專利名稱：豬博卡病毒的lamp檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬博卡病毒的LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增技術(shù))檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
2009年，瑞典科學(xué)家利用隨機(jī)多重置換擴(kuò)增方法在患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合 征的豬淋巴結(jié)中擴(kuò)增出了一段長1879 bp的核苷酸序列，該段序列與已知病毒序列比較，發(fā) 現(xiàn)其完整的NPl基因及部分VP1/VP2基因與人類博卡病毒相近，故將該病毒歸類為細(xì)小病 毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬的豬博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV) (Blomstrom 等 Detection of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome. Virus Res. 2009, 146:125-1 )。其基因組大小為5. 2kb左右，為單股線狀DNA。目前，豬博卡病毒在患病豬中被發(fā)現(xiàn)，而在健康豬體內(nèi)的檢出率較低，在患有斷奶 仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的患病豬中其檢出率高達(dá)88%(Blomstrom等Studies of porcine circovirus type 2, porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaning multisystemic wasting syndrome pigs. Virus Res. 2010，152: 59-64)。而且，豬博卡病毒常與豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2)、豬輸血傳播病毒(TTV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等發(fā)生混合感染，這表 明該病毒對(duì)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的發(fā)生起著某種作用。2009年，在我國豬群中也發(fā) 現(xiàn)了豬博卡病毒，其感染率高達(dá)38%，表明豬博卡病毒在我國豬群中廣泛存在(Zhai等High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch Virol. 2010， 155:1313-1317)。到目前為止，對(duì)豬博卡病毒在除瑞典和中國以外的世界其它地方的存在與流行情 況一無所知。現(xiàn)如今，對(duì)該病毒的檢測方法只有普通的PCR方法，其容易產(chǎn)生假陽性，對(duì)模 板質(zhì)量、儀器設(shè)備要求較高、不適合臨床上的現(xiàn)場檢測。環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由T. Notomi等發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技 術(shù)(Notomi, T. , et al. , Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid Res. 2000, 28，e63)，該技術(shù)依賴4條特異設(shè)計(jì)的引物和一種具有鏈置換特性的DNA 聚合酶，在等溫條件下可以高效、高特異性地?cái)U(kuò)增靶序列。近年來，國內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛 應(yīng)用于病原體檢測。如LAMP可以檢測多種病毒，例如病毒性出血性敗血病(VHS)、巨細(xì)胞病 毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、人皰疹病毒、番茄斑萎病毒等。目前國內(nèi)外均未見LAMP方法 在豬博卡病毒檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的豬博卡病毒LAMP檢測試劑盒避免了現(xiàn)有檢測手段存在的問題，相比較 其他的檢測手段，建立的豬博卡病毒LAMP方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、檢測周期短、操作 簡單方便的特點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
3本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒及 其檢測方法。本發(fā)明的試劑盒使用簡單，結(jié)果鑒定方便直觀，檢測特異性高，敏感性高，且易 于大范圍推廣應(yīng)用。技術(shù)方案
本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明設(shè)計(jì)一種豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒，該試劑盒包含如下4條引物，所 述引物的堿基序列分別如SEQ ID N0:USEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4所示。所述試劑盒包括反應(yīng)液A和STOR Green I，所述反應(yīng)液A具體為每22 μ 1反應(yīng) 液 A 的組分及含量為10 X ThermoPol Reaction Buffer 2. 5μ 1,2. 5 mM dNTP mix 2μ 1, IM betaine (甜菜堿)5 μ 1，IM 的 Mg2+2 μ 1，8U/μ 1 Bst DNA 酶 1 μ 1，超純水 7. 5 μ 1，以及 如下的引物
2 μ M堿基序列如SEQ ID NO: 1所示的引物0. 5 μ 1 ； 2 μ M堿基序列如SEQ ID NO: 2所示的引物0. 5 μ 1 ； 20 μ M堿基序列如SEQ ID NO: 3所示的引物0. 5 μ 1 ； 20 μ M堿基序列如SEQ ID Ν0:4所示的引物0. 5μ 1。本發(fā)明還涉及一種利用所述豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒的檢測方法，包括如 下步驟
