專利名稱：OsLIS-L1基因控制水稻株高和花粉育性的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體地說，本發(fā)明涉及利用水稻T-DNA隨機插入突變體庫，通過突變體表型的篩選鑒定，采用正向遺傳學的方法，分離克隆一種控制水稻株高和花粉育性的新基因OsLIS-Ll，并通過等位突變體分析，轉基因互補實驗及RNAi (RNA干渉)抑制實驗證明了 OsLIS-Ll基因的功能。同時還涉及利用該基因在水稻制種上的應用。
背景技術：
水稻作為重要的糧食作物，世界上約一半的人口以其為主食。同時，由于水稻具有基因組小、精細的遺傳和物理圖譜、相對容易的轉基因技術及與其它禾本科作物的共線 性，而被視做模式植物。隨著包括水稻在內的多種生物基因組測序的完成，人類開始進入功能基因組時代，而高通量、高效率的研究基因功能的方法是構建飽和的突變體庫(SpringerP S. Gene traps tools for plant development and genomics. Plant Cell,2000,12 1007—1020 ；Ramachandran S, Sundaresan V. Transposons as tools for functionalgenomics. Plant Physiol Biochem, 2001, 39 :243-252)。通過先找目標基因的突變體再觀察其突變表型來研究基因的功能或先篩選突變表型再找突變的基因并驗證兩者之間的必然關系來研究基因的功能，也即是所謂的反向遺傳學及正向遺傳學兩種方法。目前構建飽和突變體庫的方法有以下兩種ー是利用射線輻射或化學誘變劑處理種子等物理或化學的方法；ニ是利用反轉座轉座子或轉座子或T-DNA的遺傳轉化的方法。其中由于T-DNA的插入拷貝數低、插入位點的穩(wěn)定遺傳及插入位點的隨機等特性，采用T-DNA的遺傳轉化創(chuàng)造突變體的方法是目前構建水稻飽和突變體庫的常用方法(Wu等，Development ofennancer trap lines for iunctional analysis of the rice genome. Plant J，200j，35 :418-427 ；Jeon J S 等，T-DNA insertional mutagenesis for functional genomicsin rice. Plant J，2000，22 :561-570 ;Sallaud C 等，Highly efficient production andcharacterization of T-DNA plants for rice(Oryza sativa L.) functional genomics.Thero Appl Genet，2003，106 :1396-1408)。對已有的突變體庫開展表型突變體的篩選，通過正向遺傳學的方法來鑒定重要的發(fā)育調控研究基因是開展基因功能研究的有效方法之一?；谒救蚪M測序已完成，篩選突變體庫來闡釋基因的功能已顯端倪(Lee S Y等，Functional analysis of the flowering time gene 0sMADS50,the putative SUPPRESSOROF OVEREXPRESSION OF C01/AGAM0US-LIKE20(S0C1/AGL20)ortholog in rice. Plant J，2004,38 :745-764 ；Jung K H 等，Rice Undeveloped Tapetuml Is a Major Regulator ofEarly Tapetum Development. PlantCell，2005，17 :2705-2722 ;Kumar M 等，A candidategene 0sAPC6 of anaphase-promoting complex of rice identified through T-DNAinsertion.Funct Integr Genomics，2010，10 :349-358 ;Li X 等，FLEXIBLE CULMlencoding a cinnamyl—alcohol dehydrogenase controls culm mechanical strengthin rice. Plant Mol Biol, 2009,69 :685-697 ；Yuan W 等，Mutation of the rice genePAIR3results in lack of bivalent formation in meiosis. Plant J，2009，59 :303-315 ;Chang Y 等，Replication protein A(RPAla) is required for meiotic and somatic DNArepair but is dispensable for DNA replication and homologous recombination inrice.Plant Physiol，2009，151 :2162-2173)0株高是水稻的重要農藝性狀之一，它可以提高植株的豐產潛力，抗倒伏和肥料的耐久性。