專利名稱：一種制備與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合的青霉素結(jié)合蛋白的方法及專用重組菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備與β -內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合的青霉素結(jié)合蛋白的方法及專用重組菌。
背景技術(shù)：
食品中殘留的抗生素會(huì)破壞胃腸道菌群平衡，并可導(dǎo)致長(zhǎng)期的腹瀉、維生素缺乏及影響其他藥物的療效，從而影響人體健康。當(dāng)前抗生素的殘留問題已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注，作為人們生活中的必需品，牛奶中的抗生素殘留問題更是日益受到關(guān)注。如何確保牛奶質(zhì)量安全，除了嚴(yán)格控制產(chǎn)業(yè)鏈中抗生素的使用外，建立牛奶中抗生素的快速檢測(cè)方法則顯得尤為重要。牛奶中的抗生素殘留主要來(lái)源于奶牛的飼料以及奶牛的疾病治療，其中奶牛主要的疾病是乳腺炎，而治療乳腺炎最常用的藥物是內(nèi)酰胺類抗生素。目前牛奶中內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)方法主要有儀器法(包括高效氣相色譜、高效液相色譜以及色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等)、微生物法、免疫分析方法以及受體分析方法等。這些方法各有特點(diǎn)儀器法準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，是一種確證方法，但是不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；微生物法可同時(shí)檢測(cè)多種抗生素，但靈敏度不高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且無(wú)法定量；免疫分析方法基于抗原抗體的特異結(jié)合，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可定量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，但由于靈敏度高且可識(shí)別同一類藥物的抗體難以獲得，制約了其在抗生素檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用；受體方法基于受體配體間的特異識(shí)別，在國(guó)外早有研究，且有產(chǎn)品問世(包括比利時(shí)UniSensor、美國(guó)Charm等)，但國(guó)內(nèi)鮮有研究。歐盟制定了內(nèi)酰胺類抗生素在牛奶中的最高殘留限量青霉素、氨芐西林、阿莫西林為4ppb ； 苯唑西林、鄰氯西林、雙氯西林、新青霉素III為30ppb ；頭孢喹肟20ppb ；頭孢噻呋、頭孢氨芐IOOppb ；頭孢唑啉、頭孢哌酮50ppb。青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-Binding Protein, PBP)是廣泛存在于細(xì)菌表面的一種膜蛋白，是內(nèi)酞胺類抗生素的主要作用靶位。但是目前制備青霉素結(jié)合蛋白的效率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明所提供的重組菌，按照包括如下步驟的方法制備得到向出發(fā)大腸桿菌中導(dǎo)入青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因，得到重組大腸桿菌。上述重組菌中，所述青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；所述重組表達(dá)載體為向出發(fā)載體pET28b的多克隆位點(diǎn)間插入所述青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因得到的。上述任一所述重組菌中，所述青霉素結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。上述任一所述重組菌中，所述出發(fā)大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3)，所述青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。上述任一所述重組菌具體可為如下重組菌重組菌，其名稱為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli) ρΕΤ2^3-ΡΒΡ2χ，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4629。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備SEQ ID NO 1所示蛋白的方法。本發(fā)明所提供的種制備SEQ ID NO :1所示蛋白的方法，包括如下步驟發(fā)酵上述任一所述重組菌，得到SEQ ID NO :1所示蛋白。上述方法中，所述發(fā)酵中包括如下用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的步驟在所述發(fā)酵的體系的 Α_為0. 6時(shí)，向所述發(fā)酵的體系中加入IPTG，使IPTG在所述發(fā)酵的體系中的濃度為ImM。上述任一所述方法中，所述誘導(dǎo)的方法包括如下步驟所述發(fā)酵的溫度為37°C， 所述發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到向LB液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素，使卡那霉素在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為30ug/mL，得到的混合溶液為所述培養(yǎng)基。上述任一所述方法中，在所述發(fā)酵后，包括如下提取步驟取發(fā)酵后的重組菌菌體，將其破碎，取上清液。上述任一所述方法中，在所述提取后，包括如下純化步驟將所述上清液進(jìn)行鎳柱親和層析，收集洗脫液；所述鎳柱親和層析中，使用的洗脫緩沖液按照如下方法制備得到 將20mmol Tris,0. 5mol NaCl、500mmol咪唑用水溶解，用HCl調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升洗脫緩沖液。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備青霉素結(jié)合蛋白的方法得率高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中得率不高、制備困難的問題。因此，本發(fā)明方法具有重要意義。


