專利名稱:細胞電融合芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種細胞電融合芯片,具體的說是準確高效的完成細胞一對一電融合的芯片。
背景技術(shù):
電融合技術(shù)是上世紀80年代建立起來的一種新型促融合技術(shù)。1981年Zimmerman 發(fā)明了電融合儀,并首次提出了電融合概念;1987年,Schweiger建立了單對原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。其基本原理是將兩種細胞的混合液置于低壓交流電場中,使細胞聚集成串珠狀,然后施加高壓電脈沖,以促使細胞融合。細胞融合的主要目的是研究異種細胞融合后基因重組的影響因素,產(chǎn)生雜交瘤細胞,以及植物和微生物細胞雜交育種等。通過幾十年的發(fā)展,電融合技術(shù)已經(jīng)日臻成熟,它的許多優(yōu)點也越來越得到顯現(xiàn),表現(xiàn)在如下幾個方面1.誘導(dǎo)細胞融合的頻率是所有融合方法中最高的,比傳統(tǒng)方法高出10-100倍,特別是對遠緣細胞、難融合的細胞的融合具有較好的效果。2.對細胞無毒害作用,優(yōu)于化學融合和病毒介導(dǎo)的細胞融合;3.適用范圍廣泛,動物、植物和微生物都可以用該技術(shù)進行細胞融合研究。盡管細胞電融合技術(shù)在育種、雜交研究和細胞克隆方面得到了成功應(yīng)用,但是還存在一些問題。問題在于細胞自由接觸而導(dǎo)致的有效融合率低。在傳統(tǒng)的電融合過程中, 細胞在交流電場中形成串珠狀排隊是隨意發(fā)生的,既兩種相同的細胞也可排隊,在接下來的直流電場中的融合就會發(fā)生多種情況,同種細胞融合以及兩個以上細胞融合都會發(fā)生, 而試驗所需的異種細胞直接的融合所占比例就非常小。這樣將導(dǎo)致隨后的篩選工作非常復(fù)雜,嚴重地降低了試驗效率。本發(fā)明就是針對這些問題,利用微加工技術(shù)和微流體原理,而設(shè)計的準確高效的完成細胞一對一電融合的芯片。
發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個方面,提供了一種細胞電融合芯片,其特征在于包括中空密閉的細胞融合室;設(shè)置在所述細胞融合室第一端的第一細胞加樣孔;設(shè)置在所述細胞融合室第二端的第二細胞加樣孔;設(shè)置在所述細胞融合室兩側(cè)底部的細胞定位通道;與所述細胞定位通道連通的細胞吸取通道;第一細胞吸取口 ;第二細胞吸取口。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面,提供了一種采用細胞電融合芯片進行細胞電融合的方法,所述細胞電融合芯片包括中空密閉的細胞融合室;
設(shè)置在所述細胞融合室第一端的第一細胞加樣孔;設(shè)置在所述細胞融合室第二端的第二細胞加樣孔;設(shè)置在所述細胞融合室兩側(cè)底部的細胞定位通道;與所述細胞定位通道連通的細胞吸取通道;第一細胞吸取口 ;第二細胞吸取口,其特征在于所述方法包括使第一加樣孔通過管路與細胞懸液連通,使第一吸取口的通過管路連接注射泵,開啟所述注射泵將所述細胞懸液吸入細胞融合室。
圖1為根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的平面示意圖。圖2為根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的細胞融合室一個細胞配對單元的截面示意圖。圖3為根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的細胞配對示意圖。附圖標記說明1-芯片整體、2-細胞融合室、3-細胞定位通道、4-細胞吸取通道、 5-第一吸取口、6_第一加樣孔、7-第二加樣孔、8-第二吸取口。
具體實施例方式本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)細胞電融合儀的不足,利用微加工技術(shù),完成一種細胞電融合芯片,準確高效的完成異種細胞之間的一對一配對并進行電融合。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案,細胞電融合芯片包括細胞融合室,細胞定位通道和細胞吸取通道。每側(cè)的細胞吸取通道末端連接有注射泵,在注射泵的吸取作用下從細胞融合室連通的加樣孔中的細胞液向細胞融合室流入,在每個細胞定位通道處吸取一個細胞。 另一側(cè)的細胞定位通道吸取另一種細胞。