20世紀60年代以矮化育種為標志的“綠色革命”和70年代的水稻雜種優(yōu)勢利用，使水稻產量有了前所未有的突破。自此以后，株高的遺傳基礎得到了廣泛研究。造成植株矮化的因素有很多，其中赤霉素(GA)和油菜素內酯(BR)是決定株高的2個最重要因素。目前，已經在水稻中克隆了與赤霉素(GA)有關的植株矮化突變體，如sdl，dl，dl8 (SasakiA 等，Green revolution a mutant gibberelI in-synthesis gene in rice. Nature，2002，416 :701-702 ;Ueguchi_TanakaM，等，Rice dwarf mutant dl, which is， defective inthe alpha subunit of the heterotrimeric G protein， affects gibberellin signaltransduction. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97 :11638-11643 ；Itoh H，等，Modificationof rice plant height by suppressing the height-controlling gene， D18， in rice. Breed Sci，2002，52 :215-218)等。已經在水稻中克隆了與油菜素內酯(BR)有關的植株矮化突變體，如 brdl，brd2，d2 (Mori M，NomuraT 等，Isolation and characterization of arice dwarf mutant with a defect in brassinosteroid biosynthesis. Plant Physiol,2002，130 :1152-1161 ;Hong Z等，The rice brassinosteroid-deficient dwarf2 mutant，defective in the rice homolog of Arabidopsis DIMINUT0/DWARF1,is rescued by theendogenously accumulated alternative bioactive brassinosteroid,dolichosterone.Plant Cell，2005，17 :2243-2254 ;Hong Z 等，A rice brassinosteroid-deficientmutant，ebisu dwarf (d2)，is caused by a loss of function of a new member ofcytochrome P450. Plant Cell，2003，15 :2900-2910)等。這些基因的突變或失活會影響赤霉素(GA)和油菜素內酯(BR)的生物合成和信號傳導，造成不同程度的植株矮化。最近的研究表明，細胞分裂和細胞膨脹過程中的缺失造成的細胞大小和細胞數目變異也是造成植株矮化的重要因素。比如DTH8/0sHAP腹合體主要就是通過調控莖節(jié)間的細胞延長來控制水稻株高的(Wei X 等，DTH8 suppresses flowering in rice，influencing plantheight and yield potential simultaneously. Plant Physiol，2010，153 :1747-1758)；在oshl5突變體中，莖節(jié)間的細胞數目減少導致植株變矮(Sato Y等，Loss-of-functionmutations in the rice homeobox gene 0SH15affect the architecture of internodesresulting in dwarf plants. EMBO J，1999，18 :992-1002);而在 osapc6 突變體中，莖節(jié)間的細胞大小和細胞數目都減少導致植株變矮(Kumar M等，A candidate gene 0sAPC6ofanaphase-promoting complex of rice identified through T-DNA insertion. FunctIntegr Genomics，2010，10 :349-358)。這些基因的突變或失活會影響水稻的株高，造成不同程度的植株矮化。