專利名稱：一種提取純化人體脫落細胞dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及一種提取純化DNA的方法。
背景技術：
DNA分離純化是分子生物學實驗中非常重要的操作，核酸的質量直接關系到后續(xù)操作能否順利進行。生物學、法醫(yī)學和基因組學的發(fā)展，強化了對從各種生物檢材中獲得核酸的復雜方法的需求。例如，脫氧核糖核酸提供了廣泛的關于遺傳起源和遺傳多態(tài)性信息。 這些信息可用于法醫(yī)遺傳學鑒定實踐。目前所存在的各種核酸純化方法皆可分成以下兩大類液相純化和固相純化。在液相純化中，核酸維持為液體狀態(tài)，而雜質通過沉淀、離心被除去或者核酸被沉淀出來，而雜質被保留；在固相純化中，核酸被結合到固相載體上，而雜質被選擇性洗脫。例如，采用液相純化來分離的DNA保留在液相中，而雜質被通過諸如沉淀和/或離心之類的方法除去。在固相純化中DNA結合到固相載體上，而雜質如RNA、蛋白質和磷脂等被選擇性洗脫。在DNA 純化中，如果起始材料包括細胞，液相方法和固相方法都需要細胞或病毒共破裂，或裂解步驟。破裂或裂解步驟產生與污染物如RNA、脂質、碳水化合物、蛋白質等混合的DNA。這種混合物還含有降解DNA的必須被除去和/或滅活以不感染產生基本上未降解的DNA的DNA酶。 兩個純化大類以前都利用常規(guī)的方法，需要繁瑣的步驟，且通常用到有害的試劑，現(xiàn)在也出現(xiàn)了更快速的提取方法，如Chelex-100法，僅需要較少的步驟，且通常較少的有害試劑。Chelex-100法一種快速液相DNA純化方法，Chelex-100是一種化學整合樹脂， 由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成。含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，整合多價金屬離子，尤其是選擇性整合二價離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強的結合力.能結合許多可能影響一步分析的其他外源物質。通過離心除去Chelex-100顆粒，使這些與Chelex-100結合的物質與DNA分離，防止結合到Chelex中的抑制劑或雜質帶到PCR 反應中，影響下一步的DNA分析，并通過結合金屬離子，防止DNA降解。利用螯合劑去除生物樣本中金屬雜質而達到純化的目的。該法首先用去離子水洗滌生物樣本，加入螯合樹脂的懸浮液56°C孵育一定時間，100°C孵育8分鐘，然后通過離心去除雜質。該方法簡單、快速 (僅涉及到兩種試劑的使用)。但該法提取得到的DNA純度不夠，不能滿足微量DNA生物樣本DNA提取純化的要求。固相提取方法近年來發(fā)展迅速，在核酸提取領域占有非常重要的地位。這類方法一般需要四個主要步驟裂解細胞使細胞膜、核膜DNA破裂以釋放DNA ；釋放的DNA與固相載體結合；雜質的洗滌；洗脫而得到純化的DNA。對于固相DNA純化，已使用了多種固相載體，如二氧化硅微球、薄膜過濾器、金屬氧化物、膠乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。當核酸存在于在高濃度離液鹽以及低的PH溶液中時，能夠吸附到硅類介質表面，并在低鹽高pH溶液中洗脫下來，從而達到提取純化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉從瓊脂糖凝膠中提取到DNA， 而Marko使用玻璃粉成功提純質粒DNA。Boom等對該方法加以改進，用二氧化硅和硅藻土為固相吸附劑，用來提取純化人血清或尿液中的微量病原體基因組DNA。該方法需要六步離心、五種試劑從全血種純化DNA。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種提取純化DNA的方法。本發(fā)明提供的提取純化DNA的方法，包括以下步驟1)預處理將生物樣品與預處理裂解液接觸，去除生物細胞所粘附的固體物質， 得到粗裂解液；2)核酸吸附將步驟1)得到的粗裂解液與裂解結合液以及磁珠懸浮液混合，DNA 將與磁珠結合，形成了含有磁性納米微球-DNA的復合體的溶液體系，收集所述溶液體系中的磁性納米微球-DNA的復合體；3)洗滌將步驟2)得到的磁性納米微球-DNA的復合體依次用洗滌液I、洗滌液II 洗滌，然后用洗脫液溶出DNA，得到純化的DNA。