表達(dá)豬博卡病毒vp2蛋白的重組桿狀病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達(dá)豬博卡病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒及其應(yīng)用，PCR擴增一種豬博卡病毒VP2基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。將擴增到的豬博卡病毒VP2基因插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacTMHTB的BamHⅠ和XhoⅠ位點構(gòu)建為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac?HTB-VP2，然后將該重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒骨架質(zhì)粒的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過同源重組將VP2基因整合至桿狀病毒骨架質(zhì)粒Bacmid中，提取重組Bacmid?DNA轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后獲得重組桿狀病毒rBV-VP2，保藏號為：CCTCC?V201401。在昆蟲細(xì)胞中大量表達(dá)產(chǎn)生VP2蛋白及病毒樣顆粒，開發(fā)成一種有效的PBoV?VLPs亞單位疫苗。
【專利說明】表達(dá)豬博卡病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物病毒學(xué)與基因工程學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地指一種表達(dá)豬博卡病毒VP2蛋白的重組桿狀病毒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬博卡病毒(Porcine Bocavirus)于2009年首次在瑞典患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)和豬圓環(huán)病毒 2 型共感染的病豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)(Blomstrom AL 等.Detection of a novel porcine boca-like virusin the background of porcine circovirus type2induced postweaning multisystemicwasting syndrome.Virus Res2009，146:125-129)。2011 年我國首次報道了豬博卡樣病毒(PBo-1ikeV)的近全長基因組序列，并從系統(tǒng)進(jìn)化分析確認(rèn)了 PBo-1ikeV屬于博卡病毒屬，命名為豬博卡病毒W(wǎng)Hl株。通過流行病學(xué)檢測分析發(fā)現(xiàn)，證實豬博卡病毒在中國也存在廣泛的流行(Zeng S 等.Complete coding sequences and phylogenetic analysis ofporcine bocavirus.J Gen Virol，92:784-788)。 [0003]豬博卡病毒為無囊膜的單鏈DNA病毒，體積小，結(jié)構(gòu)簡單，直徑約為25~30mn，屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科博卡病毒屬(Moron VG等.1n vivo, dendritic cells cancross-present virus-like particles using an endosome-to-cytosol pathway.JImmunol2003, 171:2242-2250;
[0004]Cheng WX 等.1dentification and nearly full-length genomecharacterization of novel porcine bocaviruses.PLoS One, 5: el3583)。本屬其它成員包括牛細(xì)小病毒(Bovine Parvovirus)、犬微小病毒(Canine Minute virus)、人博卡病毒(Human Bocavirus)。豬博卡病毒基因組全長約為5kb,編碼三個開放閱讀框(OpenReading Frames, ORFs)，其中ORFl和0RF3負(fù)責(zé)編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(NSU NPl)，0RF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白(重疊的VP1/VP2)。0RF3為博卡病毒特征性的開放性閱讀框，其功能尚不明確。作為博卡病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，0RF2基因編碼的衣殼蛋白——VP2蛋白可以在體外自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)并可能含有特異的抗原表位(Cecchini S等.Evidence ofprior exposure to human bocavirus as determined by a retrospective serologicalstudy of404serum samples from adults in the United States.Cl in VaccineImmunol2009, 16:597-604)。滕靈方等在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)人博卡病毒VP2蛋白后用于臨床標(biāo)本的篩查，證實VP2蛋白具有一定的抗原性(滕靈方等.博卡病毒VP2基因在sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)及臨床標(biāo)本篩查.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志2009,23(6))。Martinez C等利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的豬細(xì)小病毒VP2蛋白(VLPs)免疫豬體后可以激發(fā)特異的免疫反應(yīng)(Martinez C 等.Production of porcine parvovirus empty capsids with highimmunogenic activity.VaccinelO:684-690),表明 VP2 蛋白具有較好的免疫原性。
