專利名稱：一種高地芽胞桿菌及其在烤煙上部煙葉人工陳化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域和煙草陳化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及利用ー種人工分離的微生物菌 株，該微生物適用于烤煙上部煙葉陳化。所述的的微生物是高地芽胞桿菌(Bacillus altitudinis)D2。本發(fā)明還包括該微生物在烤煙上部進(jìn)行煙葉人工陳化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙葉陳化是煙草初加工過程中的ー個(gè)重要加工過程，同時(shí)陳化也是煙葉吸食品質(zhì)形成過程中的ー個(gè)重要環(huán)節(jié)。由于當(dāng)年收獲的煙葉(原畑)在品質(zhì)上尚存在著不同程度的缺陷，如香氣不突出，青腥雜氣較重，刺激性大，吸味辛辣，余味不干凈，煙氣不夠細(xì)膩，煙葉色澤及燃燒性也不符合加工要求等缺點(diǎn)，必須經(jīng)過陳化以促使煙葉內(nèi)在化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化(楊虹琦等，2003)。煙葉陳化是ー個(gè)與物理變化相伴隨的復(fù)雜的生理生化和化學(xué)反應(yīng)過程，在這個(gè)過程中，煙葉內(nèi)大分子有機(jī)物質(zhì)和化學(xué)成分在氧化反應(yīng)、酶促反應(yīng)以及微生物作用下不斷分解、轉(zhuǎn)化和消耗，小分子有機(jī)物香氣成分不斷形成，促進(jìn)煙葉主要化學(xué)成分發(fā)生變化，青雜氣、刺激性和異味大大減輕，香氣質(zhì)和香氣量變佳，吸味醇和。煙葉陳化包括自然陳化和人工陳化，自然發(fā)酵主要是借助自然氣候的變化進(jìn)行發(fā)酵，也稱為季節(jié)性發(fā)酵，主要特點(diǎn)是在煙葉儲(chǔ)存期間，利用一年一度的春季溫度上升，促進(jìn)煙葉內(nèi)酶的活動(dòng)，使煙葉經(jīng)過緩慢的發(fā)酵過程，以達(dá)到改善煙葉品質(zhì)的目的。優(yōu)點(diǎn)是エ藝簡單、操作方便、發(fā)酵后煙葉色澤鮮明，比較均勻。缺點(diǎn)是時(shí)間長，一般為I 2年，占用倉庫面積大，煙葉周轉(zhuǎn)慢，不夠經(jīng)濟(jì)(黃嘉扔，1999)。國內(nèi)煙草研究者在微生物人工陳化烤煙上做了大量工作，從陳化煙葉表面篩選出大量的芽胞桿菌菌株，并制備成各種煙草陳化菌劑人工陳化烤煙煙葉，促進(jìn)了煙葉內(nèi)部有機(jī)物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，加速了煙葉發(fā)酵過程、縮短了發(fā)酵周期，然而生物制劑在煙草發(fā)酵エ藝上應(yīng)用的時(shí)間并不長，應(yīng)用的范圍也不廣，大部分應(yīng)用在煙葉等級相對較高的中部煙上，效果不顯著，能夠成熟應(yīng)用并加以擴(kuò)大的就更少，本發(fā)明g在尋找ー種能夠顯著提高烤煙上部煙葉品質(zhì)的優(yōu)勢菌株。煙草植株的上部煙葉占整株煙葉的三分之一，占產(chǎn)量30-40%左右。目前我國的煙葉質(zhì)量與國際優(yōu)質(zhì)煙葉相比，仍然存在著一定的差距，主要表現(xiàn)在上部煙葉葉片偏厚、顔色較深、組織結(jié)構(gòu)緊密、煙堿含量偏高、還原糖及糖堿比低，內(nèi)在化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，在感官評吸方面表現(xiàn)為勁頭大，刺激性大，雜氣重，余味不干凈，上部煙葉的質(zhì)量和可用性差的問題尤為突出。由于植株上部煙葉的可用性較低，造成了全國性的上部煙葉大量積壓。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，針對烤煙上部煙葉質(zhì)量次、可用性差，特別是烤煙上部煙葉陳化問題，提供一株適用于烤煙上部煙葉陳化的微生物即高地芽胞桿菌的新菌株，利用該微生物提高對烤煙植株上部煙葉進(jìn)行人エ陳化，從而達(dá)到提高煙葉的質(zhì)量。
申請人從烤煙煙葉表面分離得到一株高地芽胞桿菌(Bacillus altitudinis)D2菌株，經(jīng)培養(yǎng)基富集后通過淀粉分解透明圈試驗(yàn)和酶活測定試驗(yàn)篩選獲得，試驗(yàn)表明該菌株是ー種優(yōu)良的烤煙上部煙葉陳化增香提質(zhì)菌，對烤煙上部煙葉的人工陳化有促進(jìn)作用，申請人將該菌株于2011年3月3日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC NO M2011056o高地芽胞桿菌(CCTCC NO M2011056)菌株的細(xì)胞形態(tài)特征革蘭氏染色呈陽性，桿狀，大小為O. 5 μ m I. O μ mX 3. O μ m 6. O μ m,芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，高地芽胞桿菌CCTCC M2011056的生理生化特征生長溫度27 45°C，pH4 9，NaCl耐受性20Z0 6% ;明膠液化、硝酸鹽還原酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V. P試驗(yàn)、均為陽性，氧化酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性，能夠利用甘露糖和蔗糖產(chǎn)酸，不能利用木糖、麥芽糖、鼠李糖產(chǎn)酸。所述的高地芽胞桿菌D2菌株的16S rRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : I所