上述步驟1)中，所述生物樣品是血液、血斑、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、 汗液斑或脫落細胞時，所述預處理裂解液的PH為7. 4-8. 5，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質IO-IOOmM緩沖鹽，0. 5-5g/100ml的表面活性劑，I-IOOmM的螯合劑和50_150mM的可溶性鹽，0. 2-4mg/ml的蛋白酶K。精斑和毛發(fā)中DNA的提取，需在預處理裂解液中加入DTT (二硫蘇糖醇)，上述步驟 1)中，所述生物樣品是精液、精斑或毛發(fā)時，所述預處理裂解液的PH為7. 4-8. 5，溶劑是水， 溶質是如下終濃度的物質10-100mM緩沖鹽，0. 5-5g/100ml的表面活性劑，I-IOOmM的螯合劑，50-150mM的可溶性鹽，0. 2-4mg/ml的蛋白酶K和0. 025-0. 05M的二硫蘇糖醇。上述預處理裂解液中，緩沖鹽的濃度優(yōu)選為20_80mM，表面活性劑的濃度優(yōu)選為 0. 5-4g/100ml，螯合劑的濃度優(yōu)選為20_80mM，可溶性鹽的濃度優(yōu)選為50_130mM，更優(yōu)選為 80-100mM ；蛋白酶K的濃度優(yōu)選為0. 2_2mg/ml，更優(yōu)選濃度為0. 2-lmg/ml。所述預處理裂解液中的表面活性劑為陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑，優(yōu)選是陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為十二烷基磺酸鈉或十二烷基肌氨酸鈉。所述預處理裂解液還包括一種可溶性鹽溶液，DNA從細胞核中釋放并與組蛋白分離后，需要提高DNA在溶液中的溶解度。DNA在一定濃度氯化鈉溶液中的溶解度很高，Na+與帶負電的DNA結合成DNA鈉鹽。這使DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)并維持DNA在溶液中的穩(wěn)定性。所以在某些實施例中，可以使用NaCl等可溶性鹽。蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質的一般降解。此酶經純化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質的能力，因而它應用很廣泛。各種生物樣品，如血液、血斑、精液、精斑、毛發(fā)、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑或脫落細胞等首先要經過預處理裂解液浸泡，并在50-65°C的溫度下孵育 0. 5h-4h時間后，方可進行后續(xù)提取操作。孵育的溫度可優(yōu)選為56°C。
通過預處理裂解液對生物樣本的預處理，一是能夠使載體上黏附的細胞(如血白細胞、精子細胞、上皮細胞等)和DNA與載體分離或與組織脫離，游離在預處理裂解液中；二是裂解細胞，使DNA和蛋白質、磷脂等污染物釋放至消化液中，通過離心等方法去除載體后即形成粗裂解液并完成樣本預處理。所述步驟1)預處理中，本發(fā)明中的生物樣品如血斑、唾液斑等一般取3*3mm為宜， 這類樣本比較小，預處理裂解液可在100-200ul范圍內變化；對于體積較大樣本，預處理裂解液的量一般以完全覆蓋住生物樣本為宜，但最多不能超過300ul。預處理后形成的粗裂解液中包含DNA及蛋白質、細胞碎片、磷脂等細胞污染物。為了更充分的裂解細胞，最大程度的使DNA從細胞中釋放出來，并使釋放出來的DNA與磁性微球結合以達到分離純化的目的，可以使用裂解結合液。所述步驟2)核酸吸附中，每ml磁珠懸浮液的組分如下直徑為50-1200nm的納米級硅包被磁性微球50-100mg，其余為水。每ml磁珠懸浮液中的納米級硅包被磁性微球優(yōu)選是 50mgo所述裂解結合液的pH = 6. 4-7. 