[0005]現(xiàn)有研究表明博卡病毒與繁殖障礙、消化道和呼吸道疾病有關(guān)，尤其在幼齡群體中發(fā)病率較高。瑞典學(xué)者通過對豬博卡病毒流行病學(xué)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)生斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的豬，其豬博卡病毒的感染率是沒有患PMWS的豬的兩倍(BlomstromAL 等.Studies of porcine circovirus type2,porcine boca-like virus and torqueteno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaningmultisystemic wasting syndrome pigs.Virus Res, 152:59-64)。此外，據(jù)翟少倫等人報道，從有呼吸道癥狀的患病豬體內(nèi)所收集的樣品檢測發(fā)現(xiàn)，豬博卡病毒普遍存在，具有較高的流行率(69.7%) (Zhai S 等.High prevalence of a novel porcine bocavirusin weanling piglets with respiratory tract symptoms in China.Arch Virol,155:1313-1317)。
[0006]目前，豬群中出現(xiàn)了一系列的豬博卡病毒變異體，對其研究還剛剛起步，其單獨的致病性不得而知。在發(fā)生斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的動物中，存在多種病毒(豬圓環(huán)病毒2型，豬博卡 病毒，豬細(xì)小病毒，豬藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒等)，這表明豬博卡病毒可能作為一種輔助因子在疾病的發(fā)展過程中起作用。但多數(shù)(PBoVl、PBoV2及PBoV4)分離于患PMWS的病豬，并且在病豬的檢出率高于健康豬，這表明豬博卡病毒對斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的發(fā)生有一定相關(guān)性，其也可能與豬圓環(huán)病毒2型、豬藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒等病原混合感染發(fā)生更嚴(yán)重的疾病，導(dǎo)致呼吸道感染和腹瀉，以及引發(fā)流產(chǎn)、死胎，甚至死亡。
[0007]作為一個新發(fā)現(xiàn)的病毒，豬博卡病毒在消化道、呼吸道以及腹瀉等疾病中的病原學(xué)作用以及它的潛在致病性在很大程度上是未知的。因此，對豬博卡病毒的密切監(jiān)控及有效防控將是未來研究的發(fā)展趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供含有豬博卡病毒VP2基因的重組質(zhì)粒。
[0009]作為優(yōu)選方案，所述重組質(zhì)粒為含有豬博卡病毒VP2基因的pFastBac HTB-VP2重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
[0010]所述重組質(zhì)粒還包括與重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac HTB-VP2進(jìn)行同源重組后的桿狀病毒穿梭質(zhì)粒，該重組穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid-VP2。
[0011]本發(fā)明還提供了一種含有豬博卡病毒VP2基因的重組桿狀病毒，其表達(dá)的豬博卡病毒VP2蛋白，能夠在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)后形成病毒樣顆粒(VLPs)。
[0012]作為優(yōu)選方案，通過PCR擴增一種豬博卡病毒VP2基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。將擴增到的豬博卡病毒VP2基因插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac?HTB的BamH I和Xho I位點構(gòu)建為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac HTB-VP2，然后將該重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒骨架質(zhì)粒的DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，通過同源重組將VP2基因整合至桿狀病毒骨架質(zhì)粒Bacmid中，提取重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后獲得重組桿狀病毒rBV-VP2。該重組桿狀病毒，命名為:含有豬博卡病毒VP2基因的重組桿狀病毒E2/rBV-VP2Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus E2/rBV_VP2,其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為:2013年12月20日，保藏號為=CCTCCNO:V201401o
[0013]本發(fā)明還提供了上述重組桿狀病毒rBV_VP2在制備豬博卡病毒疫苗中的應(yīng)用。
[0014]作為優(yōu)選方案，所述豬博卡病毒疫苗為亞單位疫苗。其制備方法為:將重組桿狀病毒rBV-VP2感染sf9細(xì)胞后表達(dá)VP2蛋白(VLPs)獲得的亞單位疫苗。[0015]選用桿狀病毒的理論基礎(chǔ):
[0016]桿狀病毒(Baculovirus)是一類感染無脊椎動物的病毒，呈桿狀，具有較高的宿主特異性。苜猜銀紋夜蛾多粒包埋核型多角體病毒(Autographa califonica multiplenuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的基因組為約130kb的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA,是最廣泛使用和最有特征性的桿狀病毒，能感染許多昆蟲種類，包括A.夜蛾、草地貪夜蛾(夜蛾)、粉紋夜蛾(甘藍(lán)尺蠖)等。
[0017]Bac-to-Bac 桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionVector System, BEVS)使用一個或多個啟動子，將外源目的基因插入到啟動子下游，獲得重組病毒，這種重組病毒在昆蟲細(xì)胞或昆蟲體內(nèi)復(fù)制的同時，使外源基因得到表達(dá)?？傮w來說，Bac-to-Bac桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)點:
[0018](I)重組桿狀病毒易于構(gòu)建，容易操作，生物安全性比較高，有很單一的宿主范圍。
[0019](2)桿狀病毒是一種強大的基因表達(dá)載體，本身基因組很大，能夠容納較大的外源片段，具有很高的蛋白表達(dá)水平，現(xiàn)已被廣泛用來表達(dá)分子量較大的外源基因。因此桿狀病毒可以表達(dá)融合蛋白也可以供表達(dá)目的基因以及報告基因等多個基因(Prabakaran M 等.Protective immunity against influenza H5Nlvirus challenge inmice by intranasal co-administration of baculovirus surface-displayed HA andrecombinant CTB as an adjuvant.Virology2008, 380:412-420)?