植物花藥的發(fā)育是ー個多層次多步驟的過程，它包括花粉囊壁的發(fā)育、花粉母細胞的發(fā)育、小孢子的產生、花粉粒的成熟等過程，其中任何ー個步驟發(fā)育不正常，都有可能影響整個植株的育性?；ǚ郯l(fā)育是ー個非常復雜的過程，它涉及到許多基因，了解這些基因在其發(fā)育過程中所起的生理生化方面的功能，將對花粉的發(fā)育有更為清晰的認識，這將有很大的理論和實際應用價值。目前，通過對雄性不育突變體的研究，已在擬南芥、玉米、水稻等植物中克隆了一些影響雄蕊發(fā)育的基因。如玉米中的MSCAl基因調控花粉囊壁細胞的分裂和轉化；擬南芥的NOZZLE基因參與調控性器官早期發(fā)育過程中的孢子形成；擬南芥的TPDl基因在花粉囊絨氈層細胞的分化過程中起重要作用；擬南芥的EMSl基因控制花粉嚢中生殖細胞及其鄰近體細胞的命運；水稻的Udtl基因是花粉囊絨氈層早期發(fā)育過程中的主要調節(jié)子(Chaubal R 等，The transformation of anthers in themscal mutant of maize. Planta,2003, 216 :778-788 ；Schiefthaler U 等，Molecularanalysis of NOZZLE，a gene involved in pattern formation and early sporogenesisduring sex organ development in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad.Sci.USA，1999,96 :11664-11669 ;Yang S L 等，TAPETUM DETERMINANT! is required forcell specialization in the Arabidopsis anther. Plant Cell，2003，15 :2792-2804 ;Zhao D Z 等，The excess microsporocytesl gene encodes a putative leucine-richrepeat receptor protein kinase that controls somatic and reproductive cellfates in the Arabidopsis anther.Genes Dev,2002,16 :2021-2031 ；Plant Cell，2003,15 :1281-1295 ；Plant Cell，2004，16 :1008-1020 Jung K H 等，Rice UndevelopedTapetuml Is a Major Regulator of Early Tapetum Development. Plant Cell，2005，17 2705-2722)。這些基因的突變或失活會影響花藥的發(fā)育，造成植株雄性不育。我國既是水稻生產大國，又是水稻消費大國，提高水稻產量和品質是水稻生產遺傳改良的主要性狀。20世紀60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育是水稻增產的兩次革命，但近幾年來水稻的增產幅度不顯著?？v觀水稻矮化育種，矮桿基因利用単一化現象嚴重，這是影響新育成品種產量潛力進ー步提高的主要原因之一，因此發(fā)現和利用新的矮桿基因很重要。雜交育種是提高水稻產量的重要途徑，雜交水稻技術的應用在提高水稻產量方面發(fā)揮了重要作用。雄性不育系為雜交育種提供了極大的便利和可能。利用雄性不育系進行雜交制種，既能節(jié)約勞力、財力，又保證雜交種的純度，因此在雄性不育的基礎上開展雜交優(yōu)勢的利用是水稻作物育種的主要方向之一。目前，獲得雄性不育系材料主要有以下幾種途徑尋找和利用自然界產生的雄性不育變異株；通過種間或種內雜交和連續(xù)多代回交的方法創(chuàng)造不育系；用人工誘變的方法創(chuàng)造不育系；用基因工程的方法創(chuàng)造不育系。因此，矮桿基因和雄性不育在水稻育種過程中發(fā)揮著重要作用。本發(fā)明通過篩選T-DNA突變體庫，分離并克隆了控制水稻株高和花粉育性的基因，豐富了可供利用的基因資源，通過基因工程的方法創(chuàng)造矮桿植株和雄性不育系，對生產矮桿水稻和雄性不育水稻及其在水稻育種上的應用都有非常重要的意義。WD40蛋白含有約40個氨基酸的保守序列。該序列以色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp，WD)結尾，因此稱為TO40基序，而含有此種基序的蛋白稱作MD40蛋白。