圖1為PBP h基因PCR瓊脂糖電泳圖。圖2為PBP 2x基因與ρΕΤ2^載體連接后酶切鑒定圖。圖3為IPTG誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)全蛋白SDS-PAGE圖。
圖4為PBP 2χ蛋白純化SDS-PAGE圖。圖 5 為 PBP 2χ 蛋白 western blot 圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。氨芐西林購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為A9518。表達(dá)載體ρΕΤ2^3購(gòu)自德國(guó)Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為69865 ；大腸桿菌 BL21(DE3)購(gòu)自德國(guó)Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為69387 ；蛋白純化用His · Bind Columns購(gòu)自德國(guó)Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為70971 ；T4DNA Ligase購(gòu)自美國(guó) Promega公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M1801S。肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) R6購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 (American type culture collection, ATCC)，編號(hào)為 ATCC 49619 (http://www. atcc. org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default. aspx)。 化物酶(HRP)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。
載體PMD19-T購(gòu)自TAKARA公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為D102A。His-tag單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為AB102-02和SA101-01。實(shí)施例1、重組菌的制備肺炎鏈球菌R6基因組作為模板，應(yīng)用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶NdeI和SioI酶切PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收2250bp左右的目的基因片段(即PBP2x目的基因)；電泳結(jié)果如圖1所示，泳道1-6為目的基因，泳道7 為 markerο上游引物5，-TTCATATGATGAAGTGGACAAAAAGA-3，(5，端含有NdeI 酶切位點(diǎn)、保護(hù)
堿基)下游引物5，-TTCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAAT-3’(3，端含有 XhoI 酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基)回收目的基因片段，將其與PMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，通過抗性篩選陽(yáng)性單克隆，將陽(yáng)性單克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果在PMD19-T 中插入的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，表明構(gòu)建的重組載體正確，記作PMD 19-Τ-ΡΒΡ2χο用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶切PMD19_T_PBPh，回收2250bp左右的目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶NdeI和B10I酶切pED8b，回收載體大片段；將目的基因片段和載體大片段用T4 DNA Ligase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，通過抗性篩選陽(yáng)性單克隆， 將陽(yáng)性單克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序和分別作NdeI單酶切、B10I單酶切以及 NdeI+XhoI雙酶切鑒定。結(jié)果在pET28b的NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)間(沿著從NdeI至XhoI 的方向)插入的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示(記作青霉素結(jié)合蛋白PBP2x)。表明重組載體中基因插入方向和序列均正確， 將陽(yáng)性重組載體記作重組表達(dá)載體pET28b-PBPh。酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，單酶切大小在7300bp左右，雙酶切有2300bp左右和5000bp左右的條帶，說明目的基因已經(jīng)正確連接入pET28b。圖2中，泳道1 :NdeI單酶切；泳道2 =XhoI單酶切；泳道3 :NdeI/XhoI雙酶切； 泳道 4 :Marker。構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pET28b_PBPh轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，卡那霉素抗性篩選，獲得陽(yáng)性單克?。粚@得的陽(yáng)性單克隆接種于含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序，結(jié)果表明提取的質(zhì)粒正確，表明構(gòu)建的重組菌正確，記作重組菌 BL21-pET28b-PBPh。同時(shí)以轉(zhuǎn)入pET28b的大腸桿菌BL21 (DE3)為對(duì)照菌，記作重組菌BL21_pEI^8b。實(shí)施例2、蛋白的制備與純化一、蛋白的制備將重組菌BL21-pEI^8b-PBPh接種至含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基中， 250rpm 37°C振搖，過夜培養(yǎng)(1 )，得到種子液；取ImL種子液接種于IOOmL含卡那霉素 30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基，250rpm 37°C振搖，至培養(yǎng)體系的A_為0. 6時(shí)，先取出ImL菌液，作為未誘導(dǎo)對(duì)照，其余菌液加入IPTG至終濃度ImM，200pm 30°C搖菌，從誘導(dǎo)第3個(gè)小時(shí)開始(加入IPTG時(shí)記作第O小時(shí))，每小時(shí)取出ImL菌液，誘導(dǎo)時(shí)間分別為!3h、4h、
