專利名稱：大孔載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載木瓜蛋白酶聚體及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型固定化酶生物催化劑的制備方法，特別是一種使用大孔材料為載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載木瓜蛋白酶聚體及方法，屬于酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
交聯(lián)酶聚體(cross-linked enzyme aggregates, CLEAs)是一種新型的固定化酶方法，在制備過程中首先利用沉淀劑使溶解態(tài)的酶聚集沉淀，隨后對(duì)酶沉淀聚體進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。該方法制得的固定化酶具有較寬的最適催化PH范圍和較寬的最適催化溫度范圍，對(duì)高溫、有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸強(qiáng)堿等具有較高的穩(wěn)定性，是一種高效、穩(wěn)定的固定化酶方法。然而， CLEAs的機(jī)械強(qiáng)度相對(duì)較低，粒徑較小(通常為微米級(jí))，采用普通的過濾方法難以回收，限制了其在工業(yè)上的利用。因此，利用載體固定CLEAs以提高CLEAs機(jī)械穩(wěn)定性和操作回用性的方法近幾年來備受關(guān)注。2007年Kim等人自制了一種內(nèi)孔徑37nm，通道直徑13nm的分子蹄載體 HMMS (Hierarchically-ordered Mesocellular Mesoporous Silica),并米用先吸附后交聯(lián)兩步的方法令酶物理填埋在37nm的內(nèi)孔形成CLEAs，而不會(huì)從13nm的孔道泄露出來，形成類似“瓶中船”式結(jié)構(gòu)(Biotechnol. Bioeng. 2007,96 :210-218)；郭軍等也公開了一種通過先沉淀后交聯(lián)兩步將CLEAs物理填埋于孔徑為10 300nm，最適孔徑為30nm 的多孔微球載體上的方法(中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?00810056594)。李紅公開了一種以殼聚糖為原料制備殼聚糖微球，將殼聚糖微球加入木瓜蛋白酶溶液中，再經(jīng)吸附-交聯(lián)得到殼聚糖微球固定的木瓜蛋白酶(申請(qǐng)?zhí)?0117351. 0)，此方法中所選用的殼聚糖載體在酸性溶液中不穩(wěn)定，容易造成木瓜蛋白酶從載體上脫落。通常的載體固定化酶方法由于載體多為納米孔徑材料，載酶量往往較低(10 30mg/g)，底物與產(chǎn)物的傳質(zhì)也受到一定限制；同時(shí)，以非共價(jià)方法固定于載體中的酶易于從載體內(nèi)泄漏造成酶活損失，不利于工業(yè)上的重復(fù)回收利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載木瓜蛋白酶聚體(或稱固載化木瓜蛋白酶CLEAs)的制備方法，即利用孔徑大于0. 5 μ m的大孔載體，以化學(xué)共價(jià)法固定木瓜蛋白酶的交聯(lián)酶聚體，而非物理填埋，從而改善CLEAs操作粒徑，增加固定化酶載酶量，提高木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性的方法。為防止孔徑增大造成的酶泄漏，采用“同步法”交聯(lián)， 即在制得CLEAs的同時(shí)將其以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在載體孔道表面。