專利名稱：用于結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10(cfp-10)定量檢測的標準品研制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，特別是涉及兩種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的鏈親和素/結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10融合蛋白。
背景技術(shù)：
結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10 (Culture Filtrate Protein 10，CFP10)為結(jié)核分枝桿菌所特有，非致病分枝桿菌和卡介苗(BCG)則缺乏這種蛋白。許多研究表明CFPlO蛋白是免疫優(yōu)勢抗原，具有很強的細胞免疫活性，能激活T細胞并刺激記憶T細胞的產(chǎn)生。CFPlO 經(jīng)常出現(xiàn)在結(jié)核病人中，但不出現(xiàn)在已感染非致病分枝桿菌或接種BCG的健康人中，檢測 CFPlO可以避免因非致病分枝桿菌感染或接種卡介苗而出現(xiàn)假陽性問題。因此，CFPlO已成為診斷結(jié)核病的一個重要分子靶標。鏈親和素(SA)是由親和素鏈霉菌產(chǎn)生的非糖基化同源四聚體蛋白，可結(jié)合四個生物素。它能與生物素非共價緊密結(jié)合(Kd= IO-15M),其結(jié)合力是抗原一抗體間作用力的一千至一百萬倍。由于鏈親和素可與生物素快速且?guī)缀醪豢赡娴膹娏Y(jié)合， 以及生物素較容易參入各種生物分子(如蛋白質(zhì)，核酸和脂多糖)中，即生物素化，故鏈親和素一生物素間的強力作用早已用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域(Sano，Τ. and Cantor, C.R.Streptavidin-containing chimeric proteins :design and production. Methods Enzymo 1. 2000 ；326 :305_311.)。利用基因工程技術(shù)，現(xiàn)已表達出許多含鏈親和素的融合蛋白；鏈親和素不會影響融合蛋白中另一肽段的活性，有的甚至還能增強其生物活性或/和穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是研制時間分辨熒光免疫分析(time-resloved immunofluorometric assay, TRFIA)檢測結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白IO(CFPlO)試劑盒的參考標準品。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接1個鏈親和素和1個結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白 10構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser0本發(fā)明融合蛋白可將鏈親和素基因、結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10基因以及接頭 DNA，通過基因重組、轉(zhuǎn)化以及原核表達獲得，其中基因重組、轉(zhuǎn)化以及原核表達的方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟識的技術(shù)。為了便于融合蛋白的分離純化，本發(fā)明融合蛋白SEQ NO. 1的鏈親和素的C端含6 個組氨酸標簽，本發(fā)明融合蛋白SEQ N0. 2的鏈親和素的N端含6組氨酸標簽。本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列，該DNA序列由成熟鏈親和素cDNA、結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白 10 cDNA 通過 TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCC 連接而成。 將所述的編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列通過基因重組插入到原核表達載體中， 然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得高效表達本發(fā)明融合蛋白的工程菌。本發(fā)明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化蛋白并復(fù)性處理后，即可獲得本發(fā)明融合蛋白。本發(fā)明鏈親和素/結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10(SA/CFP10)融合蛋白可作為研制時間分辨熒光免疫分析檢測CFPlO試劑盒的標準品。夾心ELISA檢測研究表明CFP10_SA融合蛋白的靈敏度是SA-CFPlO融合蛋白的5倍以上，兩者穩(wěn)定性相當(dāng)；而CFPlO-SA的靈敏度則是CFPlO的20倍以上，且有較好的穩(wěn)定性。因此，CFPlO-SA融合蛋白適合用作時間分辨熒光免疫分析檢測CFPlO試劑盒的標準品。


