專利名稱：蛋白a的親和分離材料及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的純化方法。特別是一種純化蛋白A的親和分離材料和蛋白A的親和純化方法。
背景技術(shù)：
蛋白A是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白質(zhì)，具有與人和多種動(dòng)物抗體Fe段結(jié)合的能力，結(jié)合的抗體在高鹽或低PH等條件下可以解離，因此，蛋白A被廣泛用于抗體分離純化。在抗體藥物的規(guī)?；圃熘泄潭ɑ鞍譇是純化工藝的核心分離材料，每年存在巨大的需求?？捎脽晒馑?、酶、生物素、膠體金、放射性核素、鐵蛋白等進(jìn)行標(biāo)記，代替抗體IgG作為廣譜第二抗，作為多種檢測(cè)技術(shù)的指示系統(tǒng)。目前蛋白A在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)及生物學(xué)等領(lǐng)域中已得到了廣泛應(yīng)用。由于金黃色葡萄球菌中天然蛋白A表達(dá)量低，且不易大規(guī)模培養(yǎng)。目前蛋白A主要通過轉(zhuǎn)基因大腸桿菌來大量表達(dá)。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，美國(guó)專利US5075423報(bào)道了一種利固定化IgG親和層析純化蛋白A，但該方法一步純化得到的蛋白A純度并不高，且純化的蛋白A產(chǎn)品中存在微量IgG污染，需結(jié)合其它方法如離子交換層析精制；此外，固定化IgG本身需要高度純化，成本昂貴，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。歐洲專利EP0289129A2依次采用陽離子交換層析，陰離子交換層析純化蛋白A和乙醇沉淀；美國(guó)專利US6555661依次采用疏水作用層析和離子交換層析來純化蛋白A。這些方法操作步驟復(fù)雜，產(chǎn)品回收率低，難于降低生產(chǎn)成本。因此，有必要開發(fā)效率高、成本低、生產(chǎn)步驟更簡(jiǎn)便的蛋白A分離材料和和生產(chǎn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有蛋白A生產(chǎn)技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種蛋白A的親和分離材料和純化蛋白A的親和方法，使其能夠快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量生產(chǎn)制造蛋白A。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的純化方法，即仿生親和純化技術(shù)，以專一性地識(shí)別蛋白A作為基礎(chǔ)，其步驟如下(I)合成制備仿生親和分離材料；用活化基礎(chǔ)分離材料固定能夠結(jié)合蛋白A的配體分子，合成仿生親和分離材料。(2)用制備的仿生親和分離材料純化蛋白A。用上述合成的親和層析介質(zhì)制備成親和層析柱，將含蛋白A的樣品流經(jīng)該親和層析柱，蛋白A吸附在親和層析柱上，未結(jié)合的其它蛋白被洗去，改變緩沖液條件將結(jié)合的蛋白A洗脫下來，得到蛋白A粗品。在步驟(I)中，基礎(chǔ)分離材料是一種顆粒狀或非微顆粒狀，可溶性的或不溶性的，多孔狀或無孔的化合物或材料。在一些實(shí)施例中，支持介質(zhì)包括基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠珠、交聯(lián)的葡聚糖珠、、烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠、羥乙基甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰胺，二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯、hyper D,toyopearl填料，以及玻璃、娃、金屬氧化物、全氟化碳、膨脹床介質(zhì)、磁化介質(zhì)珠、磁性膠體、濾器、濾紙、濾布，或者是毛細(xì)管管壁，及其數(shù)種的組合，并可有機(jī)聚合物涂層。在一些實(shí)施例中，活化基礎(chǔ)分離材料是用包括溴化氰、羰基二咪唑、二乙烯基砜、吖內(nèi)酯、三氯三氮嗪、2-氟-I-甲基吡啶(鹽)對(duì)甲苯磺酸酯、對(duì)甲苯磺酰氯、三氟乙基磺酰氯、碘乙酸、溴乙酸、馬來酰亞胺、吡啶基二硫化物、環(huán)氧基、雙環(huán)氧烷或者5-硫代-2-硝基苯甲酸作為活化試劑活化的基礎(chǔ)分離材料。在步驟(I)中，在另一個(gè)實(shí)施例中，活化基礎(chǔ)分離材料是用包括光活性反應(yīng)化學(xué)利用對(duì)重氮苯基乙二醛、重氮苯甲酰肼、磺基琥珀酰-6-(4'-重氮-2'-硝基苯胺)己酸、 或N- [4-(對(duì)疊氮水楊酰胺基)丁基]-3' - (2' - 二硫代吡啶)丙酰胺進(jìn)行基礎(chǔ)分離材料活化。在步驟(I)中，能夠結(jié)合蛋白A的配體分子包括正丁胺、正戊胺、環(huán)戊胺，正己胺、環(huán)己胺，二正己胺、正辛胺、正十一胺，十二胺，金鋼胺，2，4_ 二氨基-6-羥基吡唆，2-氨基-2-噻唑啉，2，5-二甲基苯胺；在步驟⑵中，親和介質(zhì)吸附蛋白A的條件為pH 6. 5-7. 5，離子強(qiáng)度為0. 0-0. 15MNaCl的緩沖液；洗脫條件為pH3. 0-4. 0，離子強(qiáng)度為0. 0-0. 15MNaCl的緩沖液。所述的蛋白A為天然蛋白A、重組蛋白A和蛋白A突變體。本發(fā)明克服了蛋白A生產(chǎn)技術(shù)中的缺點(diǎn)，使蛋白A生產(chǎn)時(shí)分離純化步驟少，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高，利用蛋白A專一的親和分離材料，可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化蛋白A。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例做進(jìn)一步的闡述實(shí)施例I :(I)分離材料制備量取正己胺(IOOml)用去離子水(300ml)溶解，與三氯三氮嗪活化的Sepharose瓊脂糖珠(300ml)混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6. 5 8. 0之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到正己胺-5-氯_2，4，6-三氮嗪-S^harose (260ml)，用30 %乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化含蛋白A基因的大腸桿菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)，表達(dá)后，收集菌體，以Ig菌體/IOml的比例加入磷酸鹽緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH 6. 5,電導(dǎo)率4. 85ms/cm),破碎細(xì)胞后，12000rpm離心lOmin，得含蛋白A上清樣品。以IN HCl調(diào)節(jié)pH至6. 5，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至4. 