專利名稱：一種鑒定山羊早期胚胎性別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用PCR技術(shù)擴增山羊AMEL基因進行早期胚胎性別鑒定的方法。
背景技術(shù)：
早期胚胎性別鑒定技術(shù)，是家畜胚胎移殖技術(shù)的一項重要內(nèi)容，也是實現(xiàn)家畜后代性別控制的主要途徑之一。早期的一些性別鑒定方法如免疫學(xué)方法、細胞學(xué)方法等，由于所需時間較長、或者對胚胎傷害較大、鑒定的準(zhǔn)確率不高等種種原因而無法應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中。近年來，隨著性別鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，性別控制主要采取兩條途徑x精子與Y精子的分離和早期胚胎性別的鑒定；雖然流式細胞儀已能成功分離X、Y精子，但其成本高，分離效率低，暫時還難以在規(guī)?；a(chǎn)中應(yīng)用。而隨著胚胎移植技術(shù)的發(fā)展，特別是PCR技術(shù)的出現(xiàn)，使早期胚胎性別鑒定成為目前最具實用價值的一項性別控制技術(shù)。用于胚胎性別鑒定的PCR法有多種，起初，利用PCR反應(yīng)體系對哺乳動物進行性別鑒定是對SRY基因(位于Y染色體上的特有序列)的擴增。然而，SRY基因只顯示一條帶，當(dāng)實驗過程中SRY基因條帶沒有出現(xiàn)時，不能判定是雌性樣本還是實驗過程中出現(xiàn)了錯誤。雖然有同時存在于雌性和雄性中的基因(像ZFX/Y)作陽性對照，但需要增加時間和材料。利用AMEL基因進行性別鑒定可以克服上述缺點。AMEL基因同時存在于X和Y染色體上的同源區(qū)，根據(jù)其內(nèi)含子長度在兩條性染色體上的不同，能擴增出不同長度的基因片段，在牛上已用于性別鑒定。根據(jù)AMEL基因在X和Y染色體同源區(qū)上存在不同程度堿基缺失的特點，設(shè)計巢式引物，雌性PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢驗只得到對應(yīng)X染色體的一條雌雄共有條帶，而雄性得到分別對應(yīng)于X染色體的雌雄共有條帶和對應(yīng)于Y染色體的雄性特有條帶。目前，多采用SRY基因?qū)ι窖蜻M行性別鑒定，采用AMEL基因的卻鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種鑒定山羊早期胚胎性別的方法，該方法是利用引物對山羊AMEL基因巢式PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)兩條帶者為雄性樣品，出現(xiàn)一條帶者為雌性樣品，不需要另外設(shè)計內(nèi)標(biāo)引物作為陽性對照。實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種鑒定山羊早期胚胎性別的方法，具體包括下列步驟1)取少量山羊發(fā)情后第7 8天胚胎做為樣品；2)將胚胎樣品用無鈣鎂的磷酸緩沖液中洗滌三次，在100°C滅菌超純水煮沸 lOmin，然后5000g離心3min，鈄上清液直接作為模板進行PCR反應(yīng)；3)在15 μ L PCR Mix液中加入上下游巢式外引物和5 μ L模板，預(yù)變性94°C 5min ； 94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 22 個循環(huán)；最后 72°C延伸 5min ；所述的上游巢式外引物5'-CATGGT GCCAGCTCAGCAG-3‘
所述的下游巢式外引物5'-CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3‘4)在3yL PCR產(chǎn)物中加入7yL PCR Mix和上下游巢式內(nèi)引物，預(yù)變性94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 40 個循環(huán)；最后 72°C延伸 5min，停止反應(yīng)；上游巢式內(nèi)引物5‘ -CAGCAACCAATGATGCCAGTTC-3 ‘下游巢式內(nèi)引物5'-GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA-3‘5)將擴增產(chǎn)物于1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像儀中觀察，出現(xiàn)兩條帶者為雄性樣品，一條帶者為雌性樣品。所述的PCR Mix 液中包括 50mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HC 1,3mmo 1 /LMgSO4, 400mmol/L dNTPs 和 0. IU/ μ L Taq DNA 聚合酶。所述的電泳條件是75V，30min。本實驗采用AMEL基因?qū)ι窖蛟缙谂咛ミM行性別鑒定，目的是建立一種更加快捷、 準(zhǔn)確的山羊胚胎性別鑒定方法，推進山羊性別控制技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用。