專(zhuān)利名稱(chēng)：胞苷二磷酸膽堿的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于作為藥品用途的胞苷二磷酸膽堿(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“CDP-膽堿”)的酶制造方法。
CDP-膽堿是合成膦脂質(zhì)的磷脂酰膽堿(卵磷脂)的中間體，可以用于治療頭部外傷、腦手術(shù)引起的意識(shí)障礙、帕金森氏病、腦中風(fēng)半邊麻痹等病。
作為CDP-膽堿的制造方法已經(jīng)知道的有2種方法，即化學(xué)合成法(特公昭39-6541號(hào)公報(bào)、特公昭42-1384號(hào)公報(bào)特公昭63-6558號(hào)公報(bào)等)以及使用酵母等微生物菌體的酶法(特公昭48-2358號(hào)公報(bào)、特公昭48-40757號(hào)公報(bào)、特公昭48-40758號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭53-109996號(hào)公報(bào)特開(kāi)昭54-14593號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭63-313594號(hào)公報(bào)等)。
這些制造方法中共同點(diǎn)是作為原料使用了胞苷-5′-單磷酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“CMP”)、胞苷-5′-二磷酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“CDP”胞苷-5′-三磷酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“CTP”)、胞嘧啶等的胞嘧啶系核苷酸及其前體。
這些原料中，作為基本原料的CMP主要是通過(guò)RNA(核糖核酸)分解的方法來(lái)制造，但是由于這種方法可以同時(shí)得到4種核苷酸而不是選擇性地得到CMP，所以不是一種效率高的方法。
本發(fā)明的目的在于提供作為用于藥品的CDP-膽堿的高效制造方法。
按照本發(fā)明，可以提供一種不使用胞嘧啶系核苷酸及其前體，而從工業(yè)上易于得到的乳清酸經(jīng)過(guò)一步酶處理，高效地制造CDP-膽堿的方法。
乳清酸是嘧啶系核苷酸的前體物質(zhì)，可用于強(qiáng)肝劑。業(yè)已知道，通過(guò)使用棒狀桿菌屬的微生物進(jìn)行發(fā)酵，能適用于工業(yè)上生產(chǎn)乳清酸的方法(特開(kāi)平1-104189號(hào)公報(bào))。本發(fā)明者著眼于此，對(duì)次乳清酸為原料的CDP-膽堿的生產(chǎn)進(jìn)行了銳意的研究。
其結(jié)果，將含有編碼磷酸膽堿轉(zhuǎn)胞苷酰酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“CCT”)膽堿激酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“CKl”)及CTP連接酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“pyrG”)的基因的DNA片段重組在載體DNA上而調(diào)制成攜帶重組體DNA的微生物和由乳清酸生成的UTP高活性微生物進(jìn)行混合，以此作為酶源，通過(guò)與以乳清酸和膽堿及/或磷酸膽堿作為基質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，可發(fā)現(xiàn)生成顯著量的CDP-膽堿，因此完成了本發(fā)明。
以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明提供了以微生物的培養(yǎng)液或其處理物為酶源，與乳清酸和膽堿及/或磷酸膽堿為基質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，使反應(yīng)液中生成和積蓄CDP-膽堿，并從該反應(yīng)液中提取CDP-膽堿為特征的CDP-膽堿的制造方法。
若以乳清酸及磷酸膽堿為基質(zhì)時(shí)，CDP-膽堿按下式，通過(guò)(11)～(6)的6個(gè)階段酶反應(yīng)而生成。另外，若以乳清酸及膽堿為基質(zhì)時(shí)，進(jìn)而還需要(7)的反應(yīng)。
此外，式中的略語(yǔ)如下。
OMP乳清酸核苷-5′-單磷酸UMP尿苷-5′-單磷酸UDP尿苷-5′-二磷酸UTP尿苷-5′-三磷酸另外，催化(1)～(7)的反應(yīng)的酶如下。
(1)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(EC2、4、2、10)(2)OMP脫酸酶(EC4、1、1、23)(3)核苷單磷酸酯激酶(EC2、7、4、4)(4)核苷二磷酸酯激酶(EC2、7、4、6)(5)CTP連接酶(EC6、3、4、2)(6)磷酸膽堿轉(zhuǎn)胞苷酰酶(EC2、7、7、15)(7)膽堿激酶(EC2、7、1、32)
