專利名稱：一種高效的雙子葉百草枯表達載體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)領域，具體而言，本發(fā)明涉及一種高效的雙子葉百草枯載體。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、多抗、高效、多產(chǎn)的作物新品種，是緩解資源束縛、保護環(huán)境安全以及拓展農(nóng)業(yè)功能的重要途徑。發(fā)展和完善現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有重要的實際應用價值。在實際基因轉(zhuǎn)化操作過程中，只有小部分的植物細胞能夠吸收外源DNA并整合到植物基因組上，仍有大部分植物細胞處于未轉(zhuǎn)化狀態(tài)， 為了從數(shù)目龐大的植物細胞中篩選得到外源DNA整合的植物細胞，需要篩選標記基因的輔助。現(xiàn)在常用的篩選標記基因主要有抗生素類和除草劑兩類?？股乜剐曰蛞蚓哂懈咿D(zhuǎn)化效率和方便篩選等優(yōu)點而成為最常用的篩選標記。 但是人們擔心抗生素抗性基因會轉(zhuǎn)移到微生物中，使病原菌帶有抗生素抗性從而導致臨床上抗生素使用失效。另一方面，抗生素的價格昂貴，作為篩選標記成本高。因此，抗生素抗性基因作為篩選標記多用于科學研究過程中。除草劑抗性基因是近幾年來發(fā)展起來的一種新型的篩選標記與抗生素抗性基因相比，除草劑抗性基因具有價格低的優(yōu)點，也不會產(chǎn)生臨床抗生素失效等擔憂，同時除草劑抗性基因不僅是篩選標記基因還是一種目的基因，能使轉(zhuǎn)基因作物具有良好的除草劑抗性性狀?，F(xiàn)在主要使用的除草劑抗性基因有草甘膦抗性基因和草丁膦抗性基因等，因草丁膦價格相對較高使得草丁膦抗性基因作為篩選標記基因主要用于實驗室研究。草甘膦抗性基因是應用比較多的一種篩選標記基因。雖然除草劑抗性基因是產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)基因篩選的優(yōu)良選擇標記基因，但是其尚未得到大規(guī)模的應用。這主要由除草劑抗性基因單一造成的，目前大多數(shù)的除草劑抗性基因是草甘膦抗性基因，是在已有的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基因的基礎上修飾得到的，新型的除草劑抗性基因的研究一直沒有顯著進展。研發(fā)一種新型的除草劑抗性基因是一項工作量巨大而且具有很大不確定性的工作。百草枯(paraquat，1，1_二甲基_4，4’-聯(lián)吡啶，分子量257. 2)是繼草甘磷之后的第二大除草劑，是一種速效觸殺型除草劑，兼有一定內(nèi)吸作用，主要用于果園、桑園、茶園、 林帶等作物的雜草，在農(nóng)業(yè)種植中的廣泛應用已近50年，應用在世界范圍內(nèi)超過100個國家，受到廣泛接受與歡迎。百草枯是非選擇性除草劑，植物對其吸收非常迅速，即使噴藥后短期內(nèi)降雨也不影響藥效的發(fā)揮。百草枯具有接受廣泛、廣譜性、藥效明顯、價格低等優(yōu)點， 將是一種優(yōu)良的植物轉(zhuǎn)基因篩選劑，但是由于百草枯抗性基因的研究一直以來沒有突破性的進展，使得百草枯作為篩選劑也僅僅停留在實驗預想階段。本發(fā)明人通過漫長而艱苦的篩選實驗，終于篩選得到了一個百草枯抗性基因，并此基礎上發(fā)明了一種高效的雙子葉百草枯載體，利用該表達載體，不僅可以獲得高抗百草枯的轉(zhuǎn)基因植物，還能減少對抗生素的使用，提高轉(zhuǎn)基因植物的安全性，具有很大的實際應用價值和市場推廣前景。。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種高效的雙子葉百草枯表達載體，該表達載體包含一個表達盒和 virG 序列，表達盒依次包括雙 LB、Mar,35s, PQR5、Toes、P-Bch, PQR5、Tnos、Nos, RB。該雙子葉表達載體能夠提高PQR5基因在雙子植物中的表達量，獲得具有高百草枯抗性的雙子葉轉(zhuǎn)基因植物。“表達載體”是生物學領域的常用術(shù)語，是指含有一個或多個啟動子順序，能有效地促使插入的目的基因進行轉(zhuǎn)錄，進而翻譯出該插入基因編碼的蛋白產(chǎn)物的載體。本領域常用的表達載體以抗生素為篩選標記基因(比如PCAMBIA1300的篩選標記基因為HPT，產(chǎn)生潮霉素抗性；PCAMBIA2300的篩選標記基因為NPTII，產(chǎn)生卡那霉素抗性。)，本文所用的表達載體pCAMKT1300是將pCAMBIA1300的HPT基因置換成pqrK2基因，使其篩選劑由潮霉素變成百草枯。顯然，本領域的技術(shù)人員可以輕易將常用的表達載體如PCAMBIA系列載體、 PBI系列載體、Pbin系列載體、Gateway載體系列的抗生素以及其他的篩選標記基因置換成 pqrK2使其具有百草枯抗性，這些修改也納入本發(fā)明范圍內(nèi)。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。顯然本領域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復敘述過一樣。


