專利名稱：GhASN-like基因、表達載體及其在提高棉花產量中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及棉花GhASN-Iike基因的用途，還涉及超量表達該基因的植物表達載體和通過基因工程技術來提高棉花纖維和棉籽產量的方法
背景技術：
棉花是世界上最重要的天然纖維作物，也是蛋白、油脂的重要來源。正是因為棉花纖維和種子與人類生活密切相關，成為世界上最重要的經濟作物。我國是世界上最大的紡織品生產國和消費國，棉花產業(yè)在我國國民經濟中具有舉足輕重的地位。棉花的產量和品質性狀為多基因控制的數量性狀，且產量與品質性狀在遺傳上存在負相關關系。常規(guī)育種方法在棉花高產、優(yōu)質等育種工作中發(fā)揮了重要作用。但是，僅靠常規(guī)育種手段和現有棉花遺傳種質資源，難以大幅度提高棉花產量和品質來滿足快速發(fā)展紡織工藝對纖維產量與品質的要求?；蚬こ逃N能實現優(yōu)良目的基因的定向轉移，同時具有后代易于穩(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點，這為棉花纖維產量和品質的改良提供了新的途徑。 但是目前人們對棉花纖維發(fā)生、發(fā)育和品質形成的分子機理知之甚少，也還未挖掘出與棉纖維產量、品質直接相關的基因，使得利用基因工程改良棉花纖維缺乏有效的目的基因。這些都極大地阻礙了棉花纖維產量與品質的改良進程。在棉花胚珠發(fā)育過程中，種胚和纖維發(fā)育具有同步性。纖維著生在種子表皮，是種子的表皮毛，纖維的發(fā)育需要胚珠為其提供各種營養(yǎng)物質(Reiner H. Kloth and Rickie B.Turley，2010)。因此，棉花胚珠發(fā)育以及種子形成對纖維發(fā)育有重要影響。研究棉花胚珠的發(fā)育，不僅對了解纖維發(fā)育調控機理、以及棉花種子與纖維發(fā)育間的關系有重要科學意義，而且可望在提高纖維產量與品質的同時也增加種子產量，在提高棉花生產的綜合效益方面具有非常重要的實踐意義。GhASN-Iike基因編碼236個氨基酸殘基，預測其分子量為25. 4kDa。同源性分析表明該基因編碼氨基酸殘基與生長素下調和鋁誘導基因編碼氨基酸序列同源性達75%以上， 但目前這些基因功能均未知。在GhASN-Iike及其同源基因編碼蛋白中存在的蛋白結構域有Wali7、Gn AT II，和AsnB等。其中wali7結構域就是以第一個從小麥中分離的基因命名的，該結構域功能尚不清楚。Gn AT II為谷氨酰胺氨基轉移酶家族II (GATase)。谷氨酰胺酶結構域催化氨態(tài)氮從谷氨酰胺中轉移出來作為底物，水解谷氨酰胺后產生谷氨酸和氨。 這個結構域屬于Ntn水解酶超基因家族，在氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸(GLMS或GFAT)合成酶，谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸(PRPP)氨基轉移酶(GPATase)，天冬酰胺合成酶B (AsnB)， β -內酰胺合成酶(β-LS)和谷氨酸合成酶(GltS)等酶的N端都存在Gn AT II結構域。 AsnB (天冬酰胺合成酶B)催化天冬氨酸和谷氨酰胺合成天冬酰胺。谷氨酸合成酶和天冬酰胺合成酶都參與合成N-轉運氨基酸。谷氨酸合成酶催化氨基從谷氨酰胺到α-酮戊二酸的還原轉移，形成兩分子的谷氨酸。天冬酰胺合成酶催化谷氨酰胺和天冬氨酸合成天冬酰胺。植物體內有機化合物代謝釋放的銨，如種子萌發(fā)時發(fā)生的氨基酸脫氨基反應以及其他合成反應等產生的銨，由于植物不分泌含氮化合物，需要將體內反應產生的銨再次同化，以供自身生長與發(fā)育(布坎南B. B等著，瞿禮嘉等譯， 2004)。這兩個酶就負責參與植物體內自由銨的再次同化過程。