這些7種反應(yīng)中，(1)是消耗磷酸核糖焦磷酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“PRPP”)生成焦磷酸的反應(yīng)，(3)、(4)、(5)、(7是消耗腺苷-5′-三磷酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“ATP”)生成腺苷-5′-二磷酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“ADP”)的反應(yīng)。
因此，本發(fā)明所使用的微生物，具有上式(1)～(7)的酶活性，進(jìn)而希望有PRPP供給能力、ATP再生能力。只要能滿(mǎn)足這些條件，使用多少數(shù)量的微生物都沒(méi)有什么關(guān)系。
例如，如以下所述，這些酶活性可由2種微生物分擔(dān)，將其混合后使用的方法也是可能的。即使用具有上式(5)和(6)及/或(7)酶活性的微生物(以下，稱(chēng)微生物A1)或者具有上式(5)和(6)酶活性的微生物(以下稱(chēng)微生物A2)以及上式(1)到(4)的活性很強(qiáng)的，可從乳清酸積蓄UTP的，最好同時(shí)PRPP供給能和ATP再生能很強(qiáng)的微生物(以下稱(chēng)微生物B)的方法。
作為微生物A1或微生物A2理想的菌株屬于通過(guò)基因重組表達(dá)強(qiáng)化這些酶活性的埃希氏桿菌屬的微生物，更具體的說(shuō)，可舉出攜帶含有來(lái)源于釀酒酵母(以下簡(jiǎn)稱(chēng)酵母”)的CCT及CKI基因、來(lái)源于大腸埃希氏桿菌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“大腸桿菌)的pyrG基因重組體DNA(pCKG55)的大腸桿菌MM294株(FERMBP-526、ATCC33625)。
CCT基因由酵母染色體，以酵母CCT基因缺損變異互補(bǔ)為指標(biāo)被克隆化，決定其全堿基順序〔Eur·J·Biochem169卷，477-486頁(yè)，1987年〕。作為CCT基因的給源可以舉出在大腸桿菌載體pUC18〔Gene，33卷，103-119頁(yè)，1985年〕的多克隆化位置的SmaI部位上插入含有來(lái)源于酵母的CCT基因1296堿基對(duì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“bp”)的DraI片段的質(zhì)粒pCC41〔生化學(xué)，60，701(1988)〕等。
CKI基因也可同樣由酵母染色體克隆化，決定全堿基順序〔JBiol.chem.，264卷，2053-2059頁(yè)，1989年〕。作為CKI基因的給源可以舉出在酵母和大腸桿菌的往復(fù)性載體YEpM4〔Mol.Cell.Biol.，7卷，3629-3636頁(yè)，1987年〕上插入含有來(lái)源于酵母的CKI基因2692bp的PstⅠ-HindⅢ片段的質(zhì)粒pCKID等。
pyrG基因由大腸桿菌染色體克隆化，決定其全堿基順序〔J.Biol.Chem.，261卷，5568-5574頁(yè)，1986年〕。作為pyrG基因的給源可以舉出pMW6等，它是在大腸桿菌載體pVC8〔Gene，19卷，259-268頁(yè)，1982年〕的多克隆化位置的SmaⅠ-PStⅠ部位上插入了含有來(lái)源于大腸桿菌的pyrG基因的2426bp的NruⅠ-PstⅠ片段的質(zhì)粒。
從帶有這些質(zhì)粒的大腸桿菌離析精制質(zhì)粒DNA可按照公知的方法〔Nuc.AcidsRes.，7卷，1513-1523頁(yè)，1979年〕進(jìn)行。此外，關(guān)于質(zhì)粒DNA用限制性酶切斷、切斷的DNA片段的離析精制、DNA片斷的酶結(jié)合、使用重組體DNA的宿主大腸桿菌的性狀轉(zhuǎn)變等、基因轉(zhuǎn)變的種種操作可按公知的方法進(jìn)行〔例如T.Maniatis等所著MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdspringHarborLaboratory，(1982)〕。
作為載體，只要在宿主微生物內(nèi)可以復(fù)制的即可，并無(wú)特殊的限制，但若以大腸桿菌作為宿主時(shí)，可以舉出pUC8、pBR322等〔Gene，2卷，95-113頁(yè)，1977年〕。
作為宿主微生物，只要能夠表達(dá)重組體DNA、能夠用于CDP-膽堿的生成反應(yīng)的任何微生物，具體的可舉出大腸桿菌MM294株(前述)。
另一方面，作為微生物B，理想的菌株是屬于棒狀桿菌屬的微生物，再具體地可舉出產(chǎn)氨棒狀桿菌(舊名，產(chǎn)氨短桿菌ATCC21170。
用于微生物A1、微生物A2及微生物B培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要恰當(dāng)?shù)睾刑荚?、氮源、無(wú)機(jī)物、氨基酸、維生素等的培養(yǎng)基，無(wú)論是天然培養(yǎng)基，還是人工培養(yǎng)基均可，在好的氣氛條件下，邊調(diào)節(jié)溫度、PH值等，邊用通常的方法培養(yǎng)即可。