圖1是CFP10-L-SA-6His_pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖2是6His-SA-L-CFP10_pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖3是CFP10-L-SA-6His融合蛋白的表達SDS-PAGE電泳圖，其中1是分子量標準 (97. 2,66. 4,44. 3、29、20、14. 3KD)，2是工程菌誘導(dǎo)前，3是工程菌誘導(dǎo)后；4是破菌破上清， 5是包涵體。圖4是CFP10-L-SA-6His融合蛋白的Ni-NTA柱層析純化SDS-PAGE電泳圖。其中1是分子量標準(97. 2,66. 4,44. 3、29、20KD)，2是復(fù)性后還原(29. 8KD) ；3是復(fù)性后非還原。圖5是6His-SA-L-CFPlO融合蛋白的表達SDS-PAGE電泳圖，其中1是分子量標準(97. 2,66.4,44. 3、29、20、14. 3KD)，2是工程菌25°C誘導(dǎo)前，3是工程菌25°C誘導(dǎo)后；4是 25°C誘導(dǎo)后上清；5是25°C誘導(dǎo)后包涵體；6是工程菌37°C誘導(dǎo)前；7是工程菌37°C誘導(dǎo)后； 8是37°C誘導(dǎo)后上清；9是37°C誘導(dǎo)后包涵體。圖6是6His-SA-L-CFP10融合蛋白的Ni-NTA柱層析純化SDS-PAGE電泳圖。其中1 是分子量標準(97. 2,66. 4,44. 3、29、20KD)，2是復(fù)性后非還原；3是復(fù)性后還原(29. 1KD)。圖7是時間分辨熒光免疫分析檢測CFP10-L-SA-6His融合蛋白、6His-SA-L_CFP10 融合蛋白和CFPlO蛋白的靈敏度。圖8是時間分辨熒光免疫分析檢測CFP10-L-SA-6His融合蛋白、6His-SA-L_CFP10 融合蛋白和CFPlO蛋白的穩(wěn)定性。圖9是以CFP10-L_SA-6His融合蛋白用作時間分辨熒光免疫分析檢測CFPlO試劑盒的參考標準品的標準曲線。下面將通過實施例進一步說明本發(fā)明以及本發(fā)明具有的技術(shù)效果。
具體實施例方式下述實施例和實驗所用的材料及設(shè)備如下細胞株、菌株與質(zhì)粒菌株Str印tomyces avidinii (親和素鏈霉菌，ATCC)，DH5 α 禾口 Rosetta ；原核表達質(zhì)粒 pET24a (Kanar, Novagen)。
主要生化試劑及材料=DNeasy組織試劑盒和質(zhì)粒DNA的制備試劑盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)，Trizol,superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶，Platinum Pfx DNA聚合酶和 T4 DNA 連接酶(Invitrogen)，瓊脂糖和 SDS-PAGE (Biorad)，Ni-NTA (Qiagen) ±真料，CFPlO 標準品以及抗CFPlO單克隆抗體(Biodesign)。DNA片段的連接、轉(zhuǎn)化 及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠點 ^^^M^&^^MJCW. (Sambrook J,et al. Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或廠家提供的產(chǎn)品說明書；DNA序列分析在大連寶生物工程公司的DNA測序服務(wù)中心完成。例1. CFP10-L-SA-6His融合蛋白的制備1、用DNeasy組織試劑盒從親和素鏈霉菌抽提出細菌的基因組DNA，然后用其作為模板，通過Platinum pfx DNA聚合酶進行PCR制備成熟鏈親和素cDNA。引物5， GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCGGATCCGCCGACC CCTCCAAGGACTCGAAGGCC 3’ (78nt)和 5’ GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3，(39nt)。反應(yīng)條件變性94°C，2min，循環(huán)(94°C，15s — 60°C，15s — 68°C，30s)，25 輪，最后 68 °C, 5min。2、用DNeasy組織試劑盒從結(jié)核桿菌H37Rv培養(yǎng)物中抽提出細菌的基因組DNA，然后用其作為模板，通過Platinum pfx DNA聚合酶進行PCR制備CFPlO cDNA。引物5，-CGGATCCCATATGGCAGAGATGAAGACCGA-3，(3Int)和 5，-CGGAATTCAAGCTTG AAGCCCATTTGCGAGGA-3’ (32nt)。反應(yīng)條件變性94°C，2min,循環(huán)(94°C，20s — 55°C，30s — 68°C，60s) 30 輪，最后 68 °C, 5min。