圖1為H(T6載體示意圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常用分子生物學、組織培養(yǎng)技術(shù)和農(nóng)學手冊所記載的方法。具體步驟可參見《Molecular Cloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell, David W. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
實施例1 :H(T6表達載體的構(gòu)建
根據(jù)SEQ ID NO :1命名為MAR基因序列，設計引物時引入合適的酶切位點，設計引物 1:5，-TCGATTAAAAATCCCAATTATATT-3，，和引物 2: 5，-ACTATTTTCAGAAGAAGTTCCCA-3，，用引物1和引物2進行PCR擴增，然后酶切，得到插入片段；取pCAMBIA1303 (購自Cambia公司)用同樣的酶切，然后用連接酶連接上述插入片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序插入無誤后得到引入mar序列的H(T17的前體PPKT17。 根據(jù)SEQ ID NO :2命名為雙LB序列，設計引物時引入合適的酶切位點，設計引物
43:5，-TGGCAGGATATATTGTGGTGTA-3，，和引物 4 5，-TGTTTACACCACAATATATCCTGC-3，，用引物 3和引物4進行PCR擴增，然后酶切，得到插入片段；取上述H(T17的前體PPKT17用同樣的酶切，然后用連接酶連接上述插入片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的2XYT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序插入無誤后得到引入 mar序列和雙LB序列的PKT17的前體PPPKT17。根據(jù)SEQ ID NO :3命名為virG序列，設計引物時引入合適的酶切位點，設計引物 5:5，-TTATCAGGCTGCCATCGTC-3，和引物 6 5，-ATGAAACACGTTCTTCTTGTCG-3，，用引物 5 和引物6進行PCR擴增，然后酶切，得到插入片段；取用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切PPH(T17，然后用連接酶連接上述插入片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的 2XYT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序插入無誤后得到H(T17。設計帶酶切位點的引物7: 5，-ATGGCAATGAACCCTTATATTTAT-3，和弓丨物8: 5，-CCTTAATGTGGTGTGCTTCGTG-3，，用引物7和弓丨物8擴增PQR5，然后酶切，得到插入片段； 取用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切H(T17，然后用連接酶連接上述插入片段和載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，經(jīng)含有50mg/L卡那霉素的2X YT培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選后挑選陽性克隆，抽取質(zhì)粒后經(jīng)測序插入無誤后得到H(T6。
權(quán)利要求
1.一種高效的雙子葉百草枯表達載體，該表達載體包含一個表達盒和VirG序列。
2.權(quán)利要求1所述的雙子葉百草枯表達載體的表達盒，其特征在于該表達盒依次包含雙 LB、Mar、35s、PQR5、Toes、P-Bch> PQR5、Tnos、Nos> RB0
3.經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物或動物細胞，其具有如權(quán)利要求1或2所述的表達盒并具百草枯抗性。
4.經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞，其具有如權(quán)利要求1或2所述的表達盒并具百草枯抗性。
5.權(quán)利4要求所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞，其特征在于該植物是雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效的雙子葉百草枯表達載體，該表達載體包含一個表達盒和virG序列，表達盒依次包括雙LB、Mar、35s、PQR5、Tocs、P-Bch、PQR5、Tnos、Nos、RB。該雙子葉表達載體能夠提高PQR5基因在雙子植物中的表達量，獲得具有高百草枯抗性的雙子葉轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號C12N5/10GK102220358SQ20111010404
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者劉軍華, 夏勉, 張斌 申請人:北京未名凱拓作物設計中心有限公司