作為碳源可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、山梨糖等的碳水化合物、糖醇、甘油、淀粉水解物、糖蜜等，進(jìn)而還可使用丙酮酸、乳酸、檸檬酸等各種有機(jī)酸，谷氨酸、蛋氨酸、賴(lài)氨酸等各種氨基酸。另外也可以使用白糠、木薯、甘蔗渣、玉米纖維液等天然有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源。
作為氮源可以使用氨或氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、醋酸銨等各種無(wú)機(jī)及有機(jī)銨鹽等，谷氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸等氨基酸、或胨、NE氨、玉米纖維液、肉汁、酵母汁、酪蛋白水解物、魚(yú)粉或其消化物、蛹的水解物等的含氮有機(jī)物等種種物質(zhì)。
進(jìn)而，根據(jù)需要可添加磷酸鉀、磷酸二鈉、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸銅、氯化錳、鉬酸銨、硫酸鋅等無(wú)機(jī)物。根據(jù)需要還可以添加維生素、氨基酸、核酸等其他物質(zhì)，但是，如上述如果隨著其他培養(yǎng)基的成分可供給培養(yǎng)基時(shí)，就沒(méi)有必要特別加入。
培養(yǎng)是在振蕩培養(yǎng)或者通氣攪拌培養(yǎng)等的好的氣氛條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度較好是15～40℃，更好是20～35℃。培養(yǎng)中培養(yǎng)基的PH值最好維持在中性附近。培養(yǎng)的時(shí)間通常是5～72小時(shí)。
將具有從UTP和膽堿及/或磷酸膽堿生成CDP-膽堿能力的微生物A與具有從乳清酸生成UTP能力的微生物B混合時(shí)，可以分別單個(gè)培養(yǎng)，培養(yǎng)終了后混合。也可以在一個(gè)培養(yǎng)器中同時(shí)接種，混合培養(yǎng)。進(jìn)而也可以在任何一個(gè)微生物的培養(yǎng)中或培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，接種另一個(gè)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。
這樣得到的微生物A及微生物B的培養(yǎng)液可以原封不動(dòng)地，或經(jīng)過(guò)各種處理后。進(jìn)行CDP-膽堿的生成反應(yīng)。CDP-膽堿的生成反應(yīng)可以使微生物A及微生物B的培養(yǎng)液或其處理物的混合物與乳清酸和膽堿接觸來(lái)進(jìn)行，也可以使微生物B的培養(yǎng)液或其處理物與乳清酸接觸，使之生成UTP后，再添加微生物A的培養(yǎng)液或其處理物和膽堿及/或磷酸膽堿來(lái)進(jìn)行。
作為培養(yǎng)液的處理物可以舉出培養(yǎng)液的濃縮物、或其干燥物、培養(yǎng)液離心分離后得到的菌體、菌體干燥物、表面活性劑及/或有機(jī)溶劑處理物、溶菌酶處理物、由固定化菌體或菌體萃取的酶樣品等。
CDP-膽堿的生成反應(yīng)，是在上述微生物和反應(yīng)基質(zhì)的混合物中，進(jìn)而添加反應(yīng)必要的成分，一邊將PH調(diào)節(jié)為6～10、最好為7～8，一邊在20～50℃，下保持2～48小時(shí)。作為反應(yīng)必須的成分可舉出ATP再生時(shí)必要的能量供給體、磷酸離子、鎂離子、銨離子進(jìn)而是表面活性劑及/或有機(jī)溶劑等。這些成分如果從上述微生物培養(yǎng)液帶入所需的必要量時(shí)，就沒(méi)有必要再添加。
作為反應(yīng)基質(zhì)的乳清酸可以使用純品，含有微生物的乳清酸發(fā)酵液、或其粗精制物等的乳清酸的物質(zhì)，如果是對(duì)反應(yīng)沒(méi)有妨礙哪種都可以使用。乳清酸的使用濃度為0.01～1.0mol/l，更好是0.01～0.3mol/l。此外，膽堿及/或磷酸膽堿可使用純品，含有膽堿及/或磷酸膽堿的物質(zhì)，如果其中的不純物不妨礙反應(yīng)也可以使用。膽堿及/或磷酸膽堿的使用濃度為0.01～3.0mol/l、更好是0.02～1.0mol/l。
作為能量供給體可使用葡萄糖、果糖、蔗糖等碳水化合物，糖蜜、淀粉水解物等;丙酮酸、乳酸、醋酸、α-氧代戊二酸等有機(jī)酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。其使用濃度為0.02～2.0mol/l。
作為磷酸離子，正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸、四聚偏磷酸等聚磷酸;聚偏磷酸、磷酸鉀、磷酸二鉀、磷酸-鈉、磷酸二鈉等無(wú)機(jī)磷酸鹽等等都可以使用。其使用的濃度大約為0.01～0.5mol/l。