3、構(gòu)建 CFP10-L-SA-6His_pET24 重組質(zhì)粒制備的CFPlO cDNA (不含終止碼，兩端分別含Nde I和EcoR I限制性內(nèi)切酶位點) 和SA cDNA(不含終止碼，兩端分別含EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點)，將上述CFPlO 和SA基因片段克隆于pET-24a載體中，獲得CFP10-L-SA-6His-pET24重組表達質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖1所示)。其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽(15肽)。重組表達質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定，驗證其正確無誤。4、構(gòu)建 CFP10-L-SA_6His-pET24/Rosetta 工程菌CFP10-L-SA-6His-pET24重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后Rosetta感受態(tài)細胞后，用含卡那霉素的LB平皿篩選。挑取轉(zhuǎn)化平皿上的單菌落接種于加有卡那霉素(20yg/ml)的LB培養(yǎng)基中。經(jīng)37°C搖床培養(yǎng)擴增至吸光度A600為0. 4 0. 5時，加入終濃度為0. lmmol/L的 IPTG，37°C誘導(dǎo)表達4h，離心(8000gX10min)收獲菌體，將細胞破碎后用12%的SDS-PAGE 檢測分析融合蛋白的表達情況。5、CFP10-L-SA_6His 融合蛋白的表達CFP10-L-SA-6His融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式存在，分子量為 29. 8KD,其表達量達20 30 %。6、從包涵體中獲得CFP10-L-SA_6His融合蛋白a.制備包涵體5克菌體懸于IOOml IxPBS中，冰浴中超聲(電流270mA)，30秒X 10次(每次間隔30秒)；接著于4 °C離心10分鐘(SOOOg)，將沉淀懸浮于IOOml IxPBS(內(nèi)含 4mol/L 尿素，0. 5% Triton X-100, 20mmol/L EDTA)中進行漂洗，隨后離心 (IOOOgX 10分鐘)收集沉淀；漂洗兩次后，溶于50mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素 (pH8. 0)中，15000gX15分鐘，取上清液。b. Ni-NTA柱層析將步驟a得到的上清液上樣于Ni-NTA(2. 6X5cm)，用平衡液 (50mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，0. 5mmol/LNaCl,pH8. 0)進行沖洗至樣品A28tl恢復(fù)至基線；然后用洗脫液(50mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，0. 5mmol/LNaCl,pH8. 0，其中咪唑分別為 30mmol/L，50mmol/L, 1 OOmmo 1/L, 200mmol/L)進行洗脫，洗脫液經(jīng) SDS-PAGE 鑒定， 收集CFP10-L-SA-6His融合蛋白峰。c.透析復(fù)性將Ni -NTA柱層析純化獲得的CFP10-L_SA-6His融合蛋白調(diào)至OD28tl =0. 2，在大于20倍體積的透析液(50mmol/L磷酸鈉緩沖液，4. Omol/L尿素，0. 2mmol/ LNaCl，5%甘油，pH8. 0)中4°C透析復(fù)性8小時；然后在50mmol/L磷酸鈉緩沖液、2. Omol/L 尿素、2. 5%甘油，pH8. 0)中4°C透析復(fù)性8小時；再在50mmol/L磷酸鈉緩沖液、1. Omol/L尿素、1. 25%甘油，pH8. 0)中4°C透析復(fù)性8小時；最后在50mmol/L磷酸鈉緩沖液中繼續(xù)透析 8小時；離心除去不溶物，收集上清。將收集的CFP10-L-SA-6His融合蛋白質(zhì)液調(diào)至pH8. 0， 并過濾除菌分裝，儲存于-20°C。所得CFP10-L-SA-6His融合蛋白用SDS-PAGE鑒定(29. 8KD)，結(jié)果如圖3、圖4所不。7、時間分辨熒光免疫分析對CFP 10-L-SA-6Hi s融合蛋白進行檢測，靈敏度為 0.15ng/ml。例2. 6His-SA-L-CFP 10融合蛋白的制備1、制備成熟鏈親和素cDNA 方法與例1同。引物5，-GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACC ATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG-3，(5 5nt)和 5' -GGAATTCGGCGGATCCGCCCCC GCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGG CGTCGAGCGGGTTGCC-3， (82nt)。2、制備CFP10 cDNA 方法與例1同。引物5，-CGGATCCCATATGGCAGAGATGAAGACCGA-3，(3Int)和 5，-CGGAATTCAAGCTTG AAGCCCATTTGCGAGGA-3’ (32nt)。