GhASN-Iike及同源基因編碼蛋白具有與谷氨酸合成酶和天冬酰胺合成酶相同的結構域，據此推測GhASN-Iike及同源基因可能具有與谷氨酸合成酶和天冬酰胺合成酶相類似的功能，可能在植物體內銨再次同化，碳氮平衡調節(jié)中發(fā)揮作用在棉花胚珠發(fā)育過程中，纖維發(fā)育需要大量碳源的提供，胚珠是纖維發(fā)育所需能源物質的最直接提供者。在纖維發(fā)育過程中，會產生極不平衡的碳氮比例，且所述 GhASN-Iike基因在棉花胚珠中高表達，顯示該基因可能參與了這種碳氮關系的協(xié)調。棉花 GhASN-Iike (Gossypium hirsutum ASN-like, GhASN-Iike)基因受生長素抑制，協(xié)調胚珠中碳代謝來調控胚珠發(fā)育過程，對胚珠的正常發(fā)育具有非常重要的作用。棉花胚珠發(fā)育影響棉鈴形成，棉鈴性狀與棉花最終生產目標和棉花主要目標性狀密切相關。提高GhASN-Iike 基因表達有利于胚珠發(fā)育，從而對單株成鈴數、鈴重等與棉花產量構成相關的性狀產生影響。

發(fā)明內容
鑒于以上情況，為了實現棉花高產育種，利用提高棉花GhASN-Iike基因的表達量有利于胚珠發(fā)育，從而可對單株鈴數、鈴重等與棉花產量構成等相關性狀產生影響的特點， 本發(fā)明應用基因工程技術從棉花中分離獲得GhASN-Iike基因，并將其與強啟動子融合后構建植物表達載體，轉化到棉花植株中，結果表明提高棉花植株中GhASN-Iike基因的表達水平，可增加棉花胚珠中糖含量，提高單株成鈴數、每鈴種子數。根據本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的一個目的在于提供棉花GhASN-Iike基因的新用途，即超量表達棉花GhASN-Iike基因在棉花高產育種中的應用。本發(fā)明通過從棉花基因組中分離棉花GhASN-Iike基因(SEQ ID NO. 9)，構建超量表達棉花GhASN-Iike基因的植物表達載體，和反義抑制棉花GhASN-Iike基因表達的植物表達載體。用該載體轉化植物，獲得轉基因棉花株。證明棉花GhASN-Iike基因表達水平增加能提高棉花的籽棉產量，為棉花的高產育種提供了新的途徑。GhASN-Iike基因可以是由動物、植物或微生物中分離克隆得到的天然基因，也可以是人工改造或設計的基因。優(yōu)選的，上述的棉花GhASN-Iike基因為生長素抑制基因，參與碳代謝調控過程。更優(yōu)選的，本發(fā)明GhASN-Iike基因為棉花胚珠中優(yōu)勢表達的基因。根據本發(fā)明的另一方面，提供一種超量表達棉花GhASN-Iike基因的植物表達載體，應用基因工程技術將棉花GhASN-Iike基因與強啟動子可操作地連接，構建植物表達載體。轉化植株后，在強啟動子的作用下超量表達棉花GhASN-Iike基因。其中，強啟動子可以是各種提高目的基因表達的增強型啟動子，優(yōu)選CaMV 35S啟動子。優(yōu)選的植物表達載體具有如圖3所示的載體結構。該優(yōu)選載體以GhASN-Iike基因序列正向連接在p5植物表達載體CaMV35S啟動子后，形成超量表達該基因的植物表達載體(pGA)。而以GhASN-Iike基因同源性高的部分序列反向插入到P5表達載體CaMV35S啟動子之后，形成GhASN-Iike基因反義表達載體(PAGA)，通過反義抑制該基因表達后，從另一方面證明改變該基因表達對產量產生影響。根據本發(fā)明的再一方面，提供制備包含超量表達棉花GhASN-Iike基因的轉基因棉花的方法，通過從棉花基因組中分離棉花GhASN-Iike基因，將其與強啟動子可操作地連接，構建超量表達棉花GhASN-Iike基因的植物表達載體，將該載體轉化宿主獲得轉化體， 再將該轉化體轉入棉花植株獲得轉基因棉花。 根據本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的又一個目的在于提供一種提高棉花產量的方法，通過在棉花中超量表達棉花GhASN-Iike基因來提高棉花產量，該方法包括將超量表達棉花GhASN-Iike基因的植物表達載體整合到棉花基因組中的步驟。本發(fā)明中所指的“棉花產量”是指棉花生產中收獲的籽棉與皮棉重量，其產量構成因素包括單株鈴數、鈴重和衣分等。