4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質20_150mM 的緩沖鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10% (體積百分比)的表面活性劑，0. 5-4g/100ml的兼性離子去污劑，IO-IOOmM的螯合劑以及15-30% (體積百分含量)的醇。上述裂解結合液中，離液鹽(Chaotropic鹽)優(yōu)選為4-6M，緩沖鹽優(yōu)選為 50-120mM的Tris-HCl，螯合劑優(yōu)選為20_80mM，表面活性劑的濃度優(yōu)選為(體積百分比)，兼性離子去污劑的濃度優(yōu)選為l_3g/100ml，醇優(yōu)選為20- % (體積百分含量)；所述裂解結合液中的表面活性劑優(yōu)選用非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑為Triton X-100、Tween 20、Tween 21、Tween. 40、Tween 60、Tween 80、Tween 85、NP-40、Brij 30 或 Span 20 ；所述兼性離子去污劑是3-(3-膽胺丙基)_ 二甲氨基丙磺酸；所述醇是乙醇、 異丙醇或聚乙二醇。所述步驟2、核酸吸附中，粗裂解液與裂解結合液以及磁珠懸浮液混合可以先將粗裂解液與裂解結合液混合，然后再往粗裂解液和裂解結合液中加入磁珠懸浮液。加入磁珠懸浮液混合的條件是室溫O0-3(TC )混合5-8分鐘。上述裂解結合液與粗裂解液的比例關系是O 3) 1。上述磁珠懸浮液與裂解結合液、粗裂解液的比例關系是(10-30) μ 1 (200-900) μ 1 (100-300) μ 1。上述步驟幻洗滌中，所述洗滌液I的溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質4-6Μ 的Chaotropic鹽，25-50% (體積百分含量)的醇和IO-IOOmM的螯合劑；所述洗滌液II是 75% -80%的乙醇水溶液；所述洗脫液是是TE溶液，所述TE溶液的pH為8. 0，溶劑是水，溶質是 0-20mM 的 Tris-HCl，0-2mM 的 EDTA。上述洗滌液I和II用來洗滌DNA-磁性納米微球形成的復合體，以除去與磁珠結合的除核酸以外的污染物如蛋白質、磷脂。上述洗滌液I中，Chaotropic鹽的濃度優(yōu)選為4. 2-5. 8M，醇優(yōu)選為30-45% (體積百分含量)的乙醇，螯合劑優(yōu)選為20-80mM ；所述洗滌液II優(yōu)選75%的乙醇水溶液。
所述洗脫液中的Tris-HCl的濃度優(yōu)選10mM、EDTA優(yōu)選是ImM，所述洗脫液pH優(yōu)選為8. 0。在除去與固相載體結合的蛋白質、磷脂等污染物后，必須將與固相載體結合的DNA洗脫至水相溶液中才能應用于后續(xù)法醫(yī)DNA分析。DNA-磁性微球復合體與洗脫液接觸后， 可以使DNA與固相載體分離。洗脫液可以是低離子強度的水相溶液，也可以是無離子水或是一定PH的低離子強度的水溶液。洗脫液PH值必須能夠保證DNA穩(wěn)定性、完整性?？梢允堑蜐舛萒E(10mM Tris-HCiamM EDTA, pH8. 0)洗脫與固相載體結合的DNA。上述步驟幻洗滌可一次或多次。步驟3)中，對于DNA含量較低的樣本(如脫落細胞，腐敗微量生物樣本等)，為了增加獲得DNA的濃度，選擇用30ul洗脫液。常規(guī)樣本一般選擇50ul洗脫體積上述緩沖鹽為Tris-HCl、磷酸緩沖鹽或HEPES緩沖鹽。上述的Chaotropic鹽在水性溶液中具有高溶解度。高濃度的Chaotropic鹽能夠引起蛋白質打開折疊、破壞核酸的二級結構并使變性的蛋白質和雙鏈DNA溶解。通常認為， 這是由于Chaotropic鹽離子能夠破壞其所在溶液體系中的氫鍵網(wǎng)絡，使變性的蛋白質和變性DNA表現(xiàn)出比其正確折疊或天然構象時更高的熱動力學穩(wěn)定性，而且能夠保證讓DNA 優(yōu)先結合到磁性納米微球上。這種Chaotropic鹽可以是任何已知的Chaotropic鹽，如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍、尿素、碘化鈉、碘化鉀、氯化鋰、高氯酸鈉、三氯醋酸鹽。發(fā)明中使用的是胍鹽(如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍)。