[0020](3)重組桿狀病毒感染效率較高，高滴度病毒粒子容易獲得，能感染非分裂期細(xì)胞，并能有效介導(dǎo)體內(nèi)基因的投遞，具有很高的靶細(xì)胞和組織特異性(胡少敏等.桿狀病毒作為哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用.國外醫(yī)學(xué)寄生蟲病分冊2004，31 (5):222-226)。
[0021](4)宿主昆蟲細(xì)胞能夠適當(dāng)?shù)匦揎棗U狀病毒表達(dá)的蛋白，其方式和動物哺乳細(xì)胞相似(Altmann F 等.Insect cells as hosts for the expression of recombinantglycoproteins.Glycoconj J1999, 16:109-123)。據(jù)報道，經(jīng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的產(chǎn)物，往往會翻譯后修飾，具有與天然蛋白類似的生物活性。
[0022]如今，以桿狀病毒為載體表達(dá)重組蛋白，制備亞單位疫苗取得了較好的效果(Li Z 等.Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteinsin silkworm-baculovirus expression system and its utilization as asubunit vaccine.PLoS 0ne2008,3:e2273;Thomas C 等.Evaluation of efficacyof mammalian and baculovirus expressed E2subunit vaccine candidates tobovine viral diarrhoea virus.Vaccine2009, 27:2387-2393;ffilson S 等.Deliveryof vaccine peptides by rapid conjugation to baculovirus particles.Vaccine2008, 26:2451-2456),在基因治療領(lǐng)域研究也取得一些進(jìn)展(Roy P等.Virus-like particles as a vaccine delivery system:myths and facts.HumVaccin2008,4:5-12;Lee YJ 等.Protection of chickens from Newcastle diseasewith a recombinant baculovirus subunit vaccine expressing the fusion andhemagglutininneuraminidase proteins.J Vet Sci2008, 9:301-308)。因此，桿狀病毒成為一種優(yōu)良的表達(dá)載體，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。
[0023]更詳細(xì)的方案如下所述:[0024]一、重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTB-VP2的構(gòu)建
[0025]1、引物的設(shè)計
[0026]根據(jù)本實驗室報道的PBoV基因組序列(GenBank登錄號為HQ223038.1)設(shè)計一對擴增VP2基因的特異引物VP2-F/VP2-R，并在上游引物中引入BamH I酶切位點，下游引物中引入Xho I酶切位點。引物由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列如下:
[0027]VP2-F:5’-TTTGGATCCATGTCCGCACACAGGGGGGC-3’
[0028]VP2-R:5’-GGGCTCGAGTTACAACACTTGGTTGAT-3’
[0029]2、PCR 擴增
【權(quán)利要求】
1.一種重組質(zhì)粒載體，其特征在于:該重組質(zhì)粒載體是含有豬博卡病毒VP2基因的質(zhì)粒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒載體，其特征在于:所述質(zhì)粒載體為pFastBacTMHTB，該重組質(zhì)粒命名為PFastBac HTB-VP2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒載體，其特征在于:所述質(zhì)粒載體為桿狀病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid,該重組穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid_VP2。
4.含有權(quán)利要求3所述的豬博卡病毒VP2基因的重組桿狀病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組桿狀病毒，其特征在于:所述重組病毒為重組桿狀病毒rBV-VP2，該重組桿狀病毒保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為:2013年12 月 20 日，保藏號為=CCTCC V201401。
6.—種權(quán)利要求1~4中任意一項在制備豬博卡病毒疫苗中的應(yīng)用。
7.根據(jù)要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述豬博卡病毒疫苗為亞單位疫苗。
8.一種權(quán)利要求6所述亞單位疫苗的制備方法，其特征在于:將重組桿狀病毒rBV-VP2感染sf9細(xì)胞后表達(dá)VP2蛋白(VLPs)獲得的亞單位疫苗。
【文檔編號】C12R1/93GK103740743SQ201310750497
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】肖少波, 方六榮, 劉麗枝, 馬俊, 曾松林, 王蕩, 羅銳, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)