本發(fā)明涉及微生物篩選
技術領域：
，具體提供了一種新型干酪乳桿菌及其應用。
背景技術：
：益生菌是有益于宿主健康的一類微生物，1965年在Science上首次被提出。腸道菌系平衡是對人體營養(yǎng)和健康至關重要的因素，益生菌對人體腸道菌系有很好的調節(jié)作用，這使得益生菌的研究成為食品研究的一大熱點。近年來，隨著對益生菌的深入研究，益生微生物的種類也越來越多，其主要分為三大類:第一類為乳酸菌，主要包括嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌和乳雙歧桿菌等；第二類為芽胞桿菌；第三類為酵母菌。乳酸菌是一類能利用碳水化合物產生乳酸的非病原性、革蘭氏陽性細菌的通稱,包括乳桿菌、乳球菌和雙歧桿菌等至少23個屬。在選育乳酸菌菌株時應考慮一下幾點:(1)菌體分離的對象應是健康的人或動物,人類使用的菌株最好來源于人。(2)能耐受人的膽汁酸鹽和酸性環(huán)境。(3)具有適宜的免疫調節(jié)作用,不會引起炎癥等不良反應。乳酸菌作為微生態(tài)制劑的重要菌種，在維護人和動物腸道健康、促進體內微生態(tài)平衡方面起著重要的作用，大量研究表明，乳酸菌能夠調節(jié)機體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡，提高食物消化率和生物價，降低血清膽固醇，控制機體內毒素，抑制腸道內腐敗菌生長繁殖和腐敗產物的產生，制造營養(yǎng)物質，刺激組織發(fā)育，從而對機體的營養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、細胞感染、藥物效應、毒性反應、免疫反應、腫瘤發(fā)生、衰老過程和突然的應急反應等產生作用。此外,乳酸菌作為重要的益生菌已廣泛地用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)中,被公認為是安全的食品級微生物。對于健康成年人來說，其腸道內微生物按一定的種群比例定植在腸壁上，處于一種穩(wěn)定的菌群平衡中。但由于某些因素如抗生素的使用、放療、化療、飲食習慣不良、精神壓力等原因可能會導致腸道正常菌群種類和數(shù)量的改變，腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)被破壞，所引起的病理狀態(tài)稱為腸道菌群失調。乳酸菌進入腸道后，可以迅速進行生長繁殖，代謝產生的乳酸、二氧化碳使腸內pH值迅速降低，抑制了病原菌和有害人體健康的細菌的繁殖，從而起到預防感染、維持腸內菌群平衡的作用。乳酸菌對人體有特殊的生理作用，是機體內必不可少的正常生理菌群，拓展菌種來源，選育既有優(yōu)良發(fā)酵特性，又有特殊保健功能的活菌數(shù)高、優(yōu)良、安全的乳酸菌菌種；應用分子生物技術開發(fā)食品級乳酸菌菌株和工程菌菌株，將為人類帶來巨大的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新型干酪乳桿菌及其應用。所述干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)篩選自自然發(fā)酵的酸菜汁中，耐酸性強，抗菌作用明顯，應用前景廣闊。本發(fā)明一方面提供了一種干酪乳桿菌KDB-LC(LactobacilluscaseiKDB-LC)，已經(jīng)于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016431。所述干酪乳桿菌在益生菌飲料中的應用。一種益生菌飲料，是通過將上述干酪乳桿菌進行發(fā)酵制備的。一種益生菌飲料的制備方法，具體為：將脫脂乳粉配制成12％的復原脫脂乳，采用95℃處理8～10min后，冷卻至37～40℃；按3％～5％接種量接種上述干酪乳桿菌，37℃培養(yǎng)20～24h，終點酸度控制在160～175°T；按比例加入經(jīng)90～110℃/5～10s殺菌的糖和穩(wěn)定劑的組合物，混合均勻后，20～25MPa均質，然后在72℃/15s條件下熱處理，冷卻至15～20℃，采用無菌或衛(wèi)生灌裝，即得益生菌乳飲料。所述制備方法中，復原脫脂乳與糖和穩(wěn)定劑的組合物的質量比為3:7。