本發(fā)明提供的是一種以大孔材料為酶的固定化載體，經(jīng)載體表面氨基改性、酶吸附、木瓜蛋白酶沉淀、同步交聯(lián)共四步將木瓜蛋白酶以交聯(lián)酶聚體的形式共價(jià)固定于載體上的方法。制備過程中CLEAs的形成和與載體的共價(jià)結(jié)合在同步完成，如圖1所示。本發(fā)明系一種固定化酶生物催化劑的制備方法的具有以下的制備過程和步驟(1)載體表面氨基改性所選載體為表面具有羥基基團(tuán)的無機(jī)或有機(jī)材料，將載體洗凈，于90 120°C烘干至質(zhì)量不再改變；將10 30mL硅烷偶聯(lián)劑與無水乙醇以1 1 1 3比例均勻混合5 30min，然后加入2 IOg載體材料，令載體質(zhì)量與硅烷偶聯(lián)劑體積比為1 3 1 5(g mL)，于50 70°C水浴中減壓旋蒸至液體不再減少；用乙醇洗滌載體3 4次， 放于90 120°C烘箱中干燥過夜至質(zhì)量不再改變，載體表面氨基含量達(dá)到5 15 μ mol/g ；(2)木瓜蛋白酶的吸附用pH為4 10的磷酸緩沖液溶解木瓜蛋白酶，配成濃度為0. 05 0. 25g/mL的木瓜蛋白酶溶液；取1 5mL此酶溶液，加入氨基改性后的大孔載體顆粒1 5g，于4 25°C 下振搖吸附2 Mi ；(3)木瓜蛋白酶沉淀吸附結(jié)束后，用磷酸緩沖液洗滌載體顆粒一次；隨后將吸附有木瓜蛋白酶的載體顆粒1 5g加入到1 IOmL沉淀劑中，繼續(xù)振搖10 30min ；(4) “同步法”共價(jià)交聯(lián)向步驟(3)中所得的沉淀體系中加入交聯(lián)劑至最終濃度為1 5% ；混合均勻，于 4 25°C下交聯(lián)2 Mh，使沉淀酶聚體在生成CLEAs的同時(shí)也與載體孔道表面氨基共價(jià)交聯(lián)，最終實(shí)現(xiàn)大孔載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載CLEAs ；所得固定化酶用蒸餾水洗滌3 4 次，凍干即得大孔載體固載化CLEAs顆粒。本發(fā)明所制備的木瓜蛋白酶聚體，是木瓜蛋白酶聚體是在孔徑大于0.5μπι的載體的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。具體說明如下載體表面氨基改性首先對(duì)大孔載體表面進(jìn)行氨基改性，所選載體為表面具有羥基基團(tuán)的無機(jī)或有機(jī)材料，如硅膠，或三氧化二鋁，或纖維素中的一種；所選的氨基改性劑為硅烷偶聯(lián)劑，如 Y-氨丙基三乙氧基硅烷，或Ν-( β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，或Ν-β-(氨乙基)-Y-氨丙基甲基二甲氧基硅烷中的一種。首先將載體洗凈，于90 120°C烘干至質(zhì)量不再改變；將10 30mL硅烷偶聯(lián)劑與無水乙醇以1 1 1 3比例均勻混合5 30min， 然后加入2 IOg載體材料，于50 70°C水浴中減壓旋蒸至液體不再減少；用乙醇洗滌載體3 4次，放于90 120°C烘箱中干燥過夜至質(zhì)量不再改變。測(cè)定載體表面氨基含量為 5 15 μ mol/g。木瓜蛋白酶沉淀吸附結(jié)束后，用磷酸緩沖液洗滌載體顆粒一次；隨后將吸附有木瓜蛋白酶的載體顆粒1 5g加入到1 IOmL沉淀劑中，所選沉淀劑為乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、異丙醇、叔丁醇、乙腈、飽和硫酸銨、聚乙二醇中的一種；繼續(xù)振搖10 30min?！巴椒ā惫矁r(jià)交聯(lián)向步驟(3)中所得的沉淀體系中加入交聯(lián)劑至最終戊二醛濃度為1 5%。所選交聯(lián)劑為戊二醛、碳化二亞胺、羥甲基磷化氫或琥珀酰亞胺的一種?；旌暇鶆颍? 25°C 下交聯(lián)2 Mh，使沉淀酶聚體在生成CLEAs的同時(shí)也與載體孔道表面氨基共價(jià)交聯(lián)，最終實(shí)現(xiàn)大孔載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載CLEAs ；所得固定化酶用蒸餾水洗滌3 4次，凍干即得大孔載體固載化CLEAs顆粒。