一種催化活性提高的短小芽胞桿菌CotA漆酶突變體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種催化活性提高的短小芽胞桿菌CotA漆酶突變體及其制備方法， 屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（laccase，E.C. 1. 10.3.2)是一種含銅多酪氧化酶，能催化酪類物質(zhì)的氧化 還原反應(yīng)，在木質(zhì)素及其前體類似物的生物降解中發(fā)揮重要作用。漆酶的氧化底物極為廣 泛，包括酪類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香簇酸及其衍生物等，因此漆酶應(yīng)用潛力巨 大。在木材加工領(lǐng)域，漆酶能代替化學(xué)膠合劑，不但能提高產(chǎn)品質(zhì)量，而且能減輕對人體健 康的傷害及對環(huán)境的污染；在造紙工業(yè)中，漆酶用于紙張生物漂白和制漿，可減少制漿造紙 廠的污染，有助于造紙業(yè)最終實現(xiàn)清潔生產(chǎn)；在食品加工領(lǐng)域，漆酶可用于除去果汁中酪類 化合物引起的混濁，從而提高果汁的質(zhì)量。此外，漆酶還可氧化氯酪及其衍生物，降低其毒 性，減少W氯酪類為工業(yè)原料生產(chǎn)染料、防腐劑、除草劑、殺蟲劑等化工產(chǎn)品而造成的環(huán)境 污染。
[0003] 漆酶按來源不同可分為=大類：植物漆酶、真菌漆酶和細菌漆酶。細菌漆酶包括芽 胞桿菌屬的CotA蛋白、海單胞菌的巧oA蛋白、大腸桿菌的化eO蛋白、灰色鏈霉菌的化oA 蛋白等，與真菌及植物漆酶蛋白結(jié)構(gòu)相似，都具有4個銅離子結(jié)合位點。
[0004] 本實驗室前期已從自行篩選的短小芽胞桿菌菌株W3度acilluspumilusW3)中克 隆并重組表達了CotA漆酶，研究發(fā)現(xiàn)該CotA漆酶相對其它種類漆酶具備W下優(yōu)點：堿性 pH下酶活性高、耐高溫且熱穩(wěn)定性好、能耐受高濃度有機溶劑及面素離子環(huán)境等，運些優(yōu)良 特性正是目前漆酶在印染廢水處理領(lǐng)域進行工業(yè)化應(yīng)用所急需的。然而，野生短小芽胞桿 菌CotA漆酶天然表達量非常低，且底物專一性較差，催化活性偏低，成為工業(yè)化應(yīng)用的瓶 頸。因此本發(fā)明利用基因工程和酶工程手段，提高短小芽胞桿菌CotA漆酶的催化活性，進 一步提高其工業(yè)化應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種短小芽胞桿菌漆酶突變體，該突變體W本實驗室前期已改造獲 得的雙突變體L386W/G41化漆酶基因為模板，進一步將雙突變體的第57位甘氨酸（Gly，G) 分別突變?yōu)榱涟彼峄痚u，L)、苯丙氨酸（化6,F)、酪氨酸（Tyr，Y)、色氨酸燈巧，W)，隨后W 野生型CotA漆酶為對照，最終選擇出對底物2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并嚷挫-6-橫酸） 二錠鹽（ABT巧具有更高催化效率的突變體。
[0006] 所述B. pumilusCotA漆酶的親本氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的B. pumilusCotA 漆酶氨基酸序列一致（由本實驗室提交，GenBank登錄號：KF040050)。 陽007] 所述突變體是將雙突變體L386W/G41化漆酶基因中第57位的Gly分別突變成了 Leu、化6、Tyr、T巧，分別命名為L386W/G417L/G5化、L386W/G417L/G57F、L386W/G417L/G57Y、 L386W/G417L/G57W。
【附圖說明】
[0008] 圖1:野生短小芽胞桿菌CotA漆酶=維模擬結(jié)構(gòu)
[0009] 圖2 :構(gòu)建突變體質(zhì)粒過程的分子操作原理示意圖
【具體實施方式】
[0010] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。
[0011] 下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，運些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0012] 在W下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0013] 實施例1野生短小芽胞桿菌CotA漆酶的表達與純化。
[0014] 從甘油管接種前期構(gòu)建的重組表達菌株CotA/pColdII/BL21 〇)E3)于LB液體培養(yǎng) 基（含lOOmg/L氨節(jié)青霉素）過夜培養(yǎng)，按2%接種量將種子接入LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基（含 lOOmg/L)。大腸桿菌在37°C培養(yǎng)化后，加入0.ImM終濃度的IPTG進行誘導(dǎo)，并在15°C搖 床繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)3化后，將發(fā)酵液于4°C、800化pm離屯、IOmin去除上清，收集菌體。將收集 的菌體用憐酸鹽緩沖液重懸，重懸后用超聲波細胞破碎儀將菌體破碎釋放胞內(nèi)蛋白，破碎 完成后，將破碎的液體于4°C、800化pm離屯、IOmin收集上清。收集的上清用于CotA漆酶蛋 白純化。
[0015]由于重組表達的CotA漆酶蛋白帶有多聚組氨酸標(biāo)簽化ise.tag)，因此使用儀離子 親和層析方法分離目標(biāo)蛋白。儀離子親和層析純化步驟：（1)平衡：用10倍柱體積的20mM 緩沖液（含5mM的咪挫）平衡His化apHP儀離子柱（ImL);似上樣：預(yù)先處理好的樣品 WImL/min的流速上樣；（3)洗脫：用高濃度咪挫進行梯度洗脫，收集洗脫條件下峰型對應(yīng) 的管號，并做酶活檢測。最終獲得純化好的野生型CotA漆酶。
[0016] 實施例2 CotA漆酶突變體構(gòu)建并制備
[0017] (1)定點突變
[0018]W前期構(gòu)建成功的雙突變體L386W/G417L的B.pumilusCotA漆酶基因序列為模 板，將漆酶中第57位的甘氨酸（Gly)分別突變成亮氨酸化eu)、苯丙氨酸（Phe)、酪氨酸 燈yr)、色氨酸燈巧），命名為L386W/G417L/G57LL386W/G417L/G57F、L386W/G417L/G57Y、 L386W/G417L/G57W。
[0019]引入G5化突變的定點突變引物為：
[0020] 正向引物 5' -TAATGGCAGTTTGCCT￡ITCCAACCATTAA-3'（下劃線為突變位點）
[0021] 反向引物 5' -MAGGCAAACTGCCATTATAGGTCCATAAC-3'(下劃線為突變位點）
[0022] 引入G57F突變的定點突變引物為：
[0023]正向引物 5' -TAATGGCAGTTTGCCTIITCCAACCATTAA-3'（下劃線為突變位點）
[0024]反向引物 5' -MAGGCAAACTGCCATTATAGGTCCATAAC-3'(下劃線為突變位點） 陽0巧]引入G57Y突變的定點突變引物為：
[0026]正向引物 5' -TAATGGCAGTTTGCCTIATCCAACCATTAA-3'（下劃線為突變位點）
[0027]反向引物 5' -IMGGCAAACTGCCATTATAGGTCCATAAC-3'(下劃線為突變位點）
[0028] 引入G57W突變的定點突變引物為：
[0029]正向引物 5'-TAATGGCAGTTTGCCTTGGCCAACCATTAA-3^(下劃線為突變位點）
[0030]反向引物 5' -CCAAGGCAAACTGCCATTATAGGTCCATAA-3'(下劃線為突變位點） 陽〇3U 利用上述引物，W雙突變體