85ms/cm,上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH 6. 0,電導(dǎo)率4. 85ms/cm)平衡好的裝有按實(shí)例I步驟(I)制備的正己胺-5-氯-2,4,6-三氮嗪-Sepharose親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH 6.5，電導(dǎo)率4. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly, pH 3. 0)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為85. I %。實(shí)施例2 (I)分離材料制備量取二正己胺(50ml)用去離子水_ (300ml)溶解,與環(huán)氧基-Sepharose瓊脂糖珠(250ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到二正己胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-S印harose (200ml)，用30 %乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl 溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至4. 85mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH
7.0,電導(dǎo)率4. 85ms/cm)平衡好的裝有制備的二正己胺_5_氯-2,4,6-三氮嗪-Sepharose親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率4. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly, pH 3. 0)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為90. 2 %。實(shí)施例3 (I)分離材料制備量取環(huán)戊胺(20ml)用去離子水_(300ml)溶解，與環(huán)氧基-Sepharose瓊脂糖珠(250ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到環(huán)戊胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-S^harose (18ml)，用30 %乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟(2)制備的含蛋白A上清樣品，含蛋白A基因的大腸桿菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)，表達(dá)后，收集菌體，以Ig菌體/IOml的比例加入磷酸鹽緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH 7. 5，電導(dǎo)率4. 85ms/cm)，混勻后在90°C熱處理30分鐘，12000rpm離心lOmin，取上清。以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 5，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至4. 85ms/cm,上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH 7. 5，電導(dǎo)率4. 85ms/cm)平衡好的裝有制備的環(huán)戊胺_5_氯-2，4,6-三氮嗪-Sepharose親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOmM磷酸鈉，pH 7. 5，電導(dǎo)率4. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IMGly，pH 3.0)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為86. 5%。實(shí)施例4 (I)分離材料制備量取環(huán)己胺(55ml)用去離子水_(300ml)溶解，與環(huán)氧基-S^harose瓊脂糖珠(250ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到環(huán)己胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-S印harose (230ml)，用30 %乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至6. 85mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(50mM NaCl,IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率6. 85ms/cm)平衡好的裝有制備環(huán)己胺_5_氯-2，4，6-三氮嗪-Sepharose親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(50mM NaCl, IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率6. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. 1M，PH 3.0)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為94%。實(shí)施例5 (I)分離材料制備量取正i^一胺(65ml)用去離子水_ (300ml)溶解，與環(huán)氧基-聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠(200ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到正十一胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠(230ml)，用30%乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和 NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl,IOmM磷酸鈉，pH 7.0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)平衡好的裝有制備的正i^一胺_5_氯-2，4，6-三氮嗪-聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠親和分離材料的層析柱(I X 5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl, IOmM磷酸鈉，pH 7. 0,電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly，pH 3. 0)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為97%。