作為鎂離子可以使用硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無(wú)機(jī)鎂鹽，檸檬酸鎂等有機(jī)鎂鹽等等。添加量通常為0.005～0.2mol/l作為銨離子可以使用氨水，氨氣，各種無(wú)機(jī)、有機(jī)銨鹽，谷氨酰胺或含有酵母汁、酪蛋白氨基酸、玉米纖維液等的谷氨酰胺的天然物等等。添加量約為0.01～2.0mol/l。
作為表面活性劑，二辛基磺基琥珀酸鈉(例如臘披索爾B-80日本油脂社制)、月桂酰。肌氨酸鹽等陰離子表面活性劑，聚氧乙烯十六烷基醚(例如，非離子P-208，日本油脂社制)等非離子性表面活性劑，烷基二甲胺(例如，叔胺FB，日本油脂社制)等叔胺類(lèi)等等，如果促進(jìn)CDP-膽堿生成都可以使用的物質(zhì)。其使用濃度通常為0.1～50g/l優(yōu)選的是1～20g/l。
作為有機(jī)溶劑可舉出二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、醋酸乙酯等其使用濃度通常為0.1～50ml/l、優(yōu)選的是1～20ml/l。
反應(yīng)液中生成的CDP-膽堿的提取，可使用活性碳和離子交換樹(shù)脂等的常規(guī)方法進(jìn)行。
下面給出本發(fā)明的實(shí)施例實(shí)施例1同時(shí)表達(dá)CCT、CKI、pyrG的重組質(zhì)粒的形成關(guān)于同時(shí)表達(dá)CCT、CKI、pyrG重組質(zhì)粒pCKG55的形成方法如以下所述。此外，形成工程歸納表示在

圖1中。
1)CCT/CKI融合蛋白的表達(dá)將攜帶有來(lái)源酵母染色體的CCT基因質(zhì)粒pCC41的大腸桿菌MM294/pCC41株(以下質(zhì)粒攜帶株以“宿主株名/質(zhì)粒名?！钡男问奖硎?接種在含有細(xì)菌胰化胨(ディフコ社制)(10g/l)、酵母汁(ディフコ社制)(5g/l)，NaCl(5g/l)、NaCl(5g/l)的、PH值調(diào)節(jié)在7.2的400ml培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)18小時(shí)。從得到的培養(yǎng)菌體，用公知的方法(前述)離析精制出質(zhì)粒pCC41。具有來(lái)源于酵母染色體的CKI基因的質(zhì)粒pCKID也可用同樣的方法從其攜帶株的大腸桿菌MM294/pCKID株離析精制出來(lái)。
將調(diào)制的pCC41質(zhì)粒DNA5μg溶解在50μl含有10mmoltris-鹽酸(pH7.5)、50mmolNaCl、7mmol MgCl2及6mmol 2-巰基乙醇的緩沖液中(以下，用限制性酶進(jìn)行消化反應(yīng)的緩沖液，根據(jù)NaCl的濃度值以“Y-50緩沖液”形式命名)，加入20單位的HindⅢ(寶酒造社制，以下限制性酶類(lèi)均使用寶酒造社制品)和20單位的HpaⅠ，在37℃進(jìn)行2小時(shí)消化反應(yīng)。將此消化物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，對(duì)凝膠萃取可離析出很大的DNA片斷(3808bp)。另一方面，pCKID質(zhì)粒DNA5μg也可用同樣的方法，用HindⅢ和Hpal消化后，精制離析出2297bp的DNA片斷。
將這樣得到的約0.2μg的來(lái)源于pCC41的DNA片斷和約0.05μg的來(lái)源于pCKID的DNA片斷在40μl含有20mmol tris-鹽酸(pH7.6)、10mmolMgCl2、10mmol二硫代蘇糖醇及0.5mmolATP的緩沖液(以下稱(chēng)“T4連接酶緩沖液”)中，加入2個(gè)單位的T4連接酶(寶酒造社)，在4℃進(jìn)行18小時(shí)的結(jié)合反應(yīng)。用這樣得到的重組體DNA使大腸桿菌MM294株進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)變，得到抗氨必西林性的性狀轉(zhuǎn)變株。
從此性狀轉(zhuǎn)換株離析精制出質(zhì)粒DNA，該DNA通過(guò)用HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ等限制性酶消化，進(jìn)行質(zhì)粒結(jié)構(gòu)解析，其結(jié)果，已確認(rèn)排列著具有目的結(jié)構(gòu)6.1千堿基(以下略稱(chēng)“kb”)的質(zhì)粒。該質(zhì)粒命名為pCKI(參照?qǐng)D1)。
由pCKI編碼的CCT/CKⅠ融合蛋白的結(jié)構(gòu)表示在圖2中pCC41具有在大腸菌載體pUCⅠ的多克隆化位置的SmaⅠ部位上，插入了來(lái)源于酵母染色體的1296bpDraⅠ片斷的結(jié)構(gòu)。DraⅠ消化時(shí)，除去了原來(lái)CCT基因的N來(lái)端24個(gè)氨基酸，而取代的是形成連接來(lái)源于載體JacZ基因的11個(gè)氨基酸形成(參照?qǐng)D3)。另外，由于HpaⅠ切斷和結(jié)合的結(jié)果，成為除去了CCT基因的C末端14氨基酸及CKl基因的N末端31氨基酸而結(jié)合的形式，成為總計(jì)由948個(gè)氨基酸組成的融合蛋白。