在細胞吸取完畢后,細胞吸取通道末端的電極加電,使細胞發(fā)生一對一的電融合。所述細胞融合室寬度為30-60 μ m,高度為30-60 μ m,長度為2-2. 5cm,兩側(cè)底部分布有細胞定位通道。細胞融合室兩端分別為細胞加樣孔。所述細胞定位通道定位于細胞融合室兩側(cè)底部,間隔80 μ m,每個通道橫截面為邊長3-10 μ m的正方形,通道長100-200 μ m。通道末端連接細胞吸取通道,逐級連通放大至末端開口即細胞吸取口,直徑為1mm。吸取口可連接注射泵和加電極。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,優(yōu)點在于(1)細胞融合室兩側(cè)的細胞定位通道分別吸附不同細胞,細胞完全可以特異性配對,且配對率高。(2)每個細胞定位通道只能吸附一個細胞,每次嚴格允許兩個細胞發(fā)生融合,大大方便于后續(xù)的篩選和研究工作。(3)細胞融合室和細胞定位通道的尺寸可調(diào),適用于不同大小的細胞進行融合。(4)芯片材料用透明的聚二甲基硅氧烷制成,具有方便觀察和可高壓滅菌等優(yōu)點。下面結(jié)合具體附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
如圖1和圖2所示,根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的細胞電融合芯片包括芯片體1, 芯片體1中設(shè)有中空密閉的細胞融合室2。圖2是圖1的一個細胞配對單元的截面圖,其關(guān)系見附圖。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施例,細胞融合室2寬度為諸如30-60 μ m,高度為 30-60 μ m,長度為2-2. 5cm。細胞融合室兩端分別設(shè)有細胞加樣孔6和7。細胞融合室兩側(cè)底部分布有細胞定位通道3。細胞定位通道3與細胞吸取通道4連通,細胞吸取通道4逐級放大加粗到細胞吸取口 5和8。細胞加樣孔6和7以及細胞吸取口 5和8分別與直徑Imm 軟管連接。細胞加樣孔6和7的軟管分別與兩種不同的細胞液連接。細胞吸取口5和8與注射泵連接,也可連接電極。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的細胞電融合芯片的工作原理及使用方法如下(以人紅白血病細胞K562細胞和中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞配對和融合為例)(1)將芯片正置于試驗臺上,將第一加樣孔6所連接的直徑Imm軟管放入K562細胞懸液中。將第二加樣孔7和第二吸取口8連接的小軟管封死。第一吸取口5的軟管連接注射泵,開啟注射泵將K562細胞吸入細胞融合室2。細胞懸液從第一加樣孔6橫向流動布滿整個細胞融和室,同時流向側(cè)向的細胞定位通道,細胞在流體的作用下吸附在細胞定位通道末端。持續(xù)一段時間后大量細胞吸附在與第一吸取口 5連接的細胞定位通道3末端并保持較大的流速使細胞達到穩(wěn)定吸附。(2)將第一加樣孔6的軟管放入無細胞電融合液中,第二加樣孔7軟管連接注射泵,以較小的流速將細胞融合室2中未吸附的細胞沿著第一加樣孔6向第二加樣孔7方向
洗出。停止。(3)將第二加樣孔7連接的直接Imm軟管放入CHO細胞懸液中。將第一吸取口 5 和第一加樣孔6連接的小軟管封死。第二吸取口 8的軟管連接注射泵,開啟注射泵將CHO 細胞吸入細胞融合室2,持續(xù)一段時間后大量細胞吸附在與第二吸取口 8連接的細胞定位通道3末端并保持較大的流速使細胞達到穩(wěn)定吸附。(4)將第二加樣孔7的軟管放入無細胞電融合液中,第一加樣孔6軟管連接注射泵,以較小的流速將細胞融合室2中未吸附的細胞洗出。停止后將第一加樣孔封死。(5)將細胞吸取口 5和8連接的電極與電源接通,在交流電的作用下使兩側(cè)細胞定位通道上吸附的不同細胞更加靠近,在直流電作用下使兩個細胞發(fā)生融合,如圖3。(6)融合后細胞在細胞融合室3中靜置30min后從一側(cè)的細胞加樣孔吸出,進行下一步的篩選和分析。本發(fā)明的細胞電融合芯片不僅限于上述兩種細胞,可以通過修改細胞定位通道和細胞融合室的大小適用于不同大小的細胞之間的融合。
權(quán)利要求