(1)按照常規(guī)方法提取待檢樣品的核酸；
(2)取3μ 1提取的核酸加入22 μ 1反應(yīng)液A中，使終反應(yīng)體積為25 μ 1，混勻反應(yīng)液，
短暫離心；
(3)將步驟(2)配置的反應(yīng)液置于65°C恒溫1h進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
(4)取出上述擴(kuò)增反應(yīng)管，在其中加入1μ1 20XSYBR Green I，如反應(yīng)管中液體顏色 變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有豬博卡病毒；如果顏色為橘黃色，則說明樣品中不含豬博卡病有益效果
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的試劑盒使用簡單，結(jié)果鑒定方 便直觀；檢測特異性高，敏感性高，最低可檢測到10個(gè)拷貝；本發(fā)明的試劑盒使得檢測不 需要先進(jìn)的儀器，一步就可完成實(shí)驗(yàn)操作，減少了污染的機(jī)會(huì)，能較好的滿足目前對(duì)豬博卡 病毒現(xiàn)場的檢測的需要，用于進(jìn)出口檢疫，畜牧飼養(yǎng)場等的現(xiàn)場檢驗(yàn)，且易于大范圍推廣應(yīng)用。


圖1為實(shí)施例1中利用試劑盒檢測的結(jié)果圖；管1顏色為綠色，表明樣品中含有豬博卡 病毒；管2的反應(yīng)液顏色為橘黃色，表明樣品中不含豬博卡病毒。圖2為實(shí)施例2中試劑盒檢測的敏感性凝膠電泳結(jié)果圖； 圖3為實(shí)施例3中驗(yàn)證試劑盒體系特異性的凝膠電泳結(jié)果圖4為實(shí)施例中不同濃度Mg2+濃度下試劑盒擴(kuò)增效率的凝膠電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)說明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1
豬博卡病毒的LAMP檢測 步驟一，LAMP引物的設(shè)計(jì)
(1)從基因數(shù)據(jù)庫中檢索獲得豬博卡病毒的基因序列，通過DNAstar軟件進(jìn)行序列比 對(duì)，得到豬博卡病毒基因組的特異性保守序列SEQ ID N0:5 ；
(2)通過LAMP 引物設(shè)計(jì)軟件(Primer Explorer software, version 4· 0)對(duì)該保守序 列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，得到4條引物
Primer F3的序列如SEQ ID NO: 1所示； Primer B3的序列如SEQ ID N0:2所示； Primer FIP 的序列如 SEQ ID N0:3 所示； Primer BIP 的序列如 SEQ ID N0:4 所示； 步驟二，LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化
LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化通過Mg2+濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間三個(gè)參數(shù)的變化來確定最優(yōu) 反應(yīng)體系；首先反應(yīng)溫度設(shè)為64°C，反應(yīng)時(shí)間設(shè)為60分鐘，設(shè)置不同濃度的Mg2\l、2、3、4、 6、8 mM)，反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行凝膠電泳觀察，結(jié)果見圖4，由圖4可以確定最佳Mg2+濃度為4mM，如 此推類可以確定最佳反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)時(shí)間分別為65°C和Ih ；最終確定的最佳反應(yīng)體 系如下內(nèi)引物 FIP和 BIP 20 μ Μ，外引物 F3 和 Β3 2 μ M,2. 5 mM dNTP mix, IM betaine (甜菜堿)，4mM 的Mg2+，8U Bst DNA酶，1 XHiermoPol Reaction Buffer，超純水 7. 5 μ ，模 板DNA 3 μ L·最佳反應(yīng)條件65°C恒溫lh。步驟三，LAMP檢測程序
(1)配置22 μ 反應(yīng)液Α:22 μ 1反應(yīng)液A的組分及含量為 IOXThermoPol Reaction Buffer (美國 NEB 公司)2.5 μ 1， 20 μ M primer FIP 0. 5 μ 1,20 μ M primer BIP 0. 5μ 1, 2 μ M primer F3 0. 5 μ 1,2 μ M primer Β3 0. 5 μ 1， 2. 5 mM dNTP mix 2 μ 1， IM betaine (甜菜堿，美國Sigma公司)5 μ 1， IM 的 MgCl22y 1，
8U/y 1 Bst DNA 酶(美國 NEB 公司)1 μ 1， 超純水7. 5 μ 1。(2)用商品化DNA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司，No. 70701-50) 提取待檢樣品(疑似豬博卡病毒感染的豬的組織樣品)中的核酸；取3μ 1提取的核酸加入 22 μ 1反應(yīng)液A中，使終反應(yīng)體積為25 μ 1，混勻反應(yīng)液；
(3)將步驟(2)配置的反應(yīng)液置于65°C恒溫1h進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
(4)取出上述擴(kuò)增反應(yīng)管，在其中加入1μ 20XSYBR Green I (美國hvitrogen公 司)(超純水稀釋20倍)，如反應(yīng)管中液體顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有豬博卡病毒；如 果顏色為橘黃色，則說明樣品中不含豬博卡病毒。如圖1所示，圖1豬博卡病毒的LAMP檢 測體系最終反應(yīng)液中加入20 X熒光染料STOR Green I顏色變化，陽性反應(yīng)顏色變?yōu)榫G色(管1)；陰性反應(yīng)顏色為橘黃色(管2)。實(shí)施例2
LAMP檢測體系敏感性分析 用分光光度儀測定感染豬博卡病毒的組織樣品(感染博卡病毒(Bocavirus)的豬由 中國江蘇省蘇州常熟市謝橋豬場購買)中的豬博卡病毒核酸的0D260值，將數(shù)值代入公式 計(jì)算其濃度。然后將其做10倍梯度稀釋，稀釋后的各濃度為IO6 copies/ylUO5 copies/