TO40蛋白質中一般含有4-10個串聯的WD40基序來形成功能結構(Neer等,The ancient regulatory-proteinfamily of WD-repeat proteins. Nature, 1994, 371 :297-300)。W)40 蛋白廣泛存在于所有真核生物中，研究表明WD40蛋白具有廣泛的生物化學和細胞生物學功能，如參與細胞分裂和胞質移動、細胞程序性死亡、光信號感受和傳導、細胞運動、花發(fā)育、開花等過程(Smith等,The WD repeat a common architecture for diverse functions. Trends Biochem Sci, 1999,24 :181-185 ；van Nocker and Ludwig, The WD-repeat protein superfamilyin Arabidopsis -conservation and divergence in structure and function. BMCGenomics，2003，4 :50)。例如，擬南芥中的 CONSTITUTIVELY PH0T0M0RPH0GENIC I (COPl)基因，該蛋白的N末端有一個卷曲的螺旋(coiled-coil)結構域，接著有ー個鋅指結構域，C末端有7個WD40重復單元，COPl是光形態(tài)建成和開花期的重要調控子(von Arnim等，benetic and developmental control of nuclear accumulation of COPI, a repressorof photomorphogenesis in Arabidopsis. Plant Physiol,1997,114 :779-788 ;Holm 等，Two interacting bZIP proteins are direct targets of COPl—mediated control oflight-dependent gene expression in Arabidopsis. Genes Dev,2002,16 :1247—1259 ;Liu 等，COPl-mediated ubiquitination of C0NSTANS is implicated in cryptochromeregulation of flowering in Arabidopsis. Plant Cell, 2008, 20 :292-306)。水稻中發(fā)現的Rice Immature Pollen I(RIPl)基因，編碼含有5個保守WD40基序的蛋白。研究發(fā)現RIPl在花藥發(fā)育的晩期大量表達，該基因喪失功能突變體表現雄性不育(Han等，RiceImmature Pollen I (RIPl) is a regulator of late pollen development. Plant Cel丄 Physiol,2006,47 :1457-1472)。本發(fā)明采用T-DNA標簽的技術在水稻中分離獲得OsLIS-Ll基因，該基因編碼ー個類似于類型I的人類致無腦回畸形的基因編碼蛋白(lissencephalytype-l-like homology motif protein),該蛋白在C末端含有9個WD40重復單兀,突變體表型分析、基因表達分析和基因功能驗證實驗表明OsLIS-Ll基因能調控水稻株高和花粉育性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的采用T-DNA插入法分離克隆水稻功能基因技木，從水稻T-DNA隨機插入突變體oslis-11中克隆的新的控制水稻株高和花粉育性基因OsLIS-Ll及其編碼蛋白，通過遺傳轉化方法將所述的基因OsLIS-Ll轉化到水稻植物體內，以調控水稻水稻株高和花粉育性。所述的OsLIS-Ll基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示，它編碼的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 2所示。本發(fā)明克隆的水稻OsLIS-Ll基因的T-DNA插入失活突變體表現為半矮和育性低(見實施例I)，我們得到了 OsLIS-Ll基因的兩個等位突變體體，分別表示為oslis-11-l和oslis-11-2，它們具有非常相似的突變表型，并且突變表型也與在OsLIS-Ll基因內的T-DNA插入共分離(見實施例2)。通過觀察野生型和oslis-11-2突變體莖第一節(jié)間和不同時期花藥的半薄切片，得到了株高變矮和低育性的細胞學證據。野生型的OsLIS-Ll基因轉化突變體oslis-11-2后植株恢復正常的表型(見實施例4)，此外，通過RNAi (RNA干涉)抑制該基因的表達得到和突變體相似的半矮和低育性表型(見實施例4)。