對(duì)于MM294/pCKI株，在后述的CCT活性測(cè)定系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，生成了以CTP和磷酸膽堿為基質(zhì)的CDP-膽堿，進(jìn)而，在該系統(tǒng)中，將5mmol磷酸膽堿置換成5mmol氯化膽堿即使添加5mmolATP同樣也可生成CDP-膽堿。于是，已確認(rèn)pCKI攜帶株同時(shí)具有CCT、CKI兩種活性。
2)CCT/CKI融合蛋白的N末端部分缺失體的制取為了達(dá)到增大CCT/CKI融合蛋白表達(dá)量的目的，按以所述的方法，進(jìn)行CCT/CKI融合蛋白的N末端部分缺失體的制取取。
將2μg pCKI質(zhì)粒DNA溶解在30μl Y-50緩沖液中，加入15單位的KpnⅠ，在37℃進(jìn)行2小時(shí)消化反應(yīng)。向此消化物中加入20μl 5倍濃度的Ba131緩沖液〔100mmoltris-鹽酸(pH8.0)、60mmol、MgCl2、60mmol CaCl3，3Mol NaCl〕、46μl蒸餾水和0.1單位的Ba131核酸酶(寶酒造社)，在30℃進(jìn)行3分鐘消化反應(yīng)。
向反應(yīng)液中加入100μl的苯酚氯仿(容量比1∶1)混合液充分?jǐn)嚢瑁狗磻?yīng)停止后，離心分離，提取上層液(以上把此操作稱(chēng)為“苯酚∶氯仿萃取”)。向提取的水層中加入2倍容量的冰冷乙醇在-80℃下靜置30分鐘。離心分離乙醇混合物后，棄去上清液，在減壓下干燥沉淀(以下將此操作稱(chēng)為“乙醇沉淀)。向得到的沉淀物中加入50μlT4連接酶緩沖液，溶解后，加入1個(gè)單位的T4連接酶，在4℃進(jìn)行18小時(shí)的結(jié)合反應(yīng)。
用得到的重組體DNA使大腸桿菌MM294株性狀轉(zhuǎn)變，選擇抗氨比西林性的性狀轉(zhuǎn)變株。培養(yǎng)得到的抗氨比西林性株，在后述的CCT活性測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)定CCT活性，選擇活性最高的株離，離析精制質(zhì)粒DNA，通過(guò)用HindⅢ、HpaⅠ、PvuⅡ等限制性酶切斷該DNA，已確認(rèn)具有目的要求的結(jié)構(gòu)。將該質(zhì)粒命名為pCK55。(參照?qǐng)D1)。
pCK55上的CCT/CKI融合基因的N末端部分的堿基順序，可按照F·Sanger等的雙脫氧法〔J.Mol.Biol.，143卷，161-178頁(yè)，1980年〕決定，具有如圖3表示的堿基順序。即通過(guò)Ba131核酸酶消化，從KpnⅠ部位在上流及下流方向合計(jì)失去36bp，可以看出，因此，缺失了來(lái)源于大腸桿菌載體pUCI8的9個(gè)氨基酸和來(lái)源于CCT基因的3個(gè)氨基酸的合計(jì)12個(gè)氨基酸，作為由結(jié)合的936個(gè)氨基酸組成的融合蛋白表達(dá)。
3)CCT、CKI、pyrG同時(shí)表達(dá)質(zhì)粒的形成從攜帶具有來(lái)源于大腸桿菌染色體的pyrG基因質(zhì)粒pMW6的大腸桿菌MM294/pMW6株離析精制出質(zhì)粒DNA。將5μg調(diào)制的pMW6質(zhì)粒DNA溶在50μlY-150緩沖液中加入20單位的MluI，在37℃進(jìn)行2小時(shí)消化反應(yīng)。接著用苯酚氯仿萃取和乙醇沉淀后，將DNA片段溶解在總量為50μl的DNA多聚酶緩沖液〔50mmol tris-鹽酸(pH8.8)、7mmol MgCl2、6mmol2-巰基乙醇、7μmol EDTA、0.25mmol dATP、0.25mmol dCTP、0.25mmol dGTP、0.25mmol dTTP〕中、加入5單位的T4DNA多聚酶(寶酒造社)，在37℃進(jìn)行2小時(shí)反應(yīng)，通過(guò)MluⅠ消化，使生成的5′-突出末端成為平滑末端。反應(yīng)液用苯酚∶氯仿萃取、乙醇沉淀后，將得到的DNA片斷溶解在50μl Y-50緩沖液、加入15單位的HindⅢ，在37℃進(jìn)行2小時(shí)消化反應(yīng)。將此消化物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，從凝膠中萃取、離析出大的DNA片段。
另一方面，質(zhì)粒pCK55也從那個(gè)攜帶株(MM294/pCK55)離析精制出。將5μg調(diào)制的pCK55質(zhì)粒DNA溶解在50μlY-50緩沖液中，加入20單位的HindⅢ和20單位的PvuⅡ，在37℃進(jìn)行2小時(shí)消化反應(yīng)。將此消化物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，離析精制出含有CCT/CKI基因的大的DNA片段(3610bp)。