本發(fā)明中所指的“轉基因棉花”是指通過分子生物學、生物技術手段，將其它生物啟動子或基因轉移到棉花中，從而使其遺傳物質被改造的棉花。用于改造的基因可以來源于植物自身或其它植物、動物以及微生物或者人工合成改造。本發(fā)明在選定了目的基因的情況下，在棉花中超量表達目的基因是本領域常用的方式。上述表達載體可以構建成含單個基因的單價載體，也可以構建含多基因的雙價或三價等類型的載體。在使用本發(fā)明方法提高棉花產量的過程中，可以只在一個部位表達一個目的基因，也可以在多個部位和多個發(fā)育階段表達多個基因。本發(fā)明從超量表達GhASN-Iike基因和反義抑制該基因表達正反兩個方面證明超量表達GhASN-Iike基因可提高棉花產量。具體為，按照上述制備超量表達棉花 GhASN-Iike基因的轉基因棉花植株的方法，獲得超量表達的轉基因棉花株系。并按照本領域常規(guī)方法制備反義抑制GhASN-Iike基因表達的棉花株系；分別實現在棉花基因組中超量表達GhASN-Iike基因和反義抑制GhASN-Iike基因表達。對超量表達GhASN-Iike 基因的轉基因棉花株系分析發(fā)現，轉基因株系胚珠中蔗糖和果糖的含量增加，反義抑制 GhASN-Iike基因表達的轉基因株系胚珠中蔗糖和果糖含量降低。超量表達GhASN-Iike基因與反義抑制GhASN-Iike基因表達的轉基因棉花在網室中的試驗數據顯示，與分離的非轉基因株系相比，超量表達GhASN-Iike基因的轉基因株系單株成鈴數、每鈴種子數明顯增力口，反義抑制GhASN-Iike基因表達的轉基因株系的單株成鈴數、每鈴種子數明顯減少。最終產量比較結果顯示，相對于分離的非轉基因株系，超量表達GhASN-Iike基因的轉基因株系籽棉產量增幅最高達到14. 3%、皮棉產量最高達到17. 9%;反義抑制GhASN-Iike基因表達的轉基因株系籽棉與皮棉產量則分別下降了 23. 3%和19. 5%。上述各株系收獲的棉花纖維經農業(yè)部棉花品質監(jiān)督檢驗測試中心進行纖維5項指標檢測分析，結果表明與分離的非轉基因株系相比，GhASN-Iike基因的轉基因株系的纖維品質性狀改變較小。說明改變該基因表達水平，對纖維品質性狀的影響不大。本發(fā)明提高棉花產量的方法，是通過在棉花中超量表達GhASN-Iike基因以調控胚珠發(fā)育，增加胚珠中蔗糖和果糖含量，促進胚珠發(fā)育，從而達到提高棉花產量的目的。試驗結果證明，經本發(fā)明改良的轉基因棉花單株成鈴數和每鈴種子數有所增加，從而提高棉花籽棉和皮棉產量。本發(fā)明方法簡便易行，效果顯著。本發(fā)明應用后，不僅可提高棉花纖維產量，為棉花生產帶來巨大效益，作為油脂和蛋白重要來源的棉籽產量增加，還可增加棉花生產的附加值，提高了棉花生產的綜合效益。


圖1為在培養(yǎng)基中添加不同濃度IAA及其抑制劑對胚珠中GhASN-Iike基因表達的影響結果圖?？v坐標代表基因相對表達水平。橫坐標代表不同濃度的IAA和抑制劑在離體培養(yǎng)條件下，胚珠生長發(fā)育需要適量的生長素才能正常發(fā)育。參照棉花胚珠正常離體培養(yǎng)IAA的濃度(5 μ mol/L)，IAA處理濃度設置2、5、10和25 μ mol/L四個梯度。 然后取開花當天的胚珠，在添加有不同濃度IAA的胚珠培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d。提取胚珠RNA, 反轉錄合成一鏈，然后進行定量PCR分析。數據結果顯示在低濃度IAA條件下，GhASN-Iike 基因表達水平較高，高濃度條件下，其表達水平低，并且該基因表達水平隨IAA濃度的增加而逐漸下降。說明高濃度IAA抑制該基因的表達。在添加有ΙΑΑ/ΝΡΑ、IAA/TIBA培養(yǎng)條件下，GhASN-Iike基因表達水平比添加IAA明顯增高。與只添加IAA相比，添加IAA/NPA、IAA/ TIBA后GhASN-Iike基因表達水平提高4 5倍。