55h、6h、7h、8h以及過夜(12h)；將收集的菌液在4°C下IOOOOrpm離心5min，收集菌體；用 Tris-HCLdOmM Tris pH7. 0)重懸菌體，200W功率冰浴超聲(超聲10s，停IOs)破碎菌體至懸液變澄清，再4°C、12000Xg離心20min，收集上清液，即為青霉素結(jié)合蛋白提取液。將培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作菌液。含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基的制備向LB液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素， 使卡那霉素在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為30ug/mL，得到的混合溶液為含卡那霉素30ug/mL 的LB液體培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基組成由酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成，溶液中各成分的濃度為酵母提取物0.5% (質(zhì)量百分含量)，蛋白胨(質(zhì)量百分含量)，NaCl 1% (質(zhì)量百分含量)。二、蛋白的純化青霉素結(jié)合蛋白純化利用表達(dá)載體上帶有的組氨酸標(biāo)簽(His-tag)標(biāo)記通過鎳離子親和層析純化青霉素結(jié)合蛋白。先用10倍柱體積的binding buffer平衡His ·Β η(1 Columns，加入上述青霉素結(jié)合蛋白提取液，然后用5倍柱體積的wash buffer洗脫雜蛋白， 最后用10倍柱體積的elution buffer洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的青霉
素結(jié)合蛋白ο同時(shí)以重組菌BL21_pEI^8b的表達(dá)產(chǎn)物為對(duì)照。binding buffer 將 20mmol Tris、0. 5mol Nacl 禾Π IOmmol 咪唑用水溶解，用 HCL 調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升binding buffer。wash buffer 將 20mmol Tris、0. 5mol NaCl 和 20mmol 咪唑用水溶解，用 HCL調(diào) PH 值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升wash buffer。elution buffer 將 20mmol Tris、0. 5mol Nacl 和 500mmol 咪唑用水溶解，用 HCL 調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升elution buffer。三、蛋白驗(yàn)證1、將純化前后產(chǎn)物及IPTG誘導(dǎo)前后產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖3和圖4 所示。圖3為重組菌BL21-pEI^8b-PBPh的結(jié)果，泳道1 未誘導(dǎo)對(duì)照組；泳道2 8 分別為重組菌株經(jīng)3、4、5、6、7、8小時(shí)以及過夜誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)圖；泳道9 =Marker0圖4為重組菌BL21-pEI^8b_PBPh的結(jié)果，泳道1 :Marker ；泳道2 未誘導(dǎo)的未純化的重組菌株全蛋白；泳道3 誘導(dǎo)但未純化的重組菌株全蛋白；泳道4 誘導(dǎo)且純化后的蛋白。結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌BL21-pEI^8b-PBPh中含有80kD 左右有明顯的條帶，與目的蛋白的預(yù)期大小一致，PBPh蛋白表達(dá)成功。而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌BL21-pEI^8b-PBPh中不含有目的條帶。無(wú)論誘導(dǎo)與否，重組菌BL21-pED8b的表達(dá)產(chǎn)物中不含目的條帶。2、蛋白驗(yàn)證 Western blot 收集上述制備過程中各階段產(chǎn)物，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳；將電泳條帶印跡到NC 膜上，再依次與His-tag單克隆抗體以及HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體雜交，DAB顯色。結(jié)果如圖5所示。圖5中，泳道1 :Marker ；泳道2 未誘導(dǎo)的未純化的重組菌
6BL21-pEI^8b-PBPh全蛋白；泳道3 誘導(dǎo)但未純化的重組菌BL21-pEI^8b_PBPh全蛋白； 泳道4 重組菌BL21-pEI^8b-PBPh的誘導(dǎo)且純化后的蛋白。結(jié)果表明重組菌BL21-pEI^8b_PBPh表達(dá)得到的蛋白分子量為80kD左右，與預(yù)期的蛋白分子量一致。重組菌BL21-pED8b的表達(dá)產(chǎn)物中未含有目的蛋白。四、蛋白產(chǎn)量從固體篩選培養(yǎng)基上挑取8個(gè)重組菌BL21-pEI^8b_PBPh的菌落(分別標(biāo)記為 BL21-pET28b-PBP2x-l _8)，將其分別接種于2mL含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基中， 250rpm 37°C振搖，培養(yǎng)他后，得到種子培養(yǎng)液；將ImL種子培養(yǎng)液接種于200mL含卡那霉素 30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基，250rpm 37°C振搖，至培養(yǎng)體系的A_為0.6時(shí)，先取出ImL菌液， 作為未誘導(dǎo)對(duì)照，其余菌液加入IPTG至終濃度lmM，200rpm3(TC搖菌，他后收集所有菌液；將收集的菌液在4°C下IOOOOrpm離心5min，收集菌體；用iTris-HCLaOmM Tris pH7. 0)重懸菌體，200W功率超聲(超聲10s，停IOs)破碎菌體至懸液變澄清，再4°C、12000Xg離心20min， 收集上清液，即為青霉素結(jié)合蛋白提取液。