shè)計(jì)的Ribozyme通過(guò)制備慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，生產(chǎn)包裝了質(zhì)粒的病毒，分別感染CTLL-2細(xì)胞，對(duì)照組和1，2，3號(hào)慢病毒表達(dá)Ribozyme對(duì)熒光素標(biāo)記CTLA-4抗體標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果1，2，3靶點(diǎn)在作用48hr細(xì)胞CTLA-4表達(dá)水平均有效降低，分別達(dá)對(duì)照組的38%，33%和36%水平。因此獲得1-3靶點(diǎn)序列為有效(如圖2)。2. 4-6號(hào)靶點(diǎn)對(duì)ro-1 mRNA作用及性能3、4-6靶點(diǎn)對(duì)基因TO-Ι的mRNA分子作用經(jīng)過(guò)液相固定mRNA和文庫(kù)雜交篩選，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)相關(guān)反義核酸結(jié)合RNase H切割驗(yàn)證，與對(duì)照反義核酸相比3個(gè)靶點(diǎn)的反義核酸均能誘導(dǎo)RNase H對(duì)基因mRNA發(fā)生切割。因此獲得I3D-I基因3條靶點(diǎn)序列為有效靶點(diǎn) (如圖3)。4、4-6革巴點(diǎn)(即F1D-I革巴點(diǎn)1-3)設(shè)計(jì)的Ribozyme通過(guò)制備慢病毒表達(dá)質(zhì)粒,生產(chǎn)包裝了質(zhì)粒的病毒，分別在24孔培養(yǎng)板中感染Jurket淋巴細(xì)胞(每孔細(xì)胞數(shù)為30000個(gè))，培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞、提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定TO-Ι的表達(dá)，對(duì)照組和I3D-I的1，2，3號(hào)慢病毒表達(dá)Ribozyme對(duì)Jurket細(xì)胞TO-I表達(dá)水平均有效降低。因此獲得4_6靶點(diǎn)序列為有效(如圖4)。
權(quán)利要求
1.人CTLA-4 mRNA 從起始 AUG 處算起的 184_213nt 處、261_290nt 處、和 349_378nt 處序列，即(1)TTCACCATCACACAACACTGATGAGGTCCGGGT(2)CACGACATTCACAGAGAAGAATACAGTGGGCTT(3)ATCCAAGGACTGAGAGCTGTTGACACGGGACTG 人PD-I基因mRNA從起始AUG處算起的208_240nt處、275_305nt處、和248_280nt處序列。(4)GGCCAGCTTGTCCGTCTGGTTGCTGGGGCTCAT(5)CGTTGGGCAGTTGTGTGACACGGAAGCGGCAGT(6)GGCAGTCCTGGCCGGGCTGGCTGCGGTCCTCGG
2. 根據(jù)權(quán)カ要求I和2，在(I)至(6)序列上單處的連續(xù)10個(gè)堿基或以上序列的DNA分子作為核酸藥物候選結(jié)構(gòu)分子、和(I)至(6)序列上兩處的各6個(gè)連續(xù)序列以上的DNA分子(即脫氧核酶)作為核酸藥物候選脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu)分子。
3.根據(jù)權(quán)カ要求I和2，在(I)至(6)序列上單處的連續(xù)10個(gè)堿基或以上序列的RNA分子作為核酸藥物候選結(jié)構(gòu)分子、和(I)至(6)序列上兩處的各6個(gè)連續(xù)序列以上的RNA分子(即核酶)作為核酸藥物候選核糖核酸結(jié)構(gòu)分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。將人淋巴細(xì)胞抑制性受體基因CTLA-4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4)和PD-1(Programmed cell death-1，程序性死亡受體1)的6條核酸序列，應(yīng)用于核酸類(lèi)藥物設(shè)計(jì)，以研發(fā)藥物，治療免疫疾病中消除免疫抑制、調(diào)節(jié)免疫、和消除腫瘤免疫逃逸進(jìn)行腫瘤治療。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102676531SQ20111005424
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者周穎, 崔玉芳, 方靜, 毛建平, 谷慶陽(yáng), 馬瓊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所