實(shí)施例6 (I)分離材料制備量取正丁胺(IOOml)用去離子水(300ml)溶解，與三氯三氮嗪活化的瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物介質(zhì)(300ml)混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6. 5 8.0之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到正丁胺-5-氯_2，4，6-三氮嗪-瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物介質(zhì)(260ml)，用30%乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至13. 20mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(150mM NaCl,IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率13. 20ms/cm)平衡好的裝有制備的正丁胺_5-氯-2，4，6_三氮嗪-瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物親和分離材料的層析柱(I X 5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(150mM NaCl，IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率13. 20ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly,pH 3.0)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定，蛋白A純度為95. 3%。實(shí)施例I (I)分離材料制備量取正戊胺(200ml)用去離子水(800ml)溶解，與三氯三氮嗪活化的烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚介質(zhì)(900ml)混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在
6.5 8. 0之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl，10倍體積蒸懼水充分洗漆，得到正戍胺-5-氯-2,4,6- 二氮嗪-烯丙基葡聚糖和N,N’_亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚介質(zhì)(860ml)，用30%乙醇儲(chǔ)存待用。
(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl,IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)平衡好的裝有制備的正戊胺_5_氯-2，4，6-三氮嗪-烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚介質(zhì)親和分離材料的層析柱(I X 5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl，IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly，pH 3. 5)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為98. 5 %。實(shí)施例8 (I)分離材料制備量取正辛胺(200ml)用去離子水(800ml)溶解，與三氯三氮嗪活化的交聯(lián)的葡聚 糖珠(900ml)混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6. 5 8. 0之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到正辛胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-交聯(lián)的葡聚糖珠(860ml)，用30 %乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl,IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)平衡好的裝有制備的正辛胺_5_氯-2，4，6-三氮嗪-交聯(lián)的葡聚糖珠親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmMNaCl，IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly，pH 4.0)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為98. I %。實(shí)施例9 (I)分離材料制備量取十二胺(200ml)用去離子水(800ml)溶解，與三氯三氮嗪活化的葡聚糖凝膠珠(900ml)混勻，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6. 5 8. 0之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到十二胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-葡聚糖凝膠珠(860ml)，用30%乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl,IOmM磷酸鈉，pH 7.0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)平衡好的裝有制備的十二胺_5_氯-2，4，6-三氮嗪-葡聚糖凝膠珠親和分離材料的層析柱(I X 5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl，IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. 05MNaCl，0. IM Gly，pH 3. 5)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為97. 5%。實(shí)施例10 (I)分離材料制備量取正金鋼胺(5ml)用去離子水_(30ml)溶解，與環(huán)氧基-膨脹床S印harose(20ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到金鋼胺-5-氯-2，4，6-三氮嗪-膨脹床Sepharose (15ml),用30%乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl,IOmM磷酸鈉，pH 7.0，電導(dǎo)率9. 30ms /cm)平衡好的裝有制備的金鋼胺_5_氯-2，4，6-三氮嗪-膨脹床Sepharose親和分離材料的層析柱(I X 5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmMNaCl，IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM NaCl, 0. IMGly，pH 3. 5)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為96. 