將培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作菌液。將8株菌分別得到的青霉素結(jié)合蛋白提取液分別用鎳離子親和層析柱純化，純化方法與實(shí)驗(yàn)二中所述一致，將純化得到的蛋白分別記作PBPh-I 8，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量，進(jìn)而計(jì)算純化的目的蛋白的量。PBPh-I -8所得目的蛋白總量分別為 1. 27mg、l. 36mg、l. llmg、2. 02mg、2. 54mg、2. 33mg、l. 87mg 和 2. 08mg,由此可見由重組菌 BL21-pET28b-PBP2x-5誘導(dǎo)表達(dá)得到的PBPh-5產(chǎn)量最高。該重組菌BL21-pEI^8b-PBPh_5已于2011年3月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 46 ，該菌株的分類命名為大腸 ±矣希氏菌(Escherichia coli)，菌株名稱為 pET28b_PBPh。利用重組菌BL21-pEI^8b-PBPh_5按照上述方法制備目的蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，3 次結(jié)果平均為2. 5mg、2. 54mg,2. 6mg，表明的產(chǎn)生目的蛋白的穩(wěn)定性好。實(shí)施例3、蛋白活性檢測(cè)1、包被青霉素結(jié)合蛋白的酶標(biāo)板實(shí)施例2中制備的青霉素結(jié)合蛋白，用包被緩沖液配置成lug/mL ；每孔100uL。2、酶標(biāo)物HRP標(biāo)記的氨芐西林，其工作濃度lug/mL，酶標(biāo)物工作液是用樣品稀釋液稀釋酶標(biāo)物得到的。3、β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品為青霉素G凍干粉，青霉素G購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司；產(chǎn)品目錄號(hào)為46616 ；將青霉素G用樣品稀釋液溶解，得到如下不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液8. 1 μ g/L、2. 7 μ g/L、0. 9 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 1 μ g/L。4、底物顯色液由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1 %四甲基聯(lián)苯胺的水溶液；5、終止液0. 2M硫酸水溶液；6、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將0. 5ml吐溫20、5g疊氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;7、樣品稀釋液0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 2。
8、包被緩沖液0. 05mol/L的碳酸鈉的水溶液、pH9. 6。9、封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將50mgBSA、lg疊氮化鈉、30g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。HRP標(biāo)記的氨芐西林的制備a.取 50mg 氨節(jié)西林，溶于 5mL PBS (0. 05mol/L, pH7. 0)溶液中；b.加入 40mg EDC，4°C攪拌反應(yīng) Ih ；c.取 IOOmg 的 HRP 以及 IOmg EDC 溶于 IOmLPBS (0. 05mol/L, ρΗ7· 0)溶液中，與上述溶液混合，4°C攪拌反應(yīng)48h ；d.裝入透析袋，PBS (0. 05mol/L, pH7. 0)透析，得到氨芐西林與HRP的偶聯(lián)物，即為酶標(biāo)物。0. 05M、pH值為7. 0的PBS緩沖液的配制先分別配置0. 05mol/L Na2HPO4溶液 (稱取 Na2HPO4. Iffl2O 17. 9g,加去離子水至 1000m L)和 0. 05mol/L KH2PO4 溶液(稱取 KH2PO4. 2H20 8. 6g，加去離子水至 1000m L)；取 0. 05mol/L Na2HPO4 溶液 60m L 和 0. 05mol/ LKH2PO4溶液40m L，加入8. 5g NaCL,混合均勻。0. 01M、pH值為7. 4的PBS緩沖液的配制每1升磷酸鹽緩沖液(PBS)按照如下方法制備將 8g NaCl,0. 2g KCl,3. 53g Na2HPO4. 12Η20、0· 24g KH2PO4 和水混合，用水定容至 1 升。如此得到的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, pH值為7. 4。0. 1Μ、ρΗ值為7. 2的PBS緩沖液的配制先分別配置0. lmol/L Na2HPO4溶液(稱取 Na2HPO4. 12H20 35. 8g，加去離子水至 IOOOmL)和 0. lmol/L NaH2PO4 溶液(稱取 NaH2PO4. 2H20 15. 6g，加去離子水至 1000m L)；取 0. lmol/L Na2HPO4 溶液 72m L 和 0. ImoVLNaH2PO4 溶液 28m L，加入8. 5g NaCL，混合均勻。0. 02M、pH值為7. 2的PBS緩沖液的配制取0. 1Μ、ρΗ值為7. 2的PBS緩沖液200mL， 加入去離子水800mL，混勻即得。0. 05mol/L、pH 值為 9. 6 的碳酸鈉的水溶液的配制=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g， 加水定容至1升。向包被有青霉素結(jié)合蛋白的酶標(biāo)板微孔中加入50uL梯度稀釋的β -內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素類梯度區(qū)間為0 IOOppb ；頭孢菌素類梯度區(qū)間為0 500ppb)，再加入酶標(biāo)物工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，甩干孔中液體，每孔加入350 μ L 洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板4次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色lOmin，每孔加入終止液50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測(cè)定每孔吸光度值。