胚胎性別鑒定技術(shù)與MOET(超數(shù)排卵和胚胎移植)技術(shù)結(jié)合，可使早期胚胎性別鑒定成為目前最具實用價值的一項性別控制技術(shù)。與目前的性別鑒定技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于1)利用該巢式PCR引物進行PCR鑒定時，出現(xiàn)兩條帶者為雄性樣品，一條帶者為雌性樣品，不需要另外設(shè)計內(nèi)標(biāo)引物這樣就不存在性控引物和內(nèi)標(biāo)引物擴增效率不同的問題，同時由于只需使用2條引物，一能簡化實驗操作，二能降低實驗成本，三能減少引物太多導(dǎo)致交叉產(chǎn)生引物二聚體等不良因素。2)該方法與其他胚胎生產(chǎn)技術(shù)相結(jié)合進行山羊的繁育，可提高山羊的繁育效率， 迅速增加良種山羊的數(shù)量，提高山羊種群質(zhì)量，加速品種選育工作。3)本發(fā)明采用的巢式PCR引物具有較高的特異性、準(zhǔn)確性和敏感性，適合少量樣品的擴增，便于在生產(chǎn)中應(yīng)用。


圖1為山羊基因組DNA AMEL基因片段巢式引物的擴增性別鑒定圖；圖2為山羊基因組DNA AMEL基因擴增部分結(jié)果圖；圖3 IOpg量山羊基因組DNA AMEL基因片段巢式引物的擴增性別鑒定圖；圖4山羊胚胎AMEL基因片段巢式擴增性別鑒定圖。
具體實施例方式以下通過發(fā)明人給出的具體實施例來進一步說明本發(fā)明鑒定山羊早期胚胎性別的方法的有益效果。通過對已知性別的山羊基因組DNA進行性別鑒定，檢測引物的特異性及敏感性。實驗例1 引物特異性檢測1)取新鮮山羊血液，用酚/氯仿法提取基因組DNA ；2) PCR反應(yīng)體系中10 μ L PCR Mix，10 μ mol/L上下游巢式外引物各0. 8 μ L，滅菌超純水 7. 4yL，lyL DNA 模板量為 20ng，共 20 μ L。預(yù)變性 94°C IOmin ；94 °C 30s, 62 °C 30s, 72°C 30s，共 30 個循環(huán)；72°C 5min，停止反應(yīng)；
3)取IyL PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入新PCR管中，再加入IOyL PCR Mix，0. 8 μ L引物，滅菌超純水 7. 4yL，共 20yL;預(yù)變性 94°C IOmin -MV 30s, 62°C 30s, 72°C 30s 共 30 個循環(huán)，最后72°C延伸5min，停止反應(yīng)。4)取5 μ L PCR擴增產(chǎn)物于1. 5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓75V，電泳時間 30min，紫外透射儀觀察擴增結(jié)果，PCR擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)兩條帶者判定為雄性，出現(xiàn)一條帶者判定為雌性。鑒定結(jié)果與實際性別完全符合。如附圖1和圖2所示，其中圖1中M:DL-2000 DNA分子量標(biāo)記；1 巢式外引物無模版陰性對照；2 雄性山羊巢式外引物擴增X和Y兩條帶；3 雌性山羊巢式外引物擴增X—條帶；4 無模版陰性對照；5 雄性山羊內(nèi)引物擴增X 和Y兩條帶；6 雌性山羊內(nèi)引物擴增X 一條帶；圖2中M為DL2000 DNA Marker ； 1、3、5、7、 9為雄性；2、4、6、8、10為雌性。實驗例2 引物敏感性檢測1)將模板梯度稀釋至 IOOpg/ μ L，IOpg/ μ L ；2)第一輪PCR擴增，其中4μ L PCR Mix，10 μ mol/L上下游巢式外引物各0. 15 μ L， IyL模板，14. 7yL 滅菌超純水，共 20yL;預(yù)變性 94°C 5min ；然后 94°C 30s,62°C 30s， 72°C 30s，共22個循環(huán)；最后72°C延伸5min。3)第二輪PCR反應(yīng)其中4μ L Taq mix、10 μ mol/L上下游巢式內(nèi)引物0. 3 μ L，取 3 μ L第一次PCR產(chǎn)物作模板，循環(huán)參數(shù)為94°C 5min ；94°C 30s,62°C 30s, 72°C 30s，共 40 個循環(huán)；最后72°C延伸5min，停止反應(yīng)。4)取5 μ L PCR擴增產(chǎn)物點樣于1. 5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓75V，電泳時間30min，紫外透射儀觀察擴增結(jié)果，均出現(xiàn)明顯條帶。如附圖3所示，圖中M:DL2000 DNA Marker ；1、3、5 為雄性；2、4、6 為雌性。實驗例3 山羊胚胎性別鑒定1)供體于發(fā)情后第7 8天回收胚胎。