專利名稱：一種基于微納米纖維的細(xì)胞捕獲方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于微納米纖維的細(xì)胞捕獲方法，屬于納米技術(shù)和細(xì)胞化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，從組織和體液(血液、淋巴液、唾液、尿液)中對某一種或幾種特定的細(xì)胞進(jìn)行篩選和捕獲，越來越吸引著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科研工作者的重視。這些來源于組織液和體液的細(xì)胞，因其數(shù)量上的稀有性與生物學(xué)上的特異性， 正為稀有細(xì)胞生物學(xué)及其基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究提供了一扇新的認(rèn)識窗口。然而，對于組織液和體液內(nèi)的某些特定細(xì)胞，因其稀有性和低密度，對這些細(xì)胞的捕獲與探測都面臨著極大的挑戰(zhàn)。過去十年間，發(fā)展起來各種基于不同運(yùn)行機(jī)制的技術(shù)用于細(xì)胞的捕獲和計(jì)數(shù)，包括免疫磁性分離、流式細(xì)胞儀、微流控芯片、細(xì)胞過濾器等技術(shù)。但這些技術(shù)仍然面臨著如何提高細(xì)胞捕獲效率、降低檢測成本、避免細(xì)胞成像失焦、捕獲非特異性抗原表達(dá)的細(xì)胞以及保證捕獲細(xì)胞的活性以實(shí)現(xiàn)后續(xù)的分子水平的分析等各種挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于微納米纖維的細(xì)胞捕獲方法。這種方法在細(xì)胞捕獲的應(yīng)用中，具有捕獲效率高、操作簡便、成本低廉、 高質(zhì)量的細(xì)胞成像、保證所捕獲細(xì)胞的活性良好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的所采用的技術(shù)方案是
對微納米纖維表面進(jìn)行化學(xué)修飾，嫁接可識別待捕捉細(xì)胞表面特定抗原的抗體；然后， 通過細(xì)胞表面的抗原和微納米纖維襯底上嫁接的相應(yīng)抗體之間的免疫反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的捕獲。所述微納米纖維在同一平面上以便于后續(xù)細(xì)胞成像操作和保證成像質(zhì)量。所述微納米纖維可以采用電紡的方法來制備，具體包括以下步驟
a.電紡前驅(qū)液的配制稱量鈦酸丁酯、乙酰丙酮、乙二醇單甲醚和異丙醇，配成混合溶液，攪拌至澄清，再加入聚乙烯吡咯烷酮，常溫?cái)嚢?-3 h至高分子充分溶解，備用；
b.在電紡裝置上進(jìn)行微納米級電紡纖維襯底的制備選擇潔凈硅片或載玻片作為襯底的面板，調(diào)節(jié)金屬噴管的管徑、噴管與襯底面板間的距離、施加的直流電壓以及電紡時(shí)間等參數(shù)以獲得直徑范圍在100-2000 nm間，且微納米纖維網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸在100-2000 nm 間的微納米級纖維襯底；
c.將硅片或載玻片上收集的微納米級纖維材料，放入馬弗爐煅燒，燒除電紡纖維中的高分子支架材料聚乙烯吡咯烷酮。所述微納米纖維的細(xì)胞捕獲過程中，將經(jīng)抗體修飾的微納米纖維安放到多孔培養(yǎng)板的孔室中，將細(xì)胞懸浮液加入多孔培養(yǎng)板的孔室中，然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱，孵育 10-60分鐘。
所述微納米纖維的直徑以及孔隙尺寸都在100-2000 nm之間。微納米纖維與普通的平滑襯底相比具有極大的比表面積(比表面積有數(shù)量級的提高)，且微納米纖維襯底(其直徑以及孔隙尺寸均在100-2000 nm之間)與細(xì)胞膜表面的納米結(jié)構(gòu)(如微絨毛和絲狀偽足，其尺寸在80-300nm范圍內(nèi))在尺寸上較為匹配，這使得它們之間的局部拓?fù)浣换シ磻?yīng)得以增強(qiáng)。與此同時(shí)，根據(jù)待捕獲細(xì)胞的特征，選擇細(xì)胞膜上具有較高水平表達(dá)的細(xì)胞粘附因子作為識別和捕獲標(biāo)志。這些粘附分子即為抗原，如上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)和E-選擇素(E-selection)等。然后把對應(yīng)的抗體嫁接到微納米纖維襯底上，以達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞捕獲性能的目的(與平滑襯底相比，微納米纖維襯底捕獲性能有15-20倍的提高)。本發(fā)明具有如下的有益效果
