專利名稱：酶法制備磷脂酰膽堿型ω-3不飽和脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω -3不飽和脂肪酸的方法。
背景技術(shù)：
磷脂酰膽堿被譽(yù)為與蛋白質(zhì)、維生素并列的“第三營(yíng)養(yǎng)素”，被美國(guó)國(guó)家科學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)列為每日必需營(yíng)養(yǎng)素。而且美國(guó)、歐洲、日本等已將磷脂酰膽堿在臨床上用于動(dòng)脈粥樣硬化、急慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、神經(jīng)衰弱等疾病治療。Ω-3不飽和脂肪酸(簡(jiǎn)稱 Ω-3)具有促進(jìn)嬰幼兒頭腦和視力發(fā)育、預(yù)防心血管疾病、降血脂、延緩衰老、預(yù)防老年性癡呆、防止癌癥等生理功能。近年來(lái)，Ω-3與磷脂酰膽堿的雙重作用，成為醫(yī)藥研究的熱門課題，引起人們的極大關(guān)注。最近的研究表明，Ω-3的生理功能因其在脂肪中的分子形式不同而不同，Ω-3在磷脂酰膽堿分子中比在甘油酯分子中更利于人體消化吸收，其氧化穩(wěn)定性更好，并且磷脂酰膽堿分子形態(tài)可以原封不動(dòng)地被細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)分解，顯示出增效作用。比如，磷脂酰膽堿型Ω-3與乙酯/甘油酯型Ω-3相比，前者在降低血清膽固醇的作用方面作用更明顯。當(dāng)Ω-3掛在磷脂酰膽堿分子上的時(shí)侯，磷脂酰膽堿型Ω-3更加容易通過(guò)血腦屏障， 進(jìn)入腦中。酒精對(duì)肝的損傷特點(diǎn)是纖維變性及磷脂結(jié)合的薄膜變異，而磷脂酰膽堿型Ω-3 對(duì)酒精肝纖維變性有極好的延緩作用。磷脂酰膽堿型Ω-3具有細(xì)胞分化誘導(dǎo)的作用，更是引起研究人員的高度關(guān)注。所以磷脂酰膽堿型Ω-3作為食品添加劑、保健品、藥品具有極高的商業(yè)價(jià)值。雖然從魚和雞蛋中富集得到含Ω-3的磷脂酰膽堿是可以實(shí)現(xiàn)的，如中國(guó)專利申請(qǐng)03807522. 9從魚內(nèi)臟中提取含有多不飽和脂肪酸組成的磷脂的脂質(zhì)混合物的方法和中國(guó)專利申請(qǐng)200810016223. 1 —種提取富含二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA) 磷脂的方法，都是以魚類海產(chǎn)動(dòng)物為原料提取磷脂酰膽堿型Ω-3。但是提取和分離的過(guò)程比較復(fù)雜，成本高，而且需要使用的有機(jī)溶劑較多，環(huán)保壓力大。與傳統(tǒng)的提取純化技術(shù)相比，生物酶法具有成本低、污染小、無(wú)高溫加工過(guò)程等優(yōu)勢(shì)，所以我們利用生物酶法制備富集Ω-3的磷脂酰膽堿，有利于市場(chǎng)大規(guī)模的推廣，前景看好。這方面，如中國(guó)專利申請(qǐng) 200710113934. 6 一種制備富含多不飽和脂肪酸磷脂的工藝，就是利用酶催化魚油Ω-3和大豆磷脂合成磷脂型Ω-3，但是該專利的起始原料大豆磷脂是一種甘油酯、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、絲氨酸磷脂和磷脂酸的混合物，反應(yīng)后不僅磷脂酰膽堿型Ω-3 含量少，而且酯轉(zhuǎn)化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率很低，更為不利于產(chǎn)業(yè)化的是該專利所用的反應(yīng)介質(zhì) R134a是一種化工原料，不能用于食品的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種成本低、污染小、純度高，富含DPA、EPA 和DHA的酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括如下工藝步驟 步驟一以海豹油甘油三酯為原料，經(jīng)脂肪酶選擇性酶解并分離純化，得到高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸；
步驟二 將步驟一得到的高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸作為原料，加入溶血磷脂酰膽堿，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸產(chǎn)品。步驟二中所述的酶為脂肪酶、磷脂酶Al或磷脂酶Α2。步驟一中所述的脂肪酶由圓柱形假絲酵母菌、熒光假單胞菌、黑曲霉菌、白地霉無(wú)根菌、巢子須霉德氏根霉菌、毛霉菌、綿毛狀腐質(zhì)霉菌或圓弧青霉菌產(chǎn)生。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