大孔載體材料具有較大的內(nèi)部孔徑，較高的孔隙率及良好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度。本發(fā)明合理利用大孔載體的孔隙特征，使木瓜蛋白酶CLEAs在形成的同時(shí)共價(jià)固定于載體的孔隙中，改善了 CLEAs自身的工業(yè)化缺陷，達(dá)到了固定化酶的目的。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)借助載體孔徑大，孔隙率高的優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)了木瓜蛋白酶的高負(fù)載率；(2)載體顆粒粒徑和形狀可根據(jù)裝置需要調(diào)節(jié)，克服了 CLEAs不利于工業(yè)應(yīng)用的缺點(diǎn)；(3)利用“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載酶聚體，避免了大孔徑造成的酶泄漏；(4)固定化酶的制備方法簡(jiǎn)單，無需特殊設(shè)備，得到的固定化酶穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用，適于間歇和連續(xù)化生產(chǎn)。本發(fā)明所述方法亦適用于其他蛋白酶及脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素?；?、纖維素酶、果膠酶、氧化酶、L-天冬酰胺酶、天冬氨酸酶、過氧化物酶等。


圖1大孔載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載酶聚體制備流程；圖2(a)為未固載酶之前載體內(nèi)部孔道形貌；圖2(b)為經(jīng)固載酶后載體內(nèi)部孔道形貌；圖3固載化木瓜蛋白酶CLEAs、CLEAs及游離態(tài)酶的最適催化溫度比較；圖4固載化木瓜蛋白酶CLEAs、CLEAs及游離態(tài)酶的最適催化pH比較；圖5固載化木瓜蛋白酶CLEAs、CLEAs及游離態(tài)酶的溶劑穩(wěn)定性比較；圖6固載化木瓜蛋白酶CLEAs、CLEAs及游離態(tài)酶的熱穩(wěn)定性比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 取2g大孔硅膠(平均孔徑1 μ m,載體顆粒平均粒徑5mm，平均孔隙率為0. 6) 洗凈，于ioo°c下干燥1 至質(zhì)量不再改變。按照大孔硅膠質(zhì)量與硅烷偶聯(lián)劑體積比為 1 5(g mL)取IOmL的Y -氨丙基三乙氧基硅烷與20mL無水乙醇混合IOmin后加入2g 干燥好的大孔硅膠載體。在50°C下減壓旋蒸至液體不再減少，用無水乙醇洗滌載體三次，于 100°C下干燥得到氨基改性的大孔硅膠載體，測(cè)得表面氨基含量為8. 5ymol/g。將木瓜蛋白酶溶解于0. 2mol/L磷酸緩沖液中(pH7. 0)，配制成0. 15g/mL的酶溶液4mL，加入2g氨基改性后的大孔硅膠載體，于25°C下振搖3.證。取出吸附有木瓜蛋白酶的載體，用0. 2mol/L 磷酸緩沖液(PH7. 0)洗滌一次，加入到4mL無水乙醇中，沉淀IOmin令木瓜蛋白酶在孔道中形成酶聚體。隨后向此沉淀體系中加入0. 32mL的25%戊二醛，此時(shí)總體系中戊二醛濃度達(dá)到2%，并于4°C下振蕩交聯(lián)4h。交聯(lián)結(jié)束后用蒸餾水洗滌固定化酶3次，冷凍干燥后稱量得2g固定化酶顆粒，酶活為960U/g，載酶量60mg/g，內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖2所示。所得的固載化木瓜蛋白酶CLEAs于4 °C密封保存。實(shí)施例2 取6g大孔三氧化二鋁(平均孔徑0. 8 μ m，載體顆粒平均粒徑5mm，平均孔隙率為 0. 