尤其是異硫氰酸胍，能夠更好的裂解細胞并抑制核酸酶的活性，是一中非常有效DNA純化試劑。Chaotropic鹽可以3 8M濃度存在于裂解結合液中。在本發(fā)明任何一種含有Chaotropic鹽的試劑中，Chaotropic鹽的濃度必須要低于其所在該試劑中的溶解度。一定Chaotropic鹽的濃度大小能夠影響DNA與磁性納米微球結合。Chaotropic鹽必須達到一定的濃度才能促使DNA與磁性微球的結合。 但是過高的鹽濃度會使蛋白質變性和DNA降解，并從溶液中沉淀出來。蛋白質和大分子的雙鏈DNA在Chaotropic鹽濃度為0. 5 2M時穩(wěn)定存在于溶液中。相反，RNA、小分子DNA 如單鏈DNA、DNA片段，在濃度為2 5M時穩(wěn)定純在于溶液體系中。上述的螯合劑是一種能夠與Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ζη2+等金屬離子相結合的復合物。螯合劑中至少有兩個的非金屬離子與游離金屬陽離子形成共價鍵并與其結合，與螯合劑結合的金屬離子將不再游離于溶液體系中。當溶液體系中有螯合劑存在時，會降低溶液中金屬離子的濃度。游離金屬離子濃度的降低使核酸酶失活，能夠有效防止DNA被核酸酶降解、起到保護DNA完整性的作用。很多可供使用的螯合劑，不僅限于EDTA、EGTA、CDTA寸。本發(fā)明所提供的方法能夠實現(xiàn)從各種類型生物樣本(血液、血斑、精液、精斑、毛發(fā)、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑、脫落細胞等接觸性檢材、腐敗陳舊檢材)煙蒂中提取、純化DNA。且能夠同時滿足常規(guī)及微量DNA的樣本的提取要求。利用本發(fā)明方法所得的DNA無需進一步純化，即可應用于STR復合擴增、DNA測序、DNA定量等下游分析操作。利用本發(fā)明的方法提取的DNA特別適合應用于PCR擴增(STR、DNA測序、實時熒光定量 PCR 等)。本發(fā)明提供的方法基于磁性微球的固相分離技術從各種不同類型生物樣本中提取純化DNA。包被有二氧化硅的磁性或超順磁性納米微球具備與核酸發(fā)生可逆結合的能力。 通過改變磁珠和DNA所處的溶液環(huán)境條件，能夠控制DNA與磁珠的結合和分離；通過改變外加磁場力，能夠控制固相載體和液相的分離。磁珠等固相載體在某些化學物質和鹽配制的結合液中能夠與DNA結合，形成磁性納米微球-DNA復合體，磁分離去除液相成分后，用洗滌液洗去磁珠上結合的除核酸以外的污染物如蛋白質、磷脂等。最后通過加入低鹽濃度的洗脫液或去離子水將結合在磁珠表面的DNA洗脫下來，達到分離純化的目的。本發(fā)明的有益效果如下整體操作簡單、快速廣泛的生物樣本適用范圍，能夠實現(xiàn)大多數(shù)生物樣本的DNA提取裂解效果好，保證細胞的充分裂解以釋放DNA純化能力強，能夠在混合有大量PCR抑制劑或污染物的樣本中得到足夠純且可完全滿足于下游PCR、DNA測序、實時熒光定量等操作的DNA提取效率高。能夠達到90%以上的提取效率，最大化避免DNA在提取操作過程的損失。將該發(fā)明提供的試劑和方法應用于已知濃度的DNA標準品的提取，經過整個提取過程，通過以下公式計算得到提取效率(洗脫得到的DNA量(ng)/加入DNA標準品(G1471， Promega 公司)總量(ng))。能夠有效提高痕量、降解等微量DNA生物樣本的STR分型成功率。靈活的試劑體系，通過擴大試劑的操作體系，可實現(xiàn)大體積樣本中所含微量DNA 樣本的富集。整個操作能夠避免離心操作，可適用用于各種DNA自動化提取操作平臺。