將這樣得到的約0.05μg的來(lái)源于pMW6的DNA片段和約0.2μg的來(lái)源于pCK55的DNA片段在50μl的T4連接酶緩沖液中，用2單位的T4連接酶，在4℃進(jìn)行18小時(shí)結(jié)合反應(yīng)。用得到的重組體DNA使大腸桿菌MM294株進(jìn)行性狀轉(zhuǎn)變，得到抗氨比西林性的性狀轉(zhuǎn)變株。
從這個(gè)性狀轉(zhuǎn)變株離析精制質(zhì)粒DNA，通過(guò)用HindⅢ，HpaⅠ、KpnⅠ等限制性酶消化該DNA，進(jìn)行質(zhì)粒結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果已確認(rèn)構(gòu)筑成要求的8、3Kb的質(zhì)粒(參照?qǐng)D1)。
4)攜帶重組體DNA株的CCT、pyrG活性攜帶重組體DNA株的CCT、pyrG活性的測(cè)定可按以下的方法進(jìn)行。
將供給活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌接種到裝有10ml含有氨西比林(50μg/ml)的L培養(yǎng)基的大型試管中，在25℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。將100μl這種培養(yǎng)液接種在裝有10μl含有氨西比林(50μl/ml)的L培養(yǎng)基的大型試管中，在33℃振蕩培養(yǎng)10小時(shí)。將得到的500μl培養(yǎng)液離心分離后，棄去上清液將菌體懸浮在500μl20mmol磷酸鉀緩沖液(pH7.0中、向其中加入5μl二甲苯后攪拌，在30℃處理10分鐘。這樣得到的二甲苯處理物作為粗酶液使用，按照下述方法測(cè)定酶活性。
“CCT活性測(cè)定法”將由150mmol磷酸鉀緩沖液(pH7.5)、25mmol氯化鎂、5mmolCTP、5mmol磷酸膽堿及粗酶液組成的500μl反應(yīng)液在30℃進(jìn)行2小時(shí)反應(yīng)。定時(shí)地每次提取50μl反應(yīng)液，添加50μl0.2mmol醋酸后，通過(guò)在100℃加熱處理2分鐘中止反應(yīng)。該處理物經(jīng)離心分離后，用適宜的蒸餾水稀釋上清液，用高速液體色譜法定量生成的CDP-膽堿。將每分鐘生成1μmol的CDP-膽堿的酶量作為1單位(U)計(jì)算出酶活性。
“pyrG活性測(cè)定法”將由40mmoltris-鹽酸(pH7.1)、10mmol氯化鎂、1mmolATP、1mmolUTP、0.2mmolGTP、2mmol谷氨酰胺、8mmol磷酸環(huán)己醇丙酮酸及粗酶液組成的2ml反應(yīng)液在38℃進(jìn)行60分鐘反應(yīng)。定時(shí)地每次提取200μl反應(yīng)液，通過(guò)與1.8ml3.5%高氯酸混合而中止反應(yīng)。
這種酸處理液離心分離后，用比色計(jì)測(cè)定上清液的291nm的吸光度。在3.5%高氯酸中，在291nm處對(duì)作為基質(zhì)的UTP幾乎沒(méi)有吸收，而對(duì)是生成物的CTP有吸收。因此，通過(guò)測(cè)定291nm的吸收可以知道CTP的生成量。以每分鐘生成1μmolCTP的酶量作為1單位(U)計(jì)算出酶活性。
按本發(fā)明制成的質(zhì)粒攜帶株CCT及pyrG活性的測(cè)定結(jié)果如表1所示?；钚缘闹狄悦?ml培養(yǎng)液的酶活性(U)表示。
此外，攜帶pCKG55大腸桿菌菌株(EscherichiacoliMM294/pCKG55)在平成4年(1992)1月27日，按照布達(dá)佩斯的條約的條件，以寄存號(hào)為FERMBp-3137寄存在工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所。
實(shí)施例2將實(shí)施例1得到的大腸桿菌MM294/pCKG55株在裝有10ml含氨比匹林(50μg/ml)的培養(yǎng)基的大型試管中接種、在25℃以300rpm進(jìn)行24小時(shí)振蕩培養(yǎng)。將20ml該培養(yǎng)液在裝有400ml氨比西林(50μg/ml)的培養(yǎng)基的帶有隔板的2l三角燒瓶中接種，在25℃以190rpm進(jìn)行16小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。
將125ml此培養(yǎng)液在裝有2.5l由葡萄糖(5g/l(另外滅菌)、胨(極東制藥工業(yè)社制)(5g/l)、Na2HPO4(6g/l)、KH2PO4(3g/l)、NaCl(5g/l)、NH4Cl(1g/l)、MgSO4·7H2O(250mg/l)(另外滅菌)及維生素B1(4mg/l(另外滅菌)組成的液體培養(yǎng)基(pH不調(diào)整)的5l容積的培養(yǎng)槽中接種，在25℃下、11小時(shí)，而后32℃下、13小時(shí)以600rpm攪拌，通氣量為2.5l/分的培養(yǎng)條件下，用14%氨水一邊調(diào)節(jié)pH為7.0一邊進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)中，從開(kāi)始培養(yǎng)后第11小時(shí)到第24小時(shí)之間，將由葡萄糖(167g/l)、胨(167g/l)組成的進(jìn)料液通過(guò)蠕動(dòng)移液泵，以30ml/小時(shí)的速度流動(dòng)添加。