所述制備方法中，糖和穩(wěn)定劑的組合物優(yōu)選蔗糖和果膠。所述制備方法中，糖和穩(wěn)定劑的組合物優(yōu)選質量百分比為11.5％～14.8％的蔗糖和1.2％～1.5％的果膠。所述益生菌飲料中干酪乳桿菌的活菌數(shù)超過30億/mL。有益效果本發(fā)明篩選到的干酪乳桿菌對大腸桿菌、沙門氏菌和幽門螺旋桿菌均有明顯的抑制作用，尤其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑高達24mm。所述干酪乳桿菌對胃酸和膽汁鹽的耐受性強，且能在胃酸環(huán)境下實現(xiàn)有效增殖。所述干酪乳桿菌KDB-LC還具有很強的抗氧化能力，在1.0mmol/LH2O2中仍能保持97.44％的存活率；其發(fā)酵上清液和無細胞提取物對羥基自由基的清除率分別高達92.3％和87.1％。所述干酪乳桿菌可廣泛應用于益生菌飲料的制備，能明顯增加腸道有益菌的數(shù)量，改善胃腸道健康，提高機體免疫力，應用前景廣闊。具體實施例實施例1干酪乳桿菌KDB-LC分離篩選及鑒定1、篩選樣品從沈陽蘇家屯農村收集自然發(fā)酵的酸菜汁作為分離樣品，所述酸菜汁外觀無污染、味道純正，發(fā)酵時間超過1年，過濾后備用。2、乳酸菌初篩取過濾后的酸菜汁5mL加入45mL無菌水，混勻，涂布于加0.5％碳酸鈣的MRS平板上，37℃培養(yǎng)48h，分離培養(yǎng)有透明圈的菌株，獲得42株乳酸菌。3、抑菌型乳酸菌篩選1)乳酸菌液制備：將初篩得到的32株乳酸菌分別接種于100mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48h；2)致病菌菌液制備：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和幽門螺旋桿菌(四種致病菌均由山東大學贈送)，將菌種接種于營養(yǎng)肉湯，37℃搖床培養(yǎng)過夜；3)抑菌實驗—雙層平板，牛津杯法：每5mL滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(50℃左右)加100μL致病菌菌液(菌量106數(shù)量級)，混勻后傾倒至營養(yǎng)瓊脂平板做成雙層平板，凝固后在培養(yǎng)基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培養(yǎng)好的乳酸菌菌液，待菌液擴散后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，觀察抑菌圈直徑。結果顯示，初篩獲得的乳酸菌中對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和幽門螺旋桿菌的抑菌圈直徑均超過15mm的菌株共6株。進一步對其進行抗生素耐受篩選。經(jīng)過兩次刪選，最終申請人從上述6株菌中篩選得到對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用最強的乳酸菌，命名為KDB-LC。表1乳酸菌KDB-LC對致病菌的抑制作用致病菌大腸桿菌沙門氏菌金黃色葡萄球菌幽門螺旋桿菌抑菌圈直徑18mm20mm24mm21mm由上表的結果可以看出，本發(fā)明篩選出的乳酸菌KDB-LC對大腸桿菌、沙門氏菌和幽門螺旋桿菌均有明顯的抑制作用，尤其對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑達到24mm。3、菌株鑒定利用試劑盒提取上述乳酸菌KDB-LC的基因組DNA，利用PCR技術擴增16SrRNA序列。將測序結果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行blast比對發(fā)現(xiàn)，乳酸菌KDB-LC的16SrRNA序列與干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的序列相似度高于99％。