說明添加IAA運輸抑制劑可以解除IAA 對GhASN-Iike表達的抑制，基因表達水平的增加。圖2為FBP: iaaM轉基因棉花胚珠中iaaM和GhASN-Iike基因表達水平分析結果圖。FM-6、FM-9、FM-20、AM-1、AM-2為不同轉基因株，FM為FBP7: iaaM轉基因棉花，AM為 Agl5: iaaM轉基因棉花，WiIdtype為野生型?？v坐標代表iaaM和GhASN-Iike基因相對表達水平。與野生型胚珠中的表達相比，GhASN-Iike基因在FBP7 iaaM轉基因棉花胚珠中的表達下降，且轉基因株中iaaM基因表達越強，GhASN-Iike基因表達就越弱，趨勢明顯。 Agl5: iaaM轉基因棉花胚珠中GhASN-Iike基因表達模式與FBP7: iaaM轉基因棉花的結果一致，GhASN-Iike基因在野生型中的表達明顯高于Agl5: iaaM轉基因株，且iaaM基因表達量越高，GhASN-Iike基因表達越低，表明GhASN-Iike基因確實受iaaM基因表達的負調控。結果進一步證明生長素IAA抑制GhASN-Iike基因的表達。圖3為強啟動子CaMV35S控制GhASN-Iike基因超量表達的植物表達載體的構建流程圖其中，Km為卡那霉素抗性基因；Amp為氨芐青霉素抗性基因；NPTII為新霉素磷酸轉移酶基因；GUS為β-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S為來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；P-nos為冠癭堿合成酶基因啟動子；T-nos為冠癭堿合成酶基因終止子；LB為 T-DNA左邊界；RB為T-DNA右邊界。用于構建植物表達載體的骨架載體為pBI121基礎上改造的p5載體，具有CaMV 35S啟動子調控下的GUS基因，便于在植物遺傳轉化的過程中對轉化子進行GUS染色的篩選。圖4為GhASN-Iike基因的反義表達載體pAGA構建流程圖其中，Amp為氨芐青霉素抗性基因；⑶S為β-葡萄糖酸苷酶基因；NPTII為新霉素磷酸轉移酶基因；CaMV 35S為來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子，P-Nos為冠癭堿合成酶基因啟動子；T-Nos為冠癭堿合成酶基因終止子；Km為卡那霉素抗性基因；LB和 RB分別為整合進入植物基因組序列的左右邊界。ρ5載體同上。圖5為強啟動子CaMV35S控制的GhASN-Iike基因超量表達載體結構6為CaMV35S: GhASN-Iike基因在轉基因棉花中的PCR分析圖因在野生型棉花基因組存在GhASN-Iike基因，為有效地鑒定轉基因株，以 CaMV35S: GhASN-Iike表達元件中CaMV35S啟動子5'端序列設計上游引物，GhASN-Iike基因3'端序列設計下游引物進行擴增，目的片段約1.5kb。其中，M為分子量標準，P為質粒 DNA為模板，1-4泳道為轉基因棉花植株，5泳道為空載轉基因植株，W為水。圖 7 為 CaMV35S: GhASN-Iike 基因在轉基因棉花的 Quantity Real Time-PCR 分析圖。其中，M-7、N-18、N_22和0-7為轉基因棉花。WT和WT2為未進行轉化過的野生型棉花(冀14)，NullU Null2為轉基因棉花分離產生的非轉基因植株作為對照。對超量表達載體的轉基因棉花株系胚珠中目的基因表達水平進行了檢測。相對表達量分析經三次重復，確定超量表達的轉基因株。有3個轉化子的轉基因植株表達水平高于Null和野生型植株。每個轉化子的不同單株在表達水平上也存在一定的差異，在編號為M、N和0等轉化子中M-7、N-18和0-7單株比同株系的其它植株表達水平高。