5%0實(shí)施例11 量取2，4-二氨基-6-羥基吡啶(4ml)用去離子水_(30ml)溶解，與環(huán)氧基-羥乙基甲基丙烯酸酯珠(20ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到2，4-二氨基-6-羥基吡啶-羥乙基甲基丙烯酸酯珠(16ml)，用30%乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCljIOmM磷酸鈉，pH 7.0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)平衡好的裝有2，4-二氨基-6-羥基吡啶-羥乙基甲基丙烯酸酯珠親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl, IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. 15MNaCl, 0. IMGly，pH 3. 5)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為95.8%。實(shí)施例12 量取2-氨基-2-噻唑啉(6ml)用去離子水-(30ml)溶解，與環(huán)氧基-纖維素珠(25ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到2-氨基-2-噻唑啉-纖維素珠(22ml)，用30 %乙醇儲(chǔ)存待用。(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCljIOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)平衡好的裝有2-氨基-2-噻唑啉-纖維素珠親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl，IOmM磷酸鈉，pH 7. 0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly，pH 3. 5)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為98. I %。實(shí)施例13 量取2,5-二甲基苯胺(IOml)用去離子水_(70ml)溶解，與環(huán)氧基-toyopearlHW-65(60ml)混勻，用IM NaHO調(diào)節(jié)pH在12之間，置于50°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM醋酸，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到2，5- 二甲基苯胺-toyopearl HW-65 (55ml)，用 30 % 乙醇儲(chǔ)存待用。
(2)大腸桿菌中蛋白A的親和純化取實(shí)例I步驟⑵制備的含蛋白A上清樣品，以IN HCl調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導(dǎo)率調(diào)至9. 30mS/cm，上樣至預(yù)先用10倍體積磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCljIOmM磷酸鈉，pH 7.0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)平衡好的裝有2，5-二甲基苯胺-toyopearl HW-65親和分離材料的層析柱(lX5cm)中，依次用磷酸鹽緩沖液(IOOmM NaCl，IOmM磷酸鈉，pH 7.0，電導(dǎo)率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-鹽酸緩沖液(0. IM Gly，pH 3. 5)洗脫結(jié)合的蛋白A，收集后以SDS-PAGE鑒定蛋白A純度為97. 8%。應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，如基礎(chǔ)可以更換成葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠等，這些等價(jià)形式同樣落于 本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種蛋白A的親和分離材料，其特征在于，所述分離材料是用活化基礎(chǔ)分離材料固定能夠結(jié)合蛋白A的配體分子，合成仿生親和分離材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白A的親和分離材料，其特征在于，所述能夠結(jié)合蛋白A的配體分子是正丁胺、正戊胺、環(huán)戊胺，正己胺、環(huán)己胺，二正己胺、正辛胺、正十一胺，十二胺，金鋼胺，2,4- 二氨基-6-羥基吡唆，2-氨基-2-噻唑啉，2，5- 二甲基苯胺中一種和/或混口 o
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白A的親和分離材料，其特征在于，所述活化基礎(chǔ)分離材料的基質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白A的親和分離材料，其特征在于，所述活化基礎(chǔ)分離材料的活化方式是用光活性反應(yīng)化學(xué)利用對(duì)重氮苯基乙二醛、重氮苯甲酰肼、磺基琥珀酰-6-(4'-重氮-2'-硝基苯胺)己酸、或N-[4-(對(duì)疊氮水楊酰胺基)丁基]-3' -(2' - 二硫代吡啶)丙酰胺進(jìn)行基礎(chǔ)分離材料活化。
5.一種蛋白A的親和純化方法，其特征在于，所述的方法包括下列步驟 (1)用活化基礎(chǔ)分離材料固定能夠結(jié)合蛋白A的配體分子，合成仿生親和分離材料；和 (2)用制備的仿生親和分離材料從含蛋白A的原料中純化蛋白A。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白A的親和純化方法，其特征在于，在步驟(2)中，蛋白A為天然蛋白A、重組蛋白A和蛋白A突變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白A的親和純化方法，其特征在于，在步驟(2)中，親和介質(zhì)吸附蛋白A的條件為pH 6. 5-7. 5，NaCl濃度為0. 0-0. 15M的緩沖液；洗脫條件為pH2.0-4. 0，NaCl濃度為0-0. 15M的緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白A的親和的純化方法，其特征在于，所述的蛋白A是用重組技術(shù)把蛋白A基因放在微生物宿主中進(jìn)行表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白A的親和分離材料和親和純化方法，包括下列步驟(1)用活化基礎(chǔ)分離材料固定能夠結(jié)合蛋白A的配體分子，合成仿生親和分離材料。(2)用制備的仿生親和分離材料從含蛋白A的原料中純化蛋白A。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產(chǎn)高純度的蛋白A。
文檔編號(hào)C07K14/31GK102731631SQ20111008726
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者馮爭(zhēng)名, 李榮秀, 楊予宛 申請(qǐng)人:常州榮君生物醫(yī)藥科技有限公司