海豹油富含DPA、EPA、DHA,和母乳中Ω -3的組成類型完全一樣，DPA的功效是DHA的十倍以上，故選擇海豹油甘油三酯作為原料，制備高純度海豹油Ω -3不飽和脂肪酸，然后以高純度海豹油Ω-3為原料獲得的磷脂酰膽堿不僅含二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)，還含有二十二碳五烯酸(DPA)，這是和以魚油Ω-3為原料得到的產(chǎn)品的區(qū)別。將這種磷脂酰膽堿型Ω-3添加到嬰幼兒奶粉中，不僅有利于Ω-3的高效吸收，而且更加符合母乳配方的要求。海豹油原油中Ω-3不飽和脂肪酸的含量為15-20%，利用脂肪酶的選擇性，將Ω-3 不飽和脂肪酸從海豹油甘油三酯中降解下來(lái)，被降解下來(lái)的不飽和脂肪酸與剩余的甘油二酯的理化性質(zhì)差別很大，通過(guò)相分離和萃取等方法將它們分離和提純，得到高純度的海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸，其純度可達(dá)80%左右。采用溶血磷脂酰膽堿為原料，酯交換的反應(yīng)效率比采用大豆磷脂要高。大豆磷脂是一種磷脂酰膽堿、甘油酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、絲氨酸磷脂和磷脂酸的混合物，相當(dāng)多的Ω-3會(huì)和非磷脂酰膽堿的成分發(fā)生反應(yīng)。溶血磷脂酰膽堿是由磷脂酰膽堿去除部分非Ω-3脂肪酸獲得的，和Ω-3酯交換反應(yīng)時(shí)，由于反應(yīng)體系中非Ω-3的比例低，更多的 Ω-3易結(jié)合到溶血磷脂酰膽堿分子中形成磷脂酰膽堿型Ω-3。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的技術(shù)路線以及工藝包括如下兩步
步驟一海豹油甘油三酯為原料，經(jīng)脂肪酶選擇性酶解并分離純化，得到高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸；
步驟二 將步驟一得到的高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸作為原料，加入溶血磷脂酰膽堿，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸產(chǎn)品。上述，步驟一中所述的脂肪酶由圓柱形假絲酵母菌、熒光假單胞菌、黑曲霉菌、白地霉無(wú)根菌、巢子須霉德氏根霉菌、毛霉菌、綿毛狀腐質(zhì)霉菌或圓弧青霉菌產(chǎn)生。結(jié)合上述工藝步驟，將本發(fā)明的制備方法進(jìn)行進(jìn)一步闡述。實(shí)施例1
步驟一，高純度海豹油游離型Ω -3不飽和脂肪酸的制備
在反應(yīng)容器中加入海豹油5. 5克和PH為7的磷酸鹽緩沖液5-6mL，再加入1000U/ mL 黑曲霉脂肪酶，在40°C條件下攪拌酶解8小時(shí)，用0. 3mol/L氫氧化鈉乙醇溶液開(kāi)展相分離， 除去甘油二酯，獲得的游離脂肪酸相；取4-6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圓底燒瓶中，放入60_65°C水浴中，攪拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游離脂肪酸相的燒杯中，邊攪拌邊冷卻至室溫，置于冰箱中-35度結(jié)晶，將結(jié)晶混合物迅速抽濾，得結(jié)晶包合物和濾液兩部分， 其中多數(shù)飽和脂肪酸被包合在晶體中，濾液中的多不飽和脂肪酸因而得到富集。經(jīng)過(guò)除雜純化，可獲得純度達(dá)78%的高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸。步驟二，磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的制備
取高純度海豹油游離型Ω -3不飽和脂肪酸0. 6克、溶血磷脂酰膽堿0. 12克、正己烷4 mL、l. 2克磷脂酶A2，反應(yīng)溫度在38°C條件下，攪拌20小時(shí)，然后過(guò)濾，再將濾液在60°C減壓蒸餾，回收正己烷。將3mL丙酮加入到剩下的溶液中，游離脂肪酸會(huì)溶解在丙酮中，而磷脂酰膽堿不溶解，過(guò)濾，將沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反應(yīng)產(chǎn)物。實(shí)施例2
步驟一，高純度海豹油游離型Ω -3不飽和脂肪酸的制備
在反應(yīng)容器中加入海豹油5克和PH為8的磷酸鹽緩沖液5mL，再加入800U/ mL假絲酵母脂肪酶，在35°C條件下攪拌酶解10小時(shí)，用0. 25mol/L氫氧化鈉乙醇溶液開(kāi)展相分離， 除去甘油二酯，獲得游離脂肪酸相；取4-6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圓底燒瓶中，放入60-65°C水浴中，攪拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游離脂肪酸相的燒杯中，邊攪拌邊冷卻至室溫，置于冰箱中-35度結(jié)晶，將結(jié)晶混合物迅速抽濾，得結(jié)晶包合物和濾液兩部分， 其中多數(shù)飽和脂肪酸被包合在晶體中，濾液中的多不飽和脂肪酸因而得到富集。經(jīng)過(guò)除雜純化，可獲得純度達(dá)79. 4%的高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸。步驟二，磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的制備
取高純度海豹油游離型Ω -3不飽和脂肪酸0. 5克、溶血磷脂酰膽堿0. 1克、正己烷3 mL、l. 5克磷脂酶Al，反應(yīng)溫度在40°C條件下，攪拌15小時(shí)，然后過(guò)濾，再將濾液在60°C減壓蒸餾，回收正己烷。將3mL丙酮加入到剩下的溶液中，游離脂肪酸會(huì)溶解在丙酮中，而磷脂酰膽堿不溶解，過(guò)濾，將沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反應(yīng)產(chǎn)物。實(shí)施例3