圖8為反義抑制GhASN-I ike基因表達的轉基因棉花中GhASN-I ike基因的 Northern雜交結果圖。其中，AC-3 -11、AG-U AG-3為反義抑制GhASN-Iike基因表達的轉基因棉花株系，Null為分離產生的非轉基因株系，0E18、0E7為超量表達GhASN-Iike基因的轉基因植株。rRNA為上樣對照。對各反義抑制GhASN-Iike基因表達的轉基因株系胚珠(10 15dpa)中GhASN-Iike基因的表達水平進行Northern雜交分析。從雜交結果來看反義抑制 GhASN-Iike基因表達的轉基因株AC-3、AC_8、AC-10和AG-3中目的基因表達受到抑制，其中AC-3和AG-3轉基因株系目的基因表達受到抑制最為嚴重，轉基因株胚珠中GhASN-Iike 基因的表達水平下調明顯。
具體實施例方式本發(fā)明實施例中的基因工程載體、試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell，2001)。棉花基因組來源于陸地棉品種徐州142，轉基因受體材料為冀棉14。實施例1目的基因的制備1. DNA 的提取選取棉花幼葉0. 5-lg，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65°C預熱的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，1. 5mol/L NaCl,2%CTAB (ff/V), 4%PVP40 (ff/V)和2%巰基乙醇(V/V)，PVP和巰基乙醇使用前加入)，快速振蕩混勻。65°C 水浴30min，然后加入ImL 5mol/L KAc，冰浴20min后，用等體積的氯仿異戊醇(24 1) 抽提1次(10，000r/min，4°C離心5min)，取上清，加入2/3倍體積的-20°C預冷異丙醇， 混勻，靜置約30min，用玻棒挑出絮狀沉淀，用75%的乙醇反復漂洗數次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于500 μ L TE中。加入IyL RNaseA(10mg/mL)，37°C處理lh。再用酚 (ρΗ8· 0)氯仿異戊醇(25 24 1)和氯仿異戊醇(24 1)各抽提1次(10，OOOr/ min，4°C離心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75 %的乙醇漂洗，風干，溶于200 μ L TE 中，-20°C保存?zhèn)溆谩?.總RNA的提取與cDNA合成取約3g新鮮棉花材料，在液氮中迅速磨成精細粉末，裝入50mL離心管，加入15mL 65°C預熱的 RNA提取液(2% CTAB (W/V) ,2% PVP (W/V)，IOOmmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，0. 5g/L Spermidine, 2, Omol/L NaCl，2%巰基乙醇(V/V，使用前加入))，顛倒混勻。65°C水浴3 lOmin，期間混勻2 3次。氯仿異戊醇(24 1)抽提2次(10，000r/min，室溫，5min)。 取上清，加入1/4體積lOmol/LLiCl溶液，4°C放置6h，以氯仿異戊醇(25 24 1)各抽提1次(10，000r/min,室溫，5min)。加2倍體積的無水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min以上。 12，000r/min, 4°C離心20min，棄上清。沉淀用200 μ L的DEPC處理水溶解。酚(ρΗ4. 5) 氯仿異戊醇(25 24 1)、氯仿異戊醇(24 1)各抽提1次(10，OOOr/min，室溫， 5min)。加1/10體積3mol/L NaAc溶液和2. 5倍體積的無水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min 以上。12，OOOr/min，4°C離心20min，棄上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，風干。加200 μ L 的DEPC處理水溶解。用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量。取約1 μ g的總RNA，用cDNA —鏈合成試劑盒(MBI公司)合成各種RNA的一鏈cDNA，操作均按試劑盒說明書進行。3.目的基因序列的PCR擴增