OsLIS-Ll基因在根、莖、葉、葉鞘和穗中都有不同程度的表達，但在莖和穗中表達量相對要高些(見實施例5)。本發(fā)明克隆的OsLIS-Ll基因是控制水稻株高和花粉育性的新基因，有利于理解水稻莖和花粉的發(fā)育過程；通過基因工程的方法創(chuàng)造矮桿水稻和水稻雄性不育系，開拓了矮桿基因和雄性不育的資源。實現本發(fā)明的具體技術步驟如下I.利用已有的水稻T-DNA插入突變體庫(該水稻T-DNA插入突變體庫的構建方法參見 Wu 等，Development of enhancer trap lines for functional analysis ofthe rice genome. Plant J, 2003 :418-427 ;Zhan 等，Non-random distribution of T-DNAinsertions at various levels of the genome Hierarchy as revealed by analyzing13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer—trap mutant library. Plant J,2007 :947-959)，表型篩選得到一個半矮和低育性的突變體(該突變體命名為oslis-11-l，其在水稻T-DNA插入突變體庫中的原始編號為03Z11AI23)，突變體的篩選鑒定方法見實施例I第I部分中詳細描述。2.米用 Tail-PCR 方法(Zhang 等，Non-random distribution of T-DNAinsertions at various levels of the genome Hierarchy as revealed by analyzing13,804T-DNA flanking sequences from an enhancer—trap mutant library. PlantJ，2007 :947-959)分離oslis-ll_l突變體的側翼序列，通過序列分析顯示T-DNA插入OsLIS-Ll 基因(L0C_0s08g06480, http://rice.plantbiology.msu.edu/)的第 21 個內含子中(實施例I第2部分)。
3.通過T-DNA插入與突變性狀的共分離驗證(按實施例I的第3部分T-DNA插入與突變表型的共分離檢測執(zhí)行)證明本發(fā)明獲得的候選基因OsLIS-Ll的突變表型與T-DNA插入共分離。4.索取OsLIS-Ll基因的韓國等位突變體oslis-11-2，通過表型分析及共分離檢測進ー步證明OsLIS-Ll家系的突變表型與T-DNA插入共分離。(見實施例2)。5.分析了野生型和oslis-11-2突變體莖第一節(jié)間和不同時期花藥的半薄切片，結果顯示突變體變矮是由于莖第一節(jié)間細胞數目變少所致，而突變體的低育性是由于花粉敗育導致的(見實施例3)。6.基因功能互補實驗和RNAi (RNA干涉)抑制實驗(見實施例4)證明了本發(fā)明獲得的候選基因OsLIS-Ll的失活是引起oslis-11突變表型的原因，OsLIS-Ll基因控制水稻的株高和花粉育性。7.利用 RT(Reverse transcription 反轉錄)-PCR 研究 OsLIS-Ll 基因的表達模式，證明OsLIS-Ll基因在根、莖、葉、葉鞘和穗中都有不同程度的表達，但在莖和穗中表達量相對要高些(見實施例5)。更詳細的技術發(fā)明細節(jié)將由下述實施例給出。本發(fā)明的優(yōu)點在于I.本基因的成功克隆進一步證實了采用T-DNA標簽法克隆基因的可行性，而且該方法克隆基因速度快，效率高。2.本發(fā)明提供了一個調控水稻株高和花粉育性的基因OsLIS-Ll及其編碼蛋白，有利于理解水稻莖和花粉的發(fā)育過程。3.利用本基因構建的不同載體，通過基因工程的方法創(chuàng)造矮桿水稻和水稻雄性不育系，拓展了矮桿基因和雄性不育基因在水稻育種中的應用。


SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的OsLIS-Ll基因的cDNA序列，序列全長為3402bp。SEQ ID NO 2是OsLIS-Ll基因編碼的氨基酸序列，編碼1133個氨基酸。