1.細胞電融合芯片,其特征在于包括 中空密閉的細胞融合室O);設(shè)置在所述細胞融合室第一端的第一細胞加樣孔(6); 設(shè)置在所述細胞融合室第二端的第二細胞加樣孔(7); 設(shè)置在所述細胞融合室兩側(cè)底部的細胞定位通道(3); 與所述細胞定位通道(3)連通的細胞吸取通道(4); 第一細胞吸取口(5); 第二細胞吸取口(8)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞電融合芯片,其特征在于所述細胞吸取通道(4)逐級放大加粗到所述第一細胞吸取口(5)和第二細胞吸取口(8)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細胞電融合芯片,其特征在于所述第一細胞加樣孔(6)和第二細胞加樣孔(7)通過管路分別與兩種不同的細胞液連ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2的細胞電融合芯片,其特征在于所述第一細胞吸取口( 和所述第二細胞吸取口(8)可與注射泵和/或電極相連。
5.采用細胞電融合芯片進行細胞電融合的方法,所述細胞電融合芯片包括 中空密閉的細胞融合室O);設(shè)置在所述細胞融合室第一端的第一細胞加樣孔(6); 設(shè)置在所述細胞融合室第二端的第二細胞加樣孔(7); 設(shè)置在所述細胞融合室兩側(cè)底部的細胞定位通道(3); 與所述細胞定位通道(3)連通的細胞吸取通道(4); 第一細胞吸取口(5); 第二細胞吸取口(8), 其特征在于所述方法包括將第二加樣孔(7)和第二吸取口(8)的連接管路封死, 使第一加樣孔(6)通過管路與細胞懸液連通, 使第一吸取口( 的通過管路連接注射泵, 開啟所述注射泵將所述細胞懸液吸入細胞融合室O)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其特征在于開啟所述注射泵將所述細胞懸液吸入細胞融合室O)的步驟持續(xù)一段時間,從而使大量細胞吸附在與第一吸取口(5)連接的細胞定位通道(3)末端,并保持較大的流速使細胞達到穩(wěn)定吸附,其中所述細胞懸液是人紅白血病細胞懸液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其特征在于進一步包括 將第一吸取口(5)和第二吸取口(8)的連接管路封死, 使第一加樣孔(6)通過管路與無細胞電融合液連通, 使第二加樣孔(7)通過管路與注射泵連接,以較小的流速將細胞融合室O)中未吸附的細胞洗出。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其特征在于進一步包括將第一加樣孔(6)和第一吸取口( 的連接管路封死, 使第二加樣孔(7)通過管路與細胞懸液連通, 把第二吸取口(8)通過管路連接到注射泵,開啟注射泵將中國倉鼠卵巢細胞吸入細胞融合室O),持續(xù)一段時間后大量細胞吸附在與第二吸取口 8連接的細胞定位通道3末端并保持較大的流速使細胞達到穩(wěn)定吸附。 將第二加樣孔7通過管路與無細胞電融合液連通, 第一吸取口(5)和第二吸取口(8)的連接管路封死, 使第一加樣孔6通過連接到注射泵, 以較小的流速將細胞融合室2中未吸附的細胞洗出, 停止洗出后將第一加樣(6)孔封死。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法,其特征在于進一步包括第一細胞吸取口 5和第二細胞吸取口 8連接的電極與電源接通, 在交流電的作用下使兩側(cè)細胞定位通道上吸附的不同細胞更加靠近, 在直流電作用下使兩個細胞發(fā)生融合,使融合后細胞在細胞融合室O)中靜置預(yù)定時間后從第一加樣孔(6)或第二加樣孔 (7)吸出。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中的任何一項的方法,其特征在于通過修改細胞定位通道和細胞融合室的大小,以適用于不同大小的細胞之間的融合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細胞電融合芯片,可以準確高效的完成細胞一對一電融合,可在生物醫(yī)學工程領(lǐng)域的科研中應(yīng)用。本細胞電融合芯片由細胞融合室,細胞定位通道和細胞吸取通道組成。細胞吸取通道連接注射泵,兩種不同細胞分別被吸附并定位在位于細胞融合室的細胞定位通道末端。細胞融合室間距允許兩個細胞軸向排列。細胞吸取通道外端加電極,通以交流電和直流電,使細胞融合室中兩個異種細胞之間發(fā)生兩兩融合。本發(fā)明可大大提高異種細胞配對和融合的概率,操作簡單,一次可完成大量細胞融合,并具有易于觀測的特點。
文檔編號C12N15/02GK102174391SQ20111005814
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者劉姚萍, 孫艷, 崔紹艷, 樊瑜波, 王瑋 申請人:北京大學, 北京航空航天大學