1 OxEx PCR buffer (Mg2+ free)2.5 μ
2.5 mmol/L dNTPs2 μ ^
25 mmol/L MgC122 μL
引物 l(5pmol/L)IpL
引物 2(5pmol/L)1 μ ,
Ex Taq DNA 聚合酶1 U
基因組DNA或cDNA_約60 ng25 的擴增體系引物1和引物2序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示，擴增程序為94°C，5min ； 94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，30sec，30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 擴增產物經測序，獲得目的基因序列如SEQ ID No. 9所示。實施例2體外和體內增加生長素含量對GhASN-Iike基因表達的影響取開花當天的蕾鈴，剝去花瓣、萼片等，留下子房。先將子房在75%酒精中浸潤進行表面活化處理，然后加0. 的升汞，滅菌處理10 15min，用無菌蒸餾水洗滌6次。剝取胚珠置于胚珠培養(yǎng)基(胚珠離體正常培養(yǎng)基配方為BT培養(yǎng)基+18g/L葡萄糖+3. 6g/L果糖+0. 5μπι01/1 GA3+5ymol/L IAA)中，置于32°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。具體方案如下(1)在培養(yǎng)基中分別添加 2 μ mol/L, 5 μ mol/L, 10 μ mol/L 禾口 25 μ mol/L 的 IAA 對 ODPA的胚珠進行培養(yǎng)進行培養(yǎng)5d。(2)在添加有 5 μ mol/L ΙΑΑ、0· 5 μ mol/L GA3 和 IAA 極性運輸的抑制劑 NPA (NPA 使用濃度50 μ mol/L)的培養(yǎng)基中，對ODPA胚珠進行培養(yǎng)5d。(3)在添加有5 μ mol/L ΙΑΑ、0· 5 μ mol/L GA3和IAA極性運輸的抑制劑TIBA培養(yǎng)基中(TIBA使用濃度50 μ mol/L)，對ODPA胚珠進行培養(yǎng)5d。 將經過不同濃度IAA、以及IAA抑制劑處理后胚珠從培養(yǎng)基中撈出，在吸水紙上除去多余水份，立即置研缽中加液氮研磨成粉。其余操作同上述RNA提取方法，按如下方法進行基因表達分析(數據結果見圖1)。FBP7和Agl5是具有胚珠特異性的啟動子，iaaM基因來自細菌，在植物中表達可提高內源IAA的生物合成水平。專利發(fā)明人在前期工作已經獲得生長素含量增加的轉 FBP7:: iaaM、Agl5:: iaaM的轉基因棉花植株(專利申請?zhí)柹暾埲伺嵫椎?。為檢測內源增加生長素對目的基因表達的影響，對FBP7: iaaM、Agl5 iaaM轉基因棉花田間材料掛牌，取開花后 15d胚珠提取RNA，按如下方法進行基因表達分析(數據結果見圖2)。實施例3目的基因表達水平檢測 在提取植株材料總RNA后，用cDNA —鏈合成試劑盒(MBI公司)合成各種RNA的一鏈cDNA，操作均按試劑盒說明書進行。取IyL—鏈產物為模板首先進行RT-PCR擴增， 檢測模板擴增效果。其25 μ L擴增體系包括1 XPCR緩沖液，0. 2mmol/L dNTPs, 1. 5mmol/ L MgC12，上、下游引物(SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6)各 0. 2 μ mol/L，IU Taq DNA 聚合酶 (Promega)。熱循環(huán)參數為94°C 預變性 3min ；94 °C，30sec，56 °C，30sec，72 °C，30s，30 循環(huán)；72°C延伸lOmin。用組蛋白Histone3基因作內標。組蛋白Histone3的引物序列為SEQ IDN0. 