圖I.水稻oslis-11-l突變體的表型。圖中圖IA :左邊野生型植株(WT)與右邊oslis-11-l突變體抽穗期的表型，oslis-11-l突變體與野生型(WT)相比半矮。圖IB :抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，顯微觀察，左邊為oslis-11-1突變體，大部分不著色，右邊為野生型植株(WT)，花粉著色正常。圖2. OsLIS-Ll基因與突變表型的共分離驗證。圖中圖2A :0sLIS_Ll基因的結構和T-DNA插入位點分析。藍色方框表不5’末端,淺藍色方框表3’末端,紅色方框表OsLIS-Ll基因的外顯子。LI，Rl表示跨oslis-11-l家系T-DNA的兩條基因組引物，NTLB5表示位于oslis-11-l家系T-DNA上的邊界引物；L2，R2表示跨韓國等位突變體oslis-11-2家系T-DNA的兩條基因組引物，iAPLl表示位于韓國等位突變體oslis-11-2家系T-DNA上的邊界引物。圖2B T1代共分離實驗膠圖。植株基因型的確定=OsLIS-Ll純合T-DNA插入植株當LI和NTLB5配對時可以擴增出目標產物約O. 7kb，由于T-DNA插入片段太大，LI與Rl配對無擴增產物；野生型植株由于無T-DNA插入，故LI和NTLB5配對無擴增產物，但LI與Rl配對擴增能得到目標產物約Ikb ;而OsLIS-Ll雜合T-DNA插入轉基因植株用LI和Rl 配對以及LI和NTLB5配對時都可以得到目的產物。植株表型20個Tl代單株中第8、9、10、20株為突變表型。由圖可知突變植株的基因型均為OsLIS-Ll純合T-DNA插入，而正常植株的基因型為野生或雜合型，這ー結果表明突變表型與OsLIS-Ll基因內的T-DNA插入共分離。圖3. oslis-11-l 等位突變體 oslis-11-2 的表型。圖中圖 3A :左為 oslis-11-2突變體，右為野生型植株(WT)，突變體與野生型相比半矮。圖3B :抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，顯微觀察，左邊為oslis-11-2突變體，花粉大部分不著色，右邊為野生型植株(WT)，花粉著色正常。圖3C T1代共分離實驗膠圖。植株表型20個Tl代單株中第2、7、13、17株為突變表型。圖4.野生型和oslis-11-2突變體莖各節(jié)間長度統(tǒng)計和莖第一節(jié)間半薄切片觀察。圖中圖4A :野生型和oslis-11-2突變體在成熟期莖各節(jié)間長度顯示。圖片顯示野生型和oslis-11-2突變體莖第一節(jié)間長度差距明顯，而其它莖節(jié)間長度差距不明顯。從左自右分別為oslis-11-2突變體的第一、第二、第三、第四和第五莖節(jié)間，野生型的第一、第二、第三、第四和第五莖節(jié)間。圖4B :野生型和oslis-11-2突變體在成熟期莖各節(jié)間長度統(tǒng)計結果。結果顯示野生型和oslis-11-2突變體莖第一節(jié)間長度差距明顯，而其它莖節(jié)間長度差距不明顯。圖4C和圖4D :野生型(C)和oslis-11-2突變體(D)莖第一節(jié)間半薄切片橫切。結果顯示野生型和oslis-11-2突變體莖第一節(jié)間細胞層數無差別。圖4E和圖4F :野生型(E)和oslis-11-2突變體(F)莖第一節(jié)間半薄切片縱切。結果顯示野生型和oslis-11-2突變體莖第一節(jié)間細胞大小無差別。注從穗往下為第一節(jié)間。圖5.野生型和oslis-11-2突變體不同時期花藥的半薄切片觀察。圖中(A)、(C)、(E)、(G)、(I)、(K)、(M)和(O)分別表示野生型花藥在減數分裂早前期、小孢子母細胞時期、減數分裂時期、四分體時期、小孢子時期、液泡化花粉時期、有絲分裂時期和成熟花粉期的花藥橫切片。(B)、(D)、(F)、⑶、(J)、(L)、(N)和(P)分別表示oslis-11-2突變體在減數分裂早前期、小孢子母細胞時期、減數分裂時期、四分體時期、小孢子時期、液泡化花粉時期、有絲分裂時期和成熟花粉期的花藥橫切片。E，表皮細胞；En，藥室內壁；ML，中層；T，絨氈層；Ms，小孢子母細胞；Tds，四分體；Msp，小孢子；MP，成熟花粉；SPC，第二層壁細胞；SC,造孢細胞。Bars = 50 μ m。圖6.本發(fā)明設計的功能互補載體pC2301-0sLIS-Ll結構示意圖。圖7.本發(fā)明設計的RNAi (RNA干涉)載體pDS-0sLIS_Ll結構示意圖。圖8.基因功能互補實驗和RNAi (RNA干渉)抑制實驗。圖中圖8A :基因功能互補實驗。左邊為轉基因陰性植株，表現為oslis-11-2突變表型，右邊為轉OsLIS-Ll基因陽性恢復野生型表型的植株。圖8B =RT-PCR檢測了 3株恢復正常表型(前3個)和I株陰性植株(最后I個)中OsLIS-Ll基因的表達量，結果顯示3株恢復正常表型的植株中OsLIS-Ll基因的表達量也恢復到正常水平，而I株陰性植株中OsLIS-Ll基因的表達量和突變體ー樣幾乎檢測不到。以GAPDH做為內標。圖8C : RNAi (RNA干渉)抑制實驗。左邊為陽性植株，表現為突變表型，右邊為陰性植株，表現為野生型。圖8D :抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，顯微觀察，左邊為陽性植株，花粉大部分不著色，右邊為陰性植株，花粉著色正常。圖9. RT (Reverse transcription 反轉錄)-PCR 分析 OsLIS-Ll 基因的表達模式。 抽穗期時OsLIS-Ll基因在根、莖、葉、葉鞘和穗中都有不同程度的表達，但在莖和穗中表達量相對要高些。另外，該基因在突變體中的表達量幾乎檢測不到，表明T-DNA的插入嚴重影響了該基因的正常表達。以GAPDH做為內標。