5)洗凈，于120°C下干燥1 至質(zhì)量不再改變。按照大孔硅膠質(zhì)量與硅烷偶聯(lián)劑體積比為1 3. 3(g mL)取20mL的Ν-(β-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷與60mL無水乙醇混合20min后加入6g干燥好的大孔三氧化二鋁載體。在60°C下減壓旋蒸至液體不再減少，用無水乙醇洗滌載體四次，于120°C下干燥得到氨基改性的大孔三氧化二鋁載體，測(cè)得表面氨基含量為10 μ mol/g。將木瓜蛋白酶溶解于0. lmol/L磷酸緩沖液中(pH4. 0)，配制成 0. 25g/mL的酶溶液3mL，加入3g氨基改性后的大孔三氧化二鋁載體，于4°C下振搖他。取出吸附有木瓜蛋白酶的載體，用0. lmol/L磷酸緩沖液(pH4. 0)洗滌一次，加入到IOmL飽和硫酸銨中，沉淀20min令木瓜蛋白酶在孔道中形成酶聚體。隨后向此沉淀體系中加入0. 96mL 的25%碳化二亞胺，此時(shí)總體系中碳化二亞胺濃度達(dá)到3%，并于15°C下振蕩交聯(lián)13h。交聯(lián)結(jié)束后用蒸餾水洗滌固定化酶4次，冷凍干燥后稱量得3g固定化酶顆粒，酶活為700U/g， 載酶量45mg/g。所得的固載化木瓜蛋白酶CLEAs于4°C密封保存。實(shí)施例3 取IOg大孔纖維素顆粒(平均孔徑1 μ m，載體顆粒平均粒徑5mm，平均孔隙率為 0.6)洗凈，于90°C下干燥24h至質(zhì)量不再改變。按照大孔硅膠質(zhì)量與硅烷偶聯(lián)劑體積比為1 3(g mL)取30mLN-i3-(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷與30mL無水乙醇混合30min后加入IOg干燥好的大孔纖維素載體。在70°C下減壓旋蒸至液體不再減少，用無水乙醇洗滌載體三次，于90°C下干燥得到氨基改性的大孔纖維素載體，測(cè)得表面氨基含量為8. 7 μ mol/g。將木瓜蛋白酶溶解于0.2mol/L磷酸緩沖液中(ρΗΙΟ. 0)，配制成0. 05g/ mL的酶溶液5mL，加入5g氨基改性后的大孔纖維素載體，于15°C下振搖證。取出吸附有木瓜蛋白酶的載體，用0. 2mol/L磷酸緩沖液(ρΗΙΟ. 0)洗滌一次，加入到5mL聚乙二醇，沉淀 30min令木瓜蛋白酶在孔道中形成酶聚體。隨后向此沉淀體系中加入0. Ig的琥珀酰亞胺， 此時(shí)總體系中琥珀酰亞胺濃度達(dá)到1%，并于10°C下振蕩交聯(lián)Mh。交聯(lián)結(jié)束后用蒸餾水洗滌固定化酶4次，冷凍干燥后稱量得5g固定化酶顆粒，酶活為1190U/g，載酶量73mg/g。所得的固載化木瓜蛋白酶CLEAs于4°C密封保存。測(cè)試?yán)皽y(cè)試結(jié)果以實(shí)施例1制備得到的固定化酶為測(cè)定樣品為詳細(xì)敘述過程(1)載體表面氨基含量測(cè)定采用水楊醛法測(cè)定改性前后載體表面氨基含量。準(zhǔn)確稱取0. 02g左右改性載體， 加入2mL水楊醛溶液(含2 %水楊醛、6 %吡啶、92 %乙醇)，密封，于60 V恒溫下反應(yīng)30min。 反應(yīng)結(jié)束后用2mL乙醇洗滌載體材料10次。洗凈后，取載體材料加入3mL芐胺溶液(含5 % 芐胺、95%乙醇)，密封，再次于60°C恒溫下反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后收集濾液，測(cè)定濾液在 315nm下的吸光度值。按照下式計(jì)算氨基含量
權(quán)利要求