μ IUO4Copies/μ 1......10°COpieS/μ 1，將其作為模板進(jìn)行LAMP檢測。LAMP方法的反
應(yīng)體系為實(shí)施例1中的最佳反應(yīng)體系以及最佳反應(yīng)時(shí)間和溫度。LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。 結(jié)果顯示LAMP檢測方法的靈敏度可達(dá)到檢測10個(gè)拷貝的豬博卡病毒核酸(圖 2)。實(shí)施例3
LAMP檢測體系特異性分析
為驗(yàn)證該LAMP檢測體系的特異性，用商品化的DNA和RNA提取試劑盒提取可能有潛在 交叉反應(yīng)的病毒的核酸，分別以豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬 偽狂犬病毒(所用病毒均購買自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)的核酸為模板進(jìn)行LAMP特異性檢測。反應(yīng)體系為25μ 1 體系，含有 IOXThermoPol Reaction Buffer (美國 NEB 公 司)2·5 μ 1，20 μ M primer FIP 0. 5 μ 1,20 μ M primer BIP 0.5 μ 1，2 μ M primer F3 0. 5μ 1,2 μ M primer Β3 0. 5μ 1,2. 5 mM dNTP mix 2μ1，1Μ betaine (甜菜堿，美 國 Sigma 公司)5 μ 1，IM 的 MgCl22 μ l,8U/y 1 Bst DNA 酶(美國 NEB 公司)1 μ 1，超純水 7. 5μ1，模板3μ1 ；反應(yīng)條件65°C恒溫1 h。結(jié)果顯示該LAMP檢測體系特異性良好，不能檢測到其他非目標(biāo)病毒核酸。如 圖3所示，圖3豬博卡病毒的LAMP特異性，1-6分別為豬博卡病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸 綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒；陰性對(duì)照；M為DNA Marker DL2000。所述序列為
SEQ ID N0:1 :5’ -CATAACACGTCAATGGTACG-3’ SEQ ID N0:2 :5’ -TGTATAACTGCAGCCTCAT-3， SEQ ID N0:3
5 ’ -GTGTTCTTATTCCGTTCCAAAAGTTTTTTCCGATATATAACGGCCACA-3’ SEQ ID N0:4
5 ’ -TTAACATGAACTCATACAGCTGTCATTTTTTTCCACCTTTTGTAGTTGTT-3’ SEQ ID NO:5 :CATAACACGTCAATGGTACGTGCCGATATATAACGGCCACAAATACACAAAACAGACAGAA ACAGATAATACTAACTTTTGGAACGGAATAAGAACACCATGGGGCTACATTAACATGAACTCATACAGCTGTCATTT TTCTCCAAATGACTGGCAAAGACTTTTAAACAACTACAAAAGGTGGAAACCAAAAAAAATGAGGCTGCAGTTATACA ACTTACAAATAAAGCAAGTAGTCCAACTAGGCACAGATACACTATACAACAATGATCTGACAGC
權(quán)利要求
1.一種豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含如下4條引物，所述 引物堿基序列分別如 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征是，試劑盒包括反應(yīng) 液A和STOR Green I，所述反應(yīng)液A具體為每 22 μ 1 反應(yīng)液 A 的組分及含量為10 X ThermoPol Reaction Buffer 2. 5μ 1,2. 5 mM dNTP mix 2 μ 1，5M 的甜菜堿 5 μ 1，IM 的 Mg2+2 μ 1，8U/μ 1 Bst DNA 酶 1 μ 1，超純水 7. 5 μ 1，以及如下的引物2 μ M堿基序列如SEQ ID NO: 1所示的引物0. 5 μ 1 ； 2 μ M堿基序列如SEQ ID Ν0:2所示的引物0. 5 μ 1 ； 20 μ M堿基序列如SEQ ID Ν0:3所示的引物0. 5 μ 1 ； 20 μ M堿基序列如SEQ ID Ν0:4所示的引物0. 5μ 1。
3.一種利用權(quán)利要求1或2所述試劑盒及檢測豬博卡病毒的LAMP檢測方法，包括如下步驟(1)按照常規(guī)方法提取待檢樣品的核酸；(2)取3μ 1提取的核酸加入22 μ 1反應(yīng)液A中，使終反應(yīng)體積為25 μ 1，混勻反應(yīng)液；(3)將步驟(2)配置的反應(yīng)液置于65°C恒溫1h進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；(4)取出上述擴(kuò)增反應(yīng)管，在其中加入1μ1 20XSYBR Green I，如反應(yīng)管中液體顏色 變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有豬博卡病毒；如果顏色為橘黃色，則說明樣品中不含豬博卡病
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種豬博卡病毒的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法；該試劑盒包含如下4條引物，所述引物的堿基序列分別如SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、SEQIDNo:3、SEQIDNo:4所示；利用所述試劑盒進(jìn)行檢測的方法包括如下步驟步驟一，按照常規(guī)方法提取待檢樣品的核酸；步驟二，利用所述LAMP檢測試劑盒檢測樣品核酸，判斷樣品中是否含有豬博卡病毒。本發(fā)明的試劑盒使用簡單，結(jié)果直觀，特異性及敏感性高。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102140556SQ20111009234
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者何孔旺, 倪艷秀, 呂立新, 周俊明, 張雪寒, 李彬, 毛立, 沈江萍, 溫立斌, 郭容利 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院