3、構(gòu)建 6His-SA-L-CFP10-pET24 重組質(zhì)粒制備的SA cDNA(不含終止碼，兩端分別含Nde I和BamH I限制性內(nèi)切酶位點)和 CFP10 cDNA(不含終止碼，兩端分別含BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點)，將上述SA基因片段和CFP10克隆于pET-24a載體中，獲得6His-SA-L_CFP10-pET24重組表達質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖2所示)。其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽(15肽)。重組表達質(zhì)粒經(jīng)DNA 序列分析鑒定，驗證其正確無誤。4、構(gòu)建 6His-SA-L-CFP10_pET24/Rosetta 工程菌方法與例 1 同。5,6His-SA-L-CFP 10 融合蛋白的表達6His-SA-L-CFP10融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式存在，分子量為 29. 1KD,其表達量達20 30 %。6、從包涵體中獲得6His-SA-L-CFP 10融合蛋白方法與例1同。
7、時間分辨熒光免疫分析對6Hi s-SA-L-CFP 10融合蛋白進行檢測，靈敏度為 0. 78ng/ml。例3.本發(fā)明融合蛋白靈敏度檢測將CFP10-L_SA-6His融合蛋白、 6Hi s-SA-L-CFP 10融合蛋白和CFP10進行系列遞比稀釋，然后用時間分辨熒光免疫分析進行檢測，三種蛋白的檢測靈敏度如下CFP10-L-SA-6His融合蛋白0. 15ng/ml ； His-SA-L-CFPlO 融合蛋白0· 78ng/ml ；CFPlO 3. 8ng/ml (圖 7)。例4.本發(fā)明 融合蛋白穩(wěn)定性檢測分別取8ng/ml CFP10-L_SA-6His融合蛋白、 40ng/ml 6His-SA-L-CFP 10 融合蛋白和 200ng/ml CFPlO 取 2ml 置于室溫下(20_25°C ) 一個月，每隔7天用時間分辨熒光免疫分析對三種蛋白進行檢測，熒光信號變化如圖8所示。例5.將CFP10-L_SA-6His融合蛋白作為時間分辨熒光免疫分析檢測CFPlO的標準品(圖9)，將CFP10-L-SA-6His蛋白進行系列稀釋，濃度分別為0. 2、1、5、25、125ng/ml， 兩個復(fù)孔取平均值，制做標準曲線，Y=L 03X+4. 03，R = O. 9994。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接1個鏈親和素和1個結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10 構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的C端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.NO 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的N端。
5.一種基因，該基因編碼權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白。
6.一種表達載體，該表達載體含有權(quán)利要求5所述的基因。
7.—種工程菌，該工程菌轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求6所述的表達載體。
8.權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白在結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10檢測中作為標準
全文摘要
本發(fā)明提供了一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10構(gòu)成，其接頭肽氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10-鏈親和素的抗原活性比鏈親和素-結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10高5倍以上，兩者穩(wěn)定性相當(dāng)；結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10-鏈親和素的抗原活性比后者高20倍以上，穩(wěn)定性高10倍以上。因此，結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10-鏈親和素適合用作結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10試劑盒的標準品。時間分辨熒光免疫分析是一種靈敏度非常高、線性范圍寬、定量準確的免疫學(xué)方法，本發(fā)明融合蛋白擬用作時間分辨熒光免疫分析檢測CFP10的標準品，建立檢測CFP10的新方法，從而對結(jié)核病進行快速、特異、準確的診斷。
文檔編號C12N1/21GK102180972SQ20111006010
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者呂建新, 許曉玲, 鄒立林, 郭芳芳, 高基民 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院