因此，確認其為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，命名為干酪乳桿菌KDB-LC(LactobacilluscaseiKDB-LC)，并于2016年8月29日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016431。實施例2干酪乳桿菌KDB-LC耐酸、耐膽鹽實驗2.1耐酸實驗將MRS液體培養(yǎng)基的pH值分別調整為2.0和3.0；121℃滅菌15min；將活化的干酪乳桿菌KDB-LC按照2％接種量接種到已冷卻的培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0h、1h、2h、3h時取樣，平板計數(shù)測定活菌數(shù)，結果見表2。表2干酪乳桿菌KDB-LC耐酸性實驗從表2可以看出，本發(fā)明所述干酪乳桿菌KDB-LC在pH2.0和pH3.0的酸性條件下培養(yǎng)3h后，活菌率分別高達86.7％和217％，說明干酪乳桿菌KDB-LC不僅有效能耐受pH2.0和pH3.0的酸性環(huán)境，而且在pH3.0條件下仍能實現(xiàn)一定的繁殖，因此能夠有效抵抗胃液的破壞作用。2.2耐膽汁鹽實驗微生物對于膽鹽的抗性是其能夠在腸道存活、生長并發(fā)揮功效的先決條件之一。膽鹽對菌株的抑制作用取決于膽鹽的濃度和菌株本身的特性，不同消化道部位膽鹽的含量不同，人體小腸中膽鹽含量在0.03％～0.3％之間波動。能夠在正常生理膽鹽濃度中生長和代謝的菌株才可能在腸道中存活。在MRS液體培養(yǎng)基中加入牛膽汁粉，使其質量分數(shù)分別為0.0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％，按照2％接種量接種本發(fā)明的干酪乳桿菌KDB-LC，37℃厭氧培養(yǎng)，以溴甲酚紫為指示劑，觀察培養(yǎng)基顏色變化，結果見表3。原理：干酪乳桿菌產酸，會導致培養(yǎng)基pH值下降，指示劑將由紫色變?yōu)辄S色。表3干酪乳桿菌KDB-LC耐膽鹽實驗膽鹽濃度(％)生長情況0.0++0.1++0.2+0.3+0.4+0.5-注：++為培養(yǎng)基在24h之內變色，+為在48h之內變色，-為培養(yǎng)基不變色從表3的結果可以看出，本發(fā)明提供的干酪乳桿菌KDB-LC在膽鹽濃度為0.4％的環(huán)境中仍能存活，并生長良好，使培養(yǎng)基在48小時內變色，從而說明該菌株對膽鹽具有很強的耐受性，能夠在小腸環(huán)境(膽鹽含量0.03％～0.3％)中有效定殖。實施例3干酪乳桿菌KDB-LC體外抗氧化實驗將干酪乳桿菌KDB-LC進行傳代活化后，以5％(質量比)接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)18h，3000r/min，離心15min，分別收集發(fā)酵上清和菌體。制備無細胞提取物：用pH值為7.4的磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌菌體3次，重新懸浮于磷酸緩沖溶液中，調整菌數(shù)至109cfu/ml；然后超聲波冰浴破碎菌體，10000r/min離心10min，上清液即為無細胞提取物。3.1干酪乳桿菌KDB-LC對過氧化氫的耐受能力過氧化氫是一種弱的氧化劑，但具有很好的擴散性，因此半衰期很長。由于這兩個基本特性，過氧化氫本身就能造成氧化損傷，或者作為羥自由基的前體物質造成氧化損傷。將60mL的MRS培養(yǎng)基加入到滅過菌的三角瓶中，添加H2O2，使培養(yǎng)基中的起始H2O2濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L。按照1％的比例接種上述干酪乳桿菌KDB-LC到液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測定600nm波長處的吸光度A600nm，以吸光度反映其菌體濃度的變化，確定菌株對H2O2耐受性。實驗結果顯示，240min后，干酪乳桿菌KDB-LC在1.0mmol/LH2O2中仍能保持97.44％的存活率，從而說明干酪乳桿菌KDB-LC具有很強的抗氧化能力。3.2干酪乳桿菌KDB-LC對羥基自由基的清除能力ROS自由基中，羥基自由基是最有活性的，在金屬離子(如銅離子或鐵離子)存在的條件下，超氧陰離子和過氧化氫能生成羥基自由基。