具體實施例方式實施例I :0sLIS-Ll基因的分離克隆I. oslis-11-l突變體的獲得所用的水稻T-DNA插入突變體庫由湖北省武漢市華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室利用載體pFX_E24. 2-15R構建而成(Wu等，Development of enhancer traplines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 :418-427 ;Zhang 等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of thegenome hierarchy as revealed by analyzing 13,804T-DNA flanking sequences froman enhancer-trap mutant library. Plant J, 2007,49 :947-959)。2005 年，從 TO 代突變體洋(見 http://rmd. ncpgr. cn/, Zhang 等，RMD :a rice mutant database for functionalanalysis of the rice genome. Nucl Acids Res, 2006, 34 :D745_D748)挑選出 3000 份水稻轉基因品種“中花11號(為中國農業(yè)科學院作物科學研究培育的常規(guī)水稻品種)”的種子，經浸種、催芽后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料種兩行，每行10株，為ー個家系。種植密度為5寸X8寸，種植地點為武漢華中農業(yè)大學的試驗田，按常規(guī)的水稻種植方法進行田間管理。在水稻整個生育期田間記載突變體的表型，對于同一家系內突變植株的表型一致、符合典型的3 I分離的家系并及時抽提DNA進行PCR陽性檢測，對于ー個家系內的所有突變體單株PCR均為陽性的家系作為后續(xù)研究的材料。PCR陽性檢測的引物位于T-DNA區(qū)段上，ー對引物的序列分別是GV-F 5-GGCATCGGTAAACATCTG CT-3，GV-R 5-GCCTCAAGAAGCTCAAGTGC-3, PCR 產物大小為 61 lbp，反應體系的總體積為20μ 1，具體包含DNA模板I μ L ;10倍體積的Taq酶反應緩沖液2μ I ；2mM dNTP I. 5 μ L ;25mM 鎂離子 I. 2 μ L ; 10 μ M 引物(GV-F+GV-R) O. 2 μ L ;0· 3 單位 Taq 酶，加雙蒸水至20 μし反應程序為94°C變性5分鐘，94°C 45秒、55°C 45秒、72°C I分鐘，共進行30個循環(huán)，72 °C延伸5分鐘。
通過實施例I得到一個突變體,該突變體從外觀上看植株半矮和低育性如圖IA所示，申請人將這個突變體命名為oslis-11-l。取抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，顯微觀察如圖IB所示，野生植株的花粉正常著色，且花粉粒呈正常的圓形，突變體的花粉染色結果，大部分都不著色，顯示該突變體是雄性育性降低的突變體。至成熟吋，考種發(fā)現突變體oslis-11-l結實率僅為11. 3%，株高為野生型株高的56. 0%。水稻oslis-11突變體和野生型考種結果見表I所示。表I水稻oslis-11突變體和野生型考種結果
權利要求
1.OsLIS-Ll基因控制水稻株高和花粉育性的應用，其特征在于，所述的OsLIS-Ll基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領域。具體涉及一種控制水稻植株株高和育性基因OsLIS-L1的DNA片斷的分離克隆、功能驗證和應用。所述的DNA片斷突變體后導致水稻植株半矮，大部分花粉敗育。本發(fā)明揭示了該基因在控制水稻株高及育性等農藝性狀分子機理等方面的應用。
文檔編號C12N15/29GK102676536SQ20111005794
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權日2011年3月11日
發(fā)明者吳昌銀, 郜新強 申請人:華中農業(yè)大學