另一方面，將產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC21170株在裝有10ml由葡萄糖(50g/l)、多胨(大五榮食化學(xué)社)(10g/l)、酵母汁(大五榮食化學(xué)社制)(10g/l)、尿素(5g/l)、(NH4)2SO4(5g/l)、KH2PO4(1g/l)K2HPO4(3g/l)、MgSO4·7H2O(1g/l)、CaCl2·2H2O(0.1g/l)、FeSO4·7H2O(10mg/l)、ZnSO4·7H2O(10mg/l)、MnSO4·4～6H2O(20mg/l)、L-磺基丙氨酸(20mg/l)、D-泛酸鈣(10mg/l)、維生素B1(5mg/l)、尼古丁酸(5mg/l)及生物素(30μg/l)(用苛性鈉調(diào)節(jié)pH值為7.2)組成的液體培養(yǎng)基的大型試管中進(jìn)行接種，在28℃以300rpm進(jìn)行24小時(shí)的往復(fù)振蕩培養(yǎng)。
將20ml此培養(yǎng)液在裝有與上述同一組成的230ml液體培養(yǎng)基的21帶有隔板三角燒瓶中進(jìn)行接種，在28℃以190rpm進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。
將250ml此培養(yǎng)液在裝有2.5l由葡萄糖(100g/l)、肉汁(10g/l)、多胨(10g/l)、KH2PO4(1g/l)、K2HPO4(1g/l)、MgSO4·7H2O(1g/l)、CaCl2·2H2O(0.1g/l)、FeSO4·7H2O(20mg/l)、ZnSO4·7H2O(10mg/l)、MnSO4、4～6H2O(20mg/l)、β-丙氨酸(15mg/l)、L-磺基丙氨酸(20mg/l)、生物素(100μg/l)、尿素(2g/l)(另滅菌)及維生素B1(5mg/l)(另滅菌)(用苛性鈉調(diào)節(jié)pH為7.2)組成的液體培養(yǎng)基的5l容積培養(yǎng)槽中進(jìn)行接種，在32℃攪拌速度為600rpm通氣量為2.5l/分的培養(yǎng)條件下、邊用濃氨水調(diào)節(jié)pH值在6.8邊進(jìn)行物種培養(yǎng)。
當(dāng)上述物種培養(yǎng)液的上清液中的葡萄糖消耗掉時(shí)，無(wú)菌地提取350ml培養(yǎng)液，并在裝有2.5l由葡萄糖(180g/l)、KH2PO4(10g/l)、K2HPO4(10g/l)、MgSO4·7H2O(10g/l)、CaCl2、2H2O(0.1g/l)FeSO4、7H2O(20mg/l)、ZnSO4、7H2O(10mg/l)、MnSO4·4～6H2O(20mg/l)(另外滅菌)、β-丙氨酸(15mg/lL-磺基丙氨酸(20mg/l)、谷氨酸鈉(1g/l)、生物素(100μg/l)、尿素(2g/l)(另外滅菌)及維生素B1(5mg/l)(另外滅菌)(用苛性鈉調(diào)節(jié)pH值為7.2)組成的液體培養(yǎng)基的5l容積的培養(yǎng)槽中接種，在32℃、攪拌速度為600rpm、通氣量為2.5l/分的培養(yǎng)條件下，邊用濃氨水調(diào)節(jié)pH值為6.8邊進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)液的上清液中的葡萄糖消耗時(shí)，終止培養(yǎng)。
將這樣得到的360ml大腸桿菌MM294/pCKG55株培養(yǎng)液和360ml產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC21170株培養(yǎng)液加入2l容積的培養(yǎng)槽中，并向其中添加葡萄糖(100g/l)、乳清酸(10g/l，47mmol、氯化膽堿(8.4g/l，60mmol)、MgSO4·7H2O(5g/l)、二甲苯(20ml/l)，再加入蒸餾水或全量為800ml。將此混合液，在32℃、800rpm攪拌速度、通氣量0.81/分的條件下，邊用10N的NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.2邊進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)中，在適宜的進(jìn)程中添加KH2PO4，以便保持反應(yīng)上清液中磷酸濃度為1～5g/l。進(jìn)行23小時(shí)反應(yīng)后，生成CDP-膽堿(11.0g/l，21.5mmol)。此外，不添加大腸桿菌MM294/pCKG55株培養(yǎng)液，而取代之加入360ml蒸餾水進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，完全不能生成CDP-膽堿。另外，加入360ml蒸餾水代替產(chǎn)氨棒狀桿菌ATCC21170株培養(yǎng)液進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，CDP-膽堿的生成量為0.7g/l(1.4mmol)。