7 和 SEQ ID NO. 8 (Zhu YQ 等，2003，植物生理，133，580-88)。將檢測擴增效果好的模板進行定量PCR檢測。具體操作步驟為PCR在Bio-Rad 公司的 iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System 儀器上進行，在 25μ L 的反應體系中包括 12. 5μ L iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)，上、下游引物各0.2 μ mol/L和IyL—鏈產物。熱循環(huán)參數為:94°C預變性3mins ；94°C，30sec，56°C， 30sec，72°C，30sec，預設循環(huán)數為35。用棉花Histond基因作內標，上、下游引物序列是 SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8。擴增GhASN-Iike基因的上、下游引物序列為SEQ ID N0. 5 和SEQ ID N0. 6。在運行quantitative real-time PCR前，用相同引物和模板在相同的溫度調控程序中擴增一次，通過瓊脂糖電泳，檢查并確保擴增產物是單帶。實施例4表達載體的構建載體構建流程見圖3、圖4。所有限制性內切酶購自Roche公司，按照使用說明書操作。實施例5植物表達載體經農桿菌導入棉花基因組1.用電激法將構建的植物表達載體質粒導入農桿菌LBA4404。參考Bio-RAD MicroPulser用戶說明書，將上述載體通過電激轉化法導入農桿菌 LBA4404。2.超量表達GhASN-Iike基因的載體整合到棉花基因組。通過根癌農桿菌介導的方法進行棉花的遺傳轉化。表1 根癌農桿菌介導的棉花遺傳轉化用培養(yǎng)基
權利要求
1.超量表達棉花GhASN-Iike基因在棉花高產育種中的應用，其中所述GhASN-Iike基因具有如SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列。
2.一種超量表達棉花GhASN-Iike基因的植物表達載體，至少包含棉花GhASN-Iike基因和強啟動子，所述GhASN-I ike基因序列正向連接在強啟動子之后，所述GhASN-I ike基因具有如SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列。
3.權利要求2所述的植物表達載體，其中所述強啟動子為CaMV35S啟動子。
4.權利要求3所述的植物表達載體，其中所述載體具有如圖5所示的結構。
5.一種制備轉基因棉花的方法，包括下述步驟1)從棉花基因組中分離棉花GhASN-Iike基因；2)將GhASN-Iike基因與強啟動子可操作地連接，構建包含棉花GhASN-Iike基因和強啟動子的植物表達載體；3)將所述植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體；4)將所述宿主轉化植物，獲得超量表達棉花GhASN-Iike基因的轉基因棉花。
6.一種提高棉花產量的方法，其中包括將超量表達棉花GhASN-Iike基因的植物表達載體整合到棉花基因組中的步驟。
全文摘要
本發(fā)明將GhASN-like基因構建超量表達載體并整合到棉花基因組中，實現了該基因在棉花中的超量表達，增加了胚珠中糖的含量，增加轉基因株的單株成鈴數、每鈴種子等，從而增加了籽棉和皮棉產量。應用這一方法可以明顯增加單位面積籽棉和皮棉產量，在提高棉纖維產量，增加棉花生產經濟效益的同時，也可增加棉籽產量而提升棉花生產的附加值，提高棉花生產的綜合效益。
文檔編號C12N15/29GK102220348SQ20111010414
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權日2011年4月22日
發(fā)明者侯磊, 張覓, 李先碧, 李德謀, 李忠旺, 梁俊俊, 白文欽, 羅小英, 羅明, 肖月華, 裴炎 申請人:西南大學