圖1為采用實施例1的試劑和方法提取DNA的效果驗證圖，其中圖IA是微量血液的DNA STR分型圖譜，圖IB是熒光定量PCR電泳圖譜。圖2為3 X 3_血斑(FTA卡)STR分型圖譜。圖3為棉簽上血斑Qul抗凝血)STR分型圖譜。圖4為2 μ 1液態(tài)抗凝血與PCR抑制劑等混合在無色棉布上形成血斑的STR圖譜。圖5為2 μ 1液態(tài)抗凝血滴在牛仔褲形成血斑的STR分型圖譜。圖6為1 μ 1精液在無色棉布上形成精斑的STR分型圖譜。圖7為50 μ 1唾液滴在棉簽上形成的口腔拭子的STR分型圖譜。圖8為煙蒂STR分型圖譜。圖9為自然脫落毛發(fā)STR分型圖譜。圖10為人體組織塊的DNATyperTM15STR分型圖譜。圖11為手機上的脫落細胞STR分型圖譜。圖12為毛衣上的脫落細胞STR分型圖譜。圖13為錢包上脫落細胞STR分型圖譜。圖14為杯口脫落細胞STR分型圖譜。圖15為鍵盤脫落細胞STR分型圖譜。圖16為腐敗血斑STR分型圖譜。圖17為腐敗組織STR分型圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、提取純化微量血液中的DNA以及效果驗證一、提取純化微量血液中的DNA以及STR復合擴增分析1、試劑試劑如下預處理裂解液pH為7. 4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質10mM Tris-HCl, 0. 5g/100ml的十二烷基磺酸鈉(SDS)，ImM的EDTA和50mM的NaCl水溶液，0. 5mg/ml的蛋白酶K。裂解結合液pH為6. 4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質50mM的Tris-HCl， 3M的異硫氰酸胍，(體積百分比)的Triton X-100,0. 5g/100ml的3-(3_膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPQ，IOmM的EDTA以及15% (體積百分含量)的乙醇。洗滌液I 溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質4M的鹽酸胍，25% (體積百分含量)的乙醇和IOmM的EDTA。洗滌液II 75% (體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質是IOmM的Tris-HCl， ImM 的 EDTA。磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級硅包被磁性微球(直徑是60nm)(奧潤微納新材料科技有限公司)為50mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA1)預處理在1. 5ml離心管中首先加入IOOul預處理裂解液，然后將0. Iul液態(tài)抗凝血加入預處理裂解液中，渦旋振蕩，56°C溫浴30min。充分振蕩后，通過離心去除載體(指生物細胞所粘附或附著的固體物質)，得到粗裂解液。2)核酸吸附于固相載體往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液(加入量為10 μ 1濃度為50mg/ ml的溶液)和300 μ 1的裂解結合液，形成了磁性納米微球-DNA的復合體，該復合體在粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中。3)復合體分離將離心管漩渦振蕩后，放于磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場力的作用下， 將步驟2、中的磁性納米微球-DNA的復合體從粗裂解液和裂解結合液組成的溶液體系中分尚出。4)洗滌往離心管中加入500 μ 1洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體；往離心管中加入500μ 1洗滌液II，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體，重復本操作一次。洗滌可以將結合在固相載體(磁性納米微球)上的核酸之外的物質去除。5)洗脫在洗滌結束后，用20ul槍頭吸干殘留液體，室溫晾干5-lOmin(室溫超過30°C時， 晾干5min即可；室溫低于30°C時晾干7_10分鐘，但最多不可超過IOmin)。然后往離心管中加入30 μ 1的洗脫液，65°C溫浴5-8min，磁分離，吸取DNA，4°C或_20°C保存。