用顯微操作儀或手工切割法取得少量胚胎樣品，取樣后的胚胎于鑒定后移植或進行冷凍保存；2)胚胎樣品用無鈣鎂的磷酸緩沖液中洗滌三次，轉(zhuǎn)入PCR管中100°C滅菌超純水煮沸l(wèi)Omin，然后5000g離心3min，取上清液直接作為模板進行PCR反應(yīng)；3)在新的PCR管中加入4 μ L PCR Mix液、10 μ mol/L上下游巢式外引物各 0. 15 μ L、5 μ L模板、8 μ L滅菌超純水，共20 μ L，在PCR儀中預(yù)變性94°C 5min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 22 個循環(huán)；最后 72°C延伸 5min。4)取出6yL PCR產(chǎn)物加入新管中，再加入10 μ L PCR Mix、10 μ mol/L上下游巢式內(nèi)引物各0.6 μ L、加滅菌超純水補足20 μ L，在PCR儀中預(yù)變性94°C 5min;然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共40個循環(huán)；最后72°C延伸5min，停止反應(yīng)；5)將擴增產(chǎn)物于1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像儀中觀察。凡出現(xiàn)兩條帶者為雄性樣品，只有一條帶者為雌性樣品。如附圖4所示，圖中M:DL2000 DNA分子量標(biāo)記； 早雌性，X —條帶；汐雄性，X和Y兩條帶。
權(quán)利要求
1.一種鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征在于，包括下列步驟1)取少量山羊發(fā)情后第7 8天胚胎做為樣品；2)將胚胎樣品用無鈣鎂的磷酸緩沖液中洗滌三次，在100°C滅菌超純水煮沸l(wèi)Omin，然后5000g離心3min，取上清液直接作為模板進行PCR反應(yīng)；3)在新的PCR管中加入4yLPCR Mix液、10 μ mol/L上下游巢式外引物各0. 15 μ L、 5 μ L模板、8 μ L滅菌超純水，共20 μ L，在PCR儀中預(yù)變性94°C 5min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共22個循環(huán)；最后72°C延伸5min ；所述的上游巢式外引物5' -CATGGT GCCAGCTCAGCAG-3‘所述的下游巢式外引物5' -CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3‘4)在3yLPCR產(chǎn)物中加入7yL PCR Mix和上下游巢式內(nèi)引物，預(yù)變性94°C 5min ； 94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 40 個循環(huán)；最后 72°C延伸 5min，停止反應(yīng)；上游巢式內(nèi)引物5 ‘ -CAGCAACCAATGATGCCAGTTC-3 ‘下游巢式內(nèi)引物5 ‘ -GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA-3 ‘5)將擴增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像儀中觀察，出現(xiàn)兩條帶者為雄性樣品，一條帶者為雌性樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征在于，所述的PCRMix 液中包括 50mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HCl,3mmo 1 /LMgSO4,400mmo 1 /L dNTPs 禾口 0. IU/μ L Taq DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所的鑒定山羊早期胚胎性別的方法，其特征在于，所述的電泳條件是 75V，30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定山羊早期胚胎性別的方法，包括1)取少量山羊發(fā)情后第7～8天胚胎做為樣品；2)將胚胎樣品、洗滌、滅菌超純水煮沸10min、然后5000g離心3min，取上清液直接作為模板進行PCR反應(yīng)；3)在新的PCR管中加入4μL PCR Mix液、10μmol/L上下游巢式外引物各0.15μL、5μL模板、8μL滅菌超純水，共20μL，擴增；4)在3μL PCR產(chǎn)物中加入7μL PCRMix和上下游巢式內(nèi)引物，擴增；5)將擴增產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)兩條帶者為雄性樣品，一條帶者為雌性樣品。該方法能夠穩(wěn)定地擴增出相應(yīng)基因序列，具有較高的準(zhǔn)確定和敏感性。
文檔編號C12Q1/68GK102181523SQ20111005499
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者唐紀(jì)偉, 韓春梅, 高慶華 申請人:塔里木大學(xué)