用每個(gè)濃度的β -內(nèi)酰胺類抗生素溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)0濃度溶液的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以β -內(nèi)酰胺類抗生素濃度(μ g/L) 的半對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制曲線，得到每種內(nèi)酰胺類抗生素的50% 抑制濃度(IC50)。β -內(nèi)酰胺類抗生素如下青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、鄰氯西林、雙氯西林、新青霉素III、羧芐西林、甲氧西林、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢噻呋、頭孢喹肟。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。文中 ppb 即是 ng/ml。結(jié)果如下1)吸光度值與每孔所加入的各β -內(nèi)酰胺類抗生素濃度成反比，證明所表達(dá)純化得到的青霉素結(jié)合蛋白具有識(shí)別多種內(nèi)酰胺類抗生素的特性，并呈現(xiàn)線性關(guān)系，說明該青霉素結(jié)合蛋白可用于多種內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)。2)交叉反應(yīng)率先計(jì)算各種藥物的IC50 陽(yáng)性對(duì)照孔(即不添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孔)的吸光度值為Btl，各實(shí)驗(yàn)孔的吸光度值為B，當(dāng)Bz^1為50 %時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度即為半抑制率(IC50)；以氨芐西林為標(biāo)準(zhǔn)藥物，計(jì)算交叉反應(yīng)率，即氨芐西林的IC50除以各藥物的IC50乘以100%即得。結(jié)果見表1。結(jié)果如表1所示，PBP 2χ蛋白可以識(shí)別包括青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐等在內(nèi)的至少16種β -內(nèi)酰胺類藥物。表1多種β -內(nèi)酰胺藥物的交叉反應(yīng)率
權(quán)利要求
1.一種重組菌，按照包括如下步驟的方法制備得到向出發(fā)大腸桿菌中導(dǎo)入青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因，得到重組大腸桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于所述青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；所述重組表達(dá)載體為向出發(fā)載體pET28b的多克隆位點(diǎn)間插入所述青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述青霉素結(jié)合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌，其特征在于所述出發(fā)大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)，所述青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.一株重組菌，其名稱為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)ρΕΤ2^_ΡΒΡ&，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 46 。
6.一種制備SEQ ID NO :1所示蛋白的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求1-5中任一所述重組菌，得到SEQ ID NO :1所示蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵中包括如下用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的步驟在所述發(fā)酵的體系的A6tltl為0. 6時(shí)，向所述發(fā)酵的體系中加入IPTG，使IPTG在所述發(fā)酵的體系中的濃度為ImM。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)的方法包括如下步驟所述發(fā)酵的溫度為37°C，所述發(fā)酵中使用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到向LB液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素，使卡那霉素在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為30ug/mL，得到的混合溶液為所述培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述發(fā)酵后，包括如下提取步驟取發(fā)酵后的重組菌菌體，將其破碎，取上清液。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述提取后，包括如下純化步驟將所述上清液進(jìn)行鎳柱親和層析，收集洗脫液；所述鎳柱親和層析中，使用的洗脫緩沖液按照如下方法制備得到將20mmol Tris,0. 5mol NaCl,500mmol咪唑用水溶解，用HCl調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升洗脫緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備與β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合的青霉素結(jié)合蛋白的方法及專用重組菌。該重組菌按照包括如下步驟的方法制備得到向出發(fā)大腸桿菌中導(dǎo)入青霉素結(jié)合蛋白的編碼基因，得到重組大腸桿菌。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備青霉素結(jié)合蛋白的方法得率高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中得率不高、制備困難的問題。因此，本發(fā)明方法具有重要意義。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102181394SQ201110058180
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者丁雙陽(yáng), 史為民, 吳聰明, 張靜, 曾昆, 江海洋, 汪洋, 沈建忠 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)