3、STR復合擴增分析將實施例1提取的DNA進行STR復合擴增，復合擴增采用的是市售的商業(yè)STR復合擴增試劑盒(如美國ABI公司的Id試劑盒)。然后用3130型遺傳分析儀檢測，結果如圖 IA所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增、Pull up峰、stutter帶、 split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。二、提取純化微量血液中的DNA以及濃度檢測1、提取 DNA從不同體積(1、2、3、4和5 μ 1)的液態(tài)抗凝血中提取DNA。提取的方法與上述步驟一相同，其區(qū)別在于所用試劑的量提取1、2、3、4 μ 1液態(tài)抗凝血中的DNA的方法與上述步驟一相同，并且所用的預處理裂解液均是100 μ 1 ；磁珠懸浮液均是IOul ；裂解結合液均是300ul ；洗滌液I均是500ul ； 洗滌液II均是500ul ；洗脫液均是30ul。提取5 μ 1液態(tài)抗凝血中的DNA，所用的預處理裂解液200 μ 1 ；磁珠懸浮液20ul ； 裂解結合液600ul ；洗滌液I 500ul ；洗滌液II 500ul ；洗脫液50ul。利用實時熒光定量PCR試劑盒(QuantiflerTMHuman，ABI公司)和Qubit 熒光定量系統(tǒng)檢測所提取的DNA的濃度，結果如表1所示，該試劑盒整體提取效率高。表1還顯示采用兩種不同的定量方法(實時熒光定量PCR和染料定量)，兩種方法定量結果相當，表明DNA完整性卓越，表明DNA在提取的過程中DNA斷裂極少。表1.不同體積液態(tài)抗凝血中提取的DNA的濃度檢測結果
權利要求
1.提取純化DNA的方法，包括以下步驟1)預處理用預處理裂解液裂解生物樣品，得到粗裂解液，所述生物樣品是人體脫落細胞；其中，預處理裂解液pH為7. 4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質10mM Tris-HCl, 0. 5g/100ml的十二燒基磺酸鈉SDS，ImM的EDTA和50mM的NaCl，0. 5mg/ml的蛋白酶K ；2)核酸吸附將步驟1)得到的粗裂解液與裂解結合液以及磁珠懸浮液混合，形成含有磁性納米微球-DNA的復合體的溶液體系，收集所述溶液體系中的磁性納米微球-DNA的復合體；其中，裂解結合液pH為6. 4，溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質50mM的Tris-HCl，3M的異硫氰酸胍，(體積百分比)的Triton X-100,0. 5g/100ml的3-(3-膽胺丙基)_ 二甲氨基-1-丙磺酸，IOmM的EDTA以及15% (體積百分含量)的乙醇；磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級硅包被磁性微球為50mg，其余為水，納米級硅包被磁性微球的直徑是60nm ；3)洗滌將步驟2、得到的磁性納米微球-DNA的復合體依次用洗滌液I、洗滌液II洗滌，然后用洗脫液溶出DNA，得到純化的DNA ；其中，洗滌液I 溶劑是水，溶質是如下終濃度的物質4M的鹽酸胍，25% (體積百分含量)的乙醇和IOmM的EDTA ；洗滌液II 75% (體積百分含量)乙醇水溶液；洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8. 0，溶劑是水，溶質是IOmM的Tris-HCl，ImM 的 EDTA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取純化人體脫落細胞DNA的方法。該方法包括以下步驟1)預處理將人體脫落細胞與預處理裂解液接觸，去除生物細胞所粘附的固體物質，得到粗裂解液；2)核酸吸附將步驟1)得到的粗裂解液與裂解結合液以及磁珠懸浮液混合，形成含有磁性納米微球-DNA的復合體的溶液體系，收集所述溶液體系中的磁性納米微球-DNA的復合體；3)洗滌將步驟2)得到的磁性納米微球-DNA的復合體依次用洗滌液I、洗滌液II洗滌，然后用洗脫液溶出DNA。本發(fā)明提供的方法提取DNA的效率可達90％，提取的DNA可應用于STR復合擴增、DNA測序、DNA定量等下游分析操作。
文檔編號C12N15/10GK102181434SQ20111010518
公開日2011年9月14日 申請日期2009年8月5日 優(yōu)先權日2009年8月5日
發(fā)明者葉健, 周云彪, 趙興春 申請人:公安部物證鑒定中心