1.一種使用大孔材料為載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載木瓜蛋白酶聚體的方法，其特征是步驟如下(1)載體表面氨基改性所選載體為表面具有羥基基團(tuán)的無機(jī)或有機(jī)材料，將載體洗凈，于90 120°C烘干至質(zhì)量不再改變；將10 30mL硅烷偶聯(lián)劑與無水乙醇以1 1 1 3比例均勻混合5 30min，然后加入2 IOg載體材料，令載體質(zhì)量與硅烷偶聯(lián)劑體積比為1 3 1 5(g mL)，于50 70°C水浴中減壓旋蒸至液體不再減少；用乙醇洗滌載體3 4次， 放于90 120°C烘箱中干燥過夜至質(zhì)量不再改變，載體表面氨基含量達(dá)到5 15 μ mol/g ；(2)木瓜蛋白酶的吸附用pH為4 10的磷酸緩沖液溶解木瓜蛋白酶，配成濃度為0. 05 0. 25g/mL的木瓜蛋白酶溶液；取1 5mL此酶溶液，加入氨基改性后的大孔載體顆粒1 5g，于4 25°C下振搖吸附2 Mi ；(3)木瓜蛋白酶沉淀吸附結(jié)束后，用磷酸緩沖液洗滌載體顆粒一次；隨后將吸附有木瓜蛋白酶的載體顆粒 1 5g加入到1 IOmL沉淀劑中，繼續(xù)振搖10 30min ；(4)“同步法”共價(jià)交聯(lián)向步驟(3)中所得的沉淀體系中加入交聯(lián)劑至最終濃度為1 5% ；混合均勻，于4 25°C下交聯(lián)2 Mh，使沉淀酶聚體在生成CLEAs的同時(shí)也與載體孔道表面氨基共價(jià)交聯(lián)， 最終實(shí)現(xiàn)大孔載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載CLEAs ；所得固定化酶用蒸餾水洗滌3 4次， 凍干即得大孔載體固載化CLEAs顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述大孔載體為硅膠、三氧化二鋁或纖維ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的硅烷偶聯(lián)劑為Y-氨丙基三乙氧基硅烷、Ν-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷或Ν-β-(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的沉淀劑為乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、 異丙醇、叔丁醇、乙腈、飽和硫酸銨或聚乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑為戊二醛、碳化二亞胺、羥甲基磷化氫或琥珀酰亞胺。
6.權(quán)利要求1 5的所制備的木瓜蛋白酶聚體，其特征是木瓜蛋白酶聚體是在孔徑大于0. 5 μ m的載體的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大孔載體“同步法”共價(jià)交聯(lián)-固載木瓜蛋白酶聚體及方法；木瓜蛋白酶聚體是在孔徑大于0.5μm的載體的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。以表面具有羥基的無機(jī)或有機(jī)大孔材料為固定化酶載體，經(jīng)載體表面氨基改性、酶吸附、酶沉淀、同步交聯(lián)最終實(shí)現(xiàn)交聯(lián)木瓜蛋白酶聚體的形成和與大孔載體共價(jià)連接的同步完成。制得的固載化酶載酶量高于普通載體固定化酶；采用共價(jià)固定方法避免了應(yīng)用大孔載體造成的酶泄漏，載體形狀可依據(jù)實(shí)際需要調(diào)整，最適催化溫度和pH，溶劑及熱穩(wěn)定性均有顯著改善。本發(fā)明還可應(yīng)用于其他蛋白酶及脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素?；?、纖維素酶、果膠酶、氧化酶、L-天冬酰胺酶、天冬氨酸酶、過氧化物酶等。
文檔編號(hào)C12N11/14GK102181422SQ201110054820
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者何志敏, 王夢(mèng)凡, 蘇榮欣, 齊崴 申請(qǐng)人:天津大學(xué)