/Jn ο本發(fā)明的高地芽胞桿菌D2菌株的應(yīng)用方法是發(fā)酵培養(yǎng)一收集菌體一制備菌懸液一噴灑上部烤煙一人工陳化一卷煙。高地芽胞桿菌D2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):酵母粉5，蛋白胨10，NaCllO,ρΗ7· 0-7. 4。高地芽胞桿菌D2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)的條件為180rpm，37°C，12h。高地芽胞桿菌D2菌株的發(fā)酵菌體的收集在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，8000rpm 8min離心沉淀菌體。高地芽胞桿菌D2菌株的發(fā)酵菌體通過麥云度法(見趙斌和何紹江，2002)可制備成108CFU/mL的菌懸液。高地芽胞桿菌D2菌株108CFU/mL的菌懸液在烤煙上部煙葉的噴灑用量為煙葉質(zhì)量的10%，以煙葉噴灑后手捏不成團(tuán)為宜。高地芽胞桿菌菌株制備的108CFU/mL菌懸液噴灑人工陳化烤煙上部煙葉的條件為處理溫度37°C、相対濕度60%，處理時(shí)間15天。本發(fā)明涉及的菌株分類地位的鑒定，參照經(jīng)典的微生物學(xué)分類手冊=GeorgeM. Garrity《Bergey，sMannual of Systematic Bacteriology》Vol. VIII, 1974 年版的內(nèi)容。根據(jù)其形態(tài)特征和生理生化特征，以及16SrRNA基因序列比對結(jié)果，經(jīng)多相分類鑒定本發(fā)明所分離的菌株是ー株高地芽胞桿菌(Bacillus altitudinis)，申請人將其命名為高地芽胞桿菌(Bacillus altitudinis)D2。本發(fā)明提供的高地芽胞桿菌(CCTCC N0:M2011056)，是ー種優(yōu)良的烤煙上部煙葉陳化增香提質(zhì)菌，對烤煙上部煙葉的人工陳化有促進(jìn)作用，特別是人工陳化后上部煙的刺激性和雜氣減輕，香氣質(zhì)和香氣量得到一定程度的改善，同時(shí)較自然陳化縮短烤煙上部煙葉的陳化周期。


序列表SEQ ID NO :I是高地芽胞桿菌D2菌株的16S rRNA的核苷酸序列。圖I :是高地芽胞桿菌D2菌株的顯微照片(100X)
圖2 :是高地芽胞桿菌D2菌株在淀粉-LB平板上的透明圈(水解圈)測定照片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及其附圖進(jìn)ー步說明本發(fā)明。實(shí)施例I :高地芽胞桿菌D2的分離選育。將來自于武漢卷煙廠倉庫的不同產(chǎn)地(湖北省、云南省)自然存放2年的煙葉，未經(jīng)過人工陳化處理的烤煙煙葉用已滅菌的剪刀剪碎，浸泡在IOOmL無菌水中，于200rpm搖床上震蕩30min，震蕩均勻后取O. lmL，稀釋涂布于LB平板上(培養(yǎng)基組成(g/L):蛋白胨IOg,酵母粉5g,氯化鈉IOg,用蒸懼水定容至IOOOmL ;瓊脂15_20g/L,調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. O 7. 4),培養(yǎng)12h后,對各種不同菌落進(jìn)行編號,并接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h,并利用接種針穿刺接種于淀粉平板上(培養(yǎng)基組成(g/L):可溶性淀粉2g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，用蒸餾水定容至IOOOmL,調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. O 7. 4)，培養(yǎng)24h后利用碘液測定淀粉平板上透明圈與菌落直徑比(見表I)。通過淀粉平板透明圈法進(jìn)行初篩， 從烤煙煙葉表面獲得11株降解淀粉效果較好的細(xì)菌(如表2)。表I不同菌株淀粉水解透明圈直徑與其菌落直徑比
權(quán)利要求
1.一種適用于烤煙上部煙葉陳化的高地芽胞桿菌(Bacillus altitudinis)D2,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO :M2011056，它的16S rRNA的核苷酸如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.權(quán)利要求I所述的高地芽胞桿菌在促進(jìn)烤煙上部煙葉陳化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，也涉及煙葉的陳化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一株適用于烤煙上部陳化的微生物高地芽胞桿菌(Bacillus altitudinis)D2菌株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NOM2011056，本發(fā)明還公開了該高地芽胞桿菌(Bacillus altitudinis)D2菌株在烤煙上部煙葉人工陳化中的應(yīng)用。本發(fā)明的高地芽胞桿菌是一種分離于煙葉表面的增香提質(zhì)優(yōu)勢細(xì)菌，能夠人工陳化烤煙上部煙葉，縮短上部烤煙煙葉的陳化時(shí)間，提高烤煙上部煙葉的吸食品質(zhì)，增加香氣質(zhì)量和香氣量，減少刺激性。
文檔編號C12N1/20GK102676417SQ201110057928
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者何結(jié)望, 冀志霞, 劉洋, 吳風(fēng)光, 李丹, 李琳, 陳守文, 韋杰 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)