羥基自由基是一種氧化性很強的自由基，會對生物細胞大分子造成損傷而影響細胞的正常功能。因此，對羥基自由基的清除能力是抗氧化性能的一個主要指標。ESR法測定清除羥基自由基的能力：分別將50μL干酪乳桿菌KDB-LC的發(fā)酵上清液和無細胞提取物各加入到50μL濃度為0.3mol/L的DMPO后，把反應的體系轉入到密封的石英毛細管中，然后加50μL濃度為10mol/L的H2O2啟動反應。反應2.5min后，通過ER200DSRCESR光譜儀分析。對照為0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)。樣品對·OH的清除作用以清除率表示。清除率＝(H0—H)/H0×100％式中：H和H0分別表示樣品與對照波譜信號強度，信號的相對強度用波譜信號的第二個峰值來表示。結果顯示：干酪乳桿菌KDB-LC的發(fā)酵上清液和無細胞提取物對羥基自由基的清除率分別高達92.3％和87.1％，從而說明本發(fā)明提供的干酪乳桿菌KDB-LC的發(fā)酵液上清液和無細胞提取物均具有較強的抗氧化能力，能有效清除羥基自由基，而且該菌株發(fā)酵上清液的清除效果要明顯高于無細胞提取物，這說明干酪乳桿菌KDB-LC生長期間的代謝產物對羥基自由基的清除發(fā)揮更重要的作用，抗氧化能力更強。實施例4體內抗氧化動物實驗4.1實驗設計體內抗氧化功能實驗采用高脂氧化應激模型。實驗動物使用健康昆明種小鼠40只，雌雄各半，體重23士2g，由江蘇無錫惠山江南實驗動物場提供。小鼠在室溫下飼養(yǎng)，自由采食飲水，經(jīng)3d的適應性飼養(yǎng)后，隨機分成4組，每組10只，飼喂基礎飼料(配方：89.5％普通飼料、10％豬油、0.5％膽固醇)，對照組每日灌胃0.2mL生理鹽水，其余三組分低中高三劑量灌胃不同濃度干酪乳桿菌KDB-LC，如表4所示，每日0.2mL/只，連續(xù)4周。末次給樣后禁食24h，迅速采集血液，分離紅細胞和血清，檢測紅細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、全血谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、血漿過氧化氫酶(CAT)活性、血漿丙二醛(MDA)含量，所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計軟件SPSS進行統(tǒng)計學處理。試劑盒購于南京建成生物工程公司。表4抗氧化功能評價的動物實驗組別飼喂方式對照組0.3ml生理鹽水/只+基礎飼料低劑量0.3ml菌液(細胞濃度0.01g/ml)/只+高脂飼料中劑量0.3ml菌液(細胞濃度0.02g/ml)/只+高脂飼料高劑量0.3ml菌液(細胞濃度0.04g/ml)/只+高脂飼料4.2結果分析4.2.1超氧化物歧化酶(SOD)超氧化物歧化酶(SOD)，是具有專一清除生物體內的超氧離子，能平衡機體的氧自由基。它可以清除過度超氧陰離子自由基，減少由超氧陰離子自由基產生的疾病。本發(fā)明中灌胃干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠紅細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響見表5。表5干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠紅細胞SOD活力影響組別SOD活性(U/mgHb)對照組215.33±1.12低劑量241.21±1.01中劑量263.61±2.36*高劑量299.81±1.57**P＜0.05從表5可以看出，相對于對照組，中劑量和高劑量小鼠的紅細胞SOD酶活力存在顯著性差異，酶活力得到較大提高，從而說明本發(fā)明的干酪乳桿菌KDB-LC能顯著提高SOD酶活力，具有較強的抗氧化能力。4.2.2谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結構和功能的作用。灌胃干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠紅細胞谷胱甘肽過氧化物酶活力的影響見表6。