專(zhuān)利名稱(chēng)：一種酸性磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酸性磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的最重要的養(yǎng)分之一。磷不僅是植物細(xì)胞內(nèi)多種生物大分子的結(jié)構(gòu)組成部分，而且還參與了植物生命活動(dòng)中多種生理生化過(guò)程。因此，農(nóng)作物是否能高效吸收和合理利用土壤中的磷素對(duì)其最后的產(chǎn)量有極其重要的影響。然而，今天世界上大部分耕地都存在缺磷問(wèn)題。在許多農(nóng)田中，雖然磷素絕對(duì)含量并不低，但可被植物吸收的無(wú)機(jī)磷酸根的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于作物最佳生長(zhǎng)的需求。土壤中50% -70%的磷是以有機(jī)磷的形式存在，包括植酸及土壤中各種腐殖質(zhì)中含有的有機(jī)磷，如核酸(DNA和RNA)，磷酸己糖等。 為了解決土壤缺磷問(wèn)題，目前在農(nóng)業(yè)上采取的方法主要是大量使用磷肥。而大量使用磷肥的后果一方面造成土壤質(zhì)量下降，同時(shí)引起嚴(yán)重的環(huán)境污染，造成農(nóng)民巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期使用磷肥還使得農(nóng)作物的磷素利用效率下降。更為嚴(yán)重的是，據(jù)報(bào)道，世界上用于生產(chǎn)磷肥的磷礦石僅夠再使用六、七十年，是一種非再生資源。因此通過(guò)現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)提高作物的磷素利用能力，已成為一個(gè)能否使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)保持可持續(xù)發(fā)展的重要課題。目前許多土壤中，雖然一方面可利用的有效磷嚴(yán)重缺乏，但另一方面，由于長(zhǎng)期使用化肥，事實(shí)上大多數(shù)農(nóng)田已成為一個(gè)巨大的潛在的磷庫(kù)。傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要通過(guò)改土施肥來(lái)提高作物產(chǎn)量，但很少以提高作物對(duì)土壤磷素利用效率進(jìn)行考慮。反之，植物自身在千萬(wàn)年漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，也演化出一些應(yīng)對(duì)低磷脅迫的策略，以確保其在低磷生長(zhǎng)條件下能更好地生長(zhǎng)和生存。這其中一個(gè)重要的應(yīng)答反應(yīng)就是合成和分泌酸性磷酸酶。目前一般認(rèn)為植物在低磷脅迫條件下在根部合成和分泌的酸性磷酸酶有助于分解周?chē)h(huán)境中的有機(jī)磷，釋放出可供根吸收利用的無(wú)機(jī)磷酸根離子，從而使得植物在低磷條件下能更好地生存和生長(zhǎng)。過(guò)去幾十年的研究表明植物根部所分泌的酸性磷酸酶可分兩類(lèi)。一類(lèi)是分泌后附著在根部表面。另一類(lèi)則在分泌后擴(kuò)散到周?chē)耐寥澜橘|(zhì)中去。由于無(wú)機(jī)磷酸根離子在土壤中的遷移速率很慢，因而從理論上說(shuō)附著于根表面的酸性磷酸酶對(duì)提高植物在低磷條件下的生存能力具有更大的意義。但迄今為止，尚未有關(guān)于根表面附著的酸性磷酸酶基因克隆的報(bào)道。由于缺乏對(duì)編碼根表面酸性磷酸酶相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)，因此目前無(wú)法利用基因工程對(duì)這一類(lèi)基因進(jìn)行遺傳操作，來(lái)達(dá)到改良農(nóng)作物品種的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下a)或b)或C)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)；c)與a)或b)限定的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)或4)所示1)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自5'末端起第61位-第2331位核苷酸所示 DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQ ID NO 2所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；所述嚴(yán)格條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)a)由SEQID NO 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQID NO :1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。c)與a)或b)限定的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3) 或4)所示1)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端起第61位-第2331位核苷酸所示DNA 分子；2)其核苷酸序列是SEQID NO 2所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有80%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)；和/或，所述引物對(duì)中的一條引物序列如SEQ ID NO :3所示，所述引物對(duì)中的另一條引物序列如SEQ ID NO 4所示。
5.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在表達(dá)載體PBI121 的多克隆位點(diǎn)插入所述編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求1所述蛋白在作為磷酸酶中的應(yīng)用；所述磷酸酶為酸性磷酸酶。
8.一種培育對(duì)磷的利用率提高的轉(zhuǎn)基因植物或培育耐低磷的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到對(duì)磷的利用率高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物或耐低磷性能高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述編碼基因是通過(guò)權(quán)利要求6或7所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種酸性磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID NO1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酸性磷酸酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明為利用基因工程手段培育高效利用土壤養(yǎng)分的農(nóng)作物新品種提供基因資源，可用于培育高效利用土壤養(yǎng)分的農(nóng)作物新品種。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102206617SQ201110078889
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者劉棟, 李征, 王良省 申請(qǐng)人:清華大學(xué)