實(shí)施例3作為反應(yīng)基質(zhì)，除了使用磷酸膽堿(16.5g/l，50mmol)代替氯化膽堿之外，進(jìn)行與實(shí)施例2相同的反應(yīng)，反應(yīng)23小時(shí)，生成CDP-膽堿(9.5g/l，18.6mmol)本發(fā)明提供了從乳清酸和膽堿及/或磷酸膽堿在工業(yè)上制造CDP-膽堿的方法。
順序表順序:1順序長(zhǎng)度:54堿基對(duì)順序類(lèi)型:核酸拓?fù)?線性順序種類(lèi):其他核酸片段型:中間型片段起源生物名:釀酒酵母(Saccha-romyces Cerevisiae)株名:×2180-1順序A T G A C C A T G A T T A C G A A T T C G A G C T C G G TA C C C A A A A A A A A T A A A A A T A A A A G A54順序:2順序長(zhǎng)度:18堿基對(duì)順序類(lèi)型:核酸拓樸:線性順序種類(lèi):其他核酸片段型:中間型片段起源生物名:釀酒酵母(Saccha-romyces cerevisiae)株名:×2180-1順序A T G A C C A A A A A T A A A A G A18圖1表示質(zhì)粒pCKIG55的形成工程圖2表示由質(zhì)粒pCKI編碼的CCT/CKI融合蛋白的結(jié)構(gòu)。
圖3表示由質(zhì)粒pCKI及pCK55編碼的CCT/CKI融合蛋白基因的N末端部分的堿基順序。
權(quán)利要求
1.胞苷二磷酸膽堿的制造方法，其特征是，使用以微生物培養(yǎng)液或其處理物為酶源，與以乳清酸及膽堿和/或磷酸膽堿為基質(zhì)的進(jìn)行反應(yīng)，使反應(yīng)液中生成和積蓄胞苷二磷酸膽堿，并從該反應(yīng)液中提取胞苷二磷酸膽堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，作為該微生物使用具有胞苷-5′-三磷酸連接酶(以下稱(chēng)pyrG)和磷酸膽堿轉(zhuǎn)胞苷酰酶(以下稱(chēng)CCT)及膽堿激酶(以下稱(chēng)CKI)的酶活性的微生物(以下稱(chēng)微生物A1)和具有從乳清酸生成尿苷-5′-三磷酸活性的微生物(以下稱(chēng)微生物B)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，作為該微生物使用的是具有作為pyrG和CCT的酶活性的微生物(以下稱(chēng)微生物A2)和微生物B。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，微生物A1是攜帶含有編碼pyrG、CCT及CKI的基因DNA片段和載體重組體DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，微生物A2是攜帶含有編碼pyrG及CCT的基因DNA片段和載體重組體DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征是，該DNA片段中編碼CCT及CKI的基因來(lái)源于釀酒酵母(Saccharomycescere ViSiae)、編碼pyrG的基因來(lái)源于大腸埃希氏桿菌(Escherichia Ooli)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征是，微生物A1或微生物A2是屬于大腸埃希氏桿菌屬的微生物、微生物B是屬于棒狀桿菌屬的微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，微生物A1是大腸埃希氏桿菌MM294/pCKG55(FERM BP-3717)
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，微生物B是產(chǎn)氨棒狀菌ATCC21170。
全文摘要
本發(fā)明提供了從乳清酸和膽堿及/或磷酸膽堿制造CDP-膽堿的方法。使用具有磷酸膽堿轉(zhuǎn)胞苷酰酶(CCT)和膽堿激酶(CKI)及胞苷-5′-三磷酸連接酶(pyrG)的酶活性的微生物和具有從乳清酸生成尿苷-5′-三磷酸活性的微生物，以乳清酸和膽堿及/或磷酸膽堿為基質(zhì)制造胞苷二磷酸膽堿。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1074938SQ9310091
公開(kāi)日1993年8月4日 申請(qǐng)日期1993年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1992年1月30日
發(fā)明者丸山明彥, 藤尾達(dá)郎, 手柴貞夫 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社