表6干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠紅細胞谷胱甘肽過氧化物酶活力影響組別GSH-Px(酶活力單位)對照組132.23±0.87低劑量150.21±2.45中劑量172.33±4.02*高劑量187.67±2.44**P＜0.05從表6可以看出，高劑量組小鼠紅細胞谷胱甘肽過氧化物酶活力高達187.67，比對照組提高了41.9％，從而說明本發(fā)明的干酪乳桿菌KDB-LC可以顯著提高小鼠紅細胞谷胱甘肽過氧化物酶的活力。4.2.3過氧化氫酶過氧化氫酶在機體內普遍存在，催化過氧化氫分解為水和氧氣。過氧化氫是機體代謝的有毒副產物，經(jīng)過過氧化氫酶催化轉化成其它低毒的化學物，防止機體受到損傷。灌胃干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠過氧化氫酶活性影響見表7。表7灌胃干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠過氧化氫酶活性影響組別CAT活性(U/ml)對照組1.66±1.21低劑量1.89±2.61中劑量2.72±3.87*高劑量2.91±3.32**P＜0.05從表7可以看出，三個處理組的過氧化氫酶活性均明顯高于對照組，且相對于對照組，中劑量和高劑量組過氧化氫酶的活性分別提高了63.9％和75.3％，從而說明本發(fā)明的干酪乳桿菌KDB-LC能顯著提高小鼠機體內過氧化氫酶的活性，高劑量的干酪乳桿菌KDB-LC可以有效改善小鼠的抗氧化能力。4.2.4丙二醛丙二醛水平反應了機體內脂質過氧化，間接地反映出細胞損傷的程度。灌胃干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠紅細胞丙二醛水平的影響見表8。表8灌胃干酪乳桿菌KDB-LC對小鼠紅細胞丙二醛水平影響*P＜0.05從表8可以看出，與對照組相比，三個劑量的處理組丙二醛含量均明顯降低，其中高劑量干酪乳桿菌KDB-LC使小鼠紅細胞內丙二醛的含量降低了56.8％，從而說明本發(fā)明的干酪乳桿菌KDB-LC可以有效減輕小鼠體內自由基對細胞的損傷，保護小鼠的正常細胞。綜上所述，本發(fā)明提供的干酪乳桿菌KDB-LC可以顯著提高高脂氧化模型小鼠體內超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的酶活性，降低機體內丙二醛的水平，從而有效提高小鼠的抗氧化能力，增強機體免疫力。實施例5利用干酪乳桿菌KDB-LC制備益生菌乳飲料將脫脂乳粉配制成12％的復原脫脂乳150kg，采用95℃處理8～10min后，冷卻至37～40℃；按3％～5％接種量接種本發(fā)明所述干酪乳桿菌KDB-LC，37℃培養(yǎng)20～24h，終點酸度控制在160～175°T；加入350kg經(jīng)90～110℃/5～10s殺菌的糖、穩(wěn)定劑的混合物(該混合物的組成為1.2％～1.5％的果膠和11.5％～14.8％的蔗糖)，混合均勻后，20～25MPa均質，然后在72℃/15s條件下熱處理，冷卻至15～20℃，采用無菌或衛(wèi)生灌裝，即得到500kg干酪乳桿菌KDB-LC乳飲料，其中活菌數(shù)超過30億/mL。實施例6益生菌乳飲料的效果評價從健康人群中隨機挑選成年男女各10名，收集其新鮮糞便檢測其中的乳酸菌及雙歧桿菌數(shù)平均為2.21×108CFU/g和8.12×109CFU/g。20名健康成年人每天食用本發(fā)明所述益生菌乳飲料50ml，一周后檢測其新鮮糞便中乳酸菌及雙歧桿菌數(shù)平均為9.34×109CFU/g和8.88×1011CFU/g。從結果看，食用該益生菌乳飲料能明顯提高人體腸道內乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，有效改善胃腸道健康，提高機體免疫力，取得了意料不到的技術效果。此外，長期研究數(shù)據(jù)表明，每日飲用本發(fā)明提供的益生菌乳飲料，不僅能大幅增加腸道中益生菌的數(shù)量，改善胃腸道的消化與吸收功能，還能有效降低人體血液中膽固醇的含量，清除自由基，增強機體的免疫力，維護身體健康。當前第1頁1 2 3