步驟一，高純度海豹油游離型Ω -3不飽和脂肪酸的制備
在反應(yīng)容器中加入海豹油5克和PH為8的磷酸鹽緩沖液5mL，再加入900U/ mL圓弧青霉脂肪酶，在35°C條件下攪拌酶解9小時(shí)，用0. 3mol/L氫氧化鈉乙醇溶液開(kāi)展相分離， 除去甘油二酯，獲得游離脂肪酸相；取4-6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圓底燒瓶中，放入60-65°C水浴中，攪拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游離脂肪酸相的燒杯中，邊攪拌邊冷卻至室溫，置于冰箱中-35度結(jié)晶，將結(jié)晶混合物迅速抽濾，得結(jié)晶包合物和濾液兩部分， 其中多數(shù)飽和脂肪酸被包合在晶體中，濾液中的多不飽和脂肪酸因而得到富集。經(jīng)過(guò)除雜純化，可獲得純度達(dá)76%的高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸。步驟二，磷脂酰膽堿型Ω -3不飽和脂肪酸的制備
取高純度海豹油游離型Ω -3不飽和脂肪酸0. 5克、溶血磷脂酰膽堿0. 1克、正己烷3 mL、1. 8克假絲酵母脂肪酶，反應(yīng)溫度在50°C條件下，攪拌10小時(shí)，然后過(guò)濾，再將濾液在 60°C減壓蒸餾，回收正己烷。將3mL丙酮加入到剩下的溶液中，游離脂肪酸會(huì)溶解在丙酮中，而磷脂酰膽堿不溶解，過(guò)濾，將沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反應(yīng)產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法，其特征在于所述方法包括如下工藝步驟步驟一以海豹油甘油三酯為原料，經(jīng)脂肪酶選擇性酶解并分離純化，得到高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸；步驟二 將步驟一得到的高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸作為原料，加入溶血磷脂酰膽堿，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法，其特征在于步驟二中所述的酶為脂肪酶、磷脂酶Al或磷脂酶Α2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法， 其特征在于步驟一的具體方法為在反應(yīng)容器中加入海豹油5-6克和PH為7-8的緩沖液5-6mL，再加入800-1OOOU/ mL脂肪酶，在20-40 °C條件下攪拌酶解8_10小時(shí)，用 0. 2-0. 4mol/L氫氧化鈉乙醇溶液開(kāi)展相分離，除去甘油二酯，獲得的游離脂肪酸相，取4_6 g尿素和25-35 mL乙醇加入一圓底燒瓶中，放入60-65°C水浴中，攪拌直至溶液澄清，迅速倒入盛有游離脂肪酸相的燒杯中，邊攪拌邊冷卻至室溫，置于冰箱中-35度結(jié)晶，將結(jié)晶混合物迅速抽濾，得結(jié)晶包合物和濾液兩部分，濾液經(jīng)過(guò)除雜純化，可獲得高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法，其特征在于步驟一中所述的脂肪酶由圓柱形假絲酵母菌、熒光假單胞菌、黑曲霉菌、白地霉無(wú)根菌、巢子須霉德氏根霉菌、毛霉菌、綿毛狀腐質(zhì)霉菌或圓弧青霉菌產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法，其特征在于所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法， 其特征在于步驟二的具體方法為在反應(yīng)容器中加入步驟一制得的高純度海豹油游離型 Ω -3不飽和脂肪酸0. 5-0. 7克，然后再加入溶血磷脂酰膽堿0. 1-0. 2克、正己烷3_5mL、1-2 克酶，反應(yīng)溫度在30-50°C條件下，攪拌10-20小時(shí)，然后過(guò)濾，再將濾液在60°C減壓蒸餾， 將3-5mL丙酮加入到剩下的溶液中，過(guò)濾，將沉淀物在真空干燥箱中干燥得到反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶法制備磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸的方法，其特征在于所述方法包括如下工藝步驟步驟一以海豹油甘油三酯為原料，經(jīng)脂肪酶選擇性酶解并分離純化，得到高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸；步驟二將步驟一得到的高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸作為原料，加入溶血磷脂酰膽堿，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸產(chǎn)品。本制備方法成本低、污染小、純度高，富含DPA、EPA和DHA。
文檔編號(hào)C12P13/00GK102181498SQ20111007291
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者徐楓, 李建洲, 雷繼雨 申請(qǐng)人:江陰貝科生物科技有限公司