(1)本發(fā)明結(jié)合微納米技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)識別技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高效捕獲。與平整襯底材料相比，捕獲細(xì)胞的性能有15-20倍的提高。(2)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高質(zhì)量的細(xì)胞成像，為細(xì)胞的定量檢測和分析提供了有力的途
徑。
(3)本發(fā)明能確保捕獲的細(xì)胞的活性，使后續(xù)分子層次的分析和臨床上應(yīng)用成為可能。(4)本發(fā)明利用電紡方法來制備微納米級纖維襯底，其工藝簡單，質(zhì)量控制簡便。(5)本發(fā)明與流式細(xì)胞分離和磁珠免疫分離法相比，操作簡便，且檢測成本低廉。


圖1是微納米級纖維在燒結(jié)前的光學(xué)顯微照片。圖2是基于微納米級電紡纖維襯底的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)流程圖。圖中，1. 二氧化硅(SiO2)襯底，2. 二氧化鈦(TiO2)微納米纖維，3.循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)，4.經(jīng)anti-EpCAM包被的平整二氧化硅和納米纖維二氧化鈦纖維結(jié)構(gòu)交接處的顯微照片(煅燒前)，5.細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)后平整二氧化硅和納米纖維二氧化鈦纖維結(jié)構(gòu)交接處的明場顯微照片，6.細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)后平整二氧化硅和納米纖維二氧化鈦纖維結(jié)構(gòu)交接處的熒光顯微照片。圖3是微納米纖維襯底和平整襯底所捕獲的細(xì)胞密度的比例，三種情況分別是 (1)未經(jīng)任何修飾；(2)只經(jīng)過聯(lián)酶親和素(SA)修飾；(3)經(jīng)過聯(lián)酶親和素(SA)和抗體 (anti-EpCAM)修飾。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。為了確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，需要向各個(gè)培養(yǎng)孔室中注入相同體積的細(xì)胞懸浮液，由于等體積和等濃度條件，使得培養(yǎng)孔室中每個(gè)樣品上的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 的初始數(shù)目近似相等。為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需要進(jìn)行三組平行檢測，最后對三組實(shí)驗(yàn)中所捕獲細(xì)胞的數(shù)目取平均值。A.微納米級電紡纖維襯底的制備 a.電紡前驅(qū)液的配制按照以下配方，稱量并配制鈦酸丁酯(titanium (IV) /？-butoxide, 0. 1 g mL—1)，乙酰丙酮(acetic acid，0. 01 g mL-1)，乙二醇單甲醚(2-methoxyethanol，0. 66 g mL—1)和異丙醇(ΙΡΑ，0. 16 g mL—1)的混合溶液，攪拌至澄清，若出現(xiàn)微顆粒，用濾器(0 = 0. 45 μ m)過濾處理；再加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP，0.035 g mL—1)，常溫?cái)嚢?-3 h至高分子充分溶解，備用。b.在電紡裝置上進(jìn)行微納米級電紡纖維襯底的制備
選擇潔凈硅片或者載玻片作為襯底的面板。通過調(diào)節(jié)金屬噴管的管徑、噴管與接受面板間的距離、施加的直流電壓以及靜電紡時(shí)間等參數(shù)來獲得直徑和孔隙小于2 μ m的微納米纖維襯底。如圖1所示，微納米級纖維的的直徑和微納米級纖維網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸都在 100-2000 nm 之間。c.將收集在硅片或載玻片上的靜電紡樣品放入馬弗爐，在450°C下煅燒30 min, 然后自然退火。d.待溫度降至室溫后，取出待用。B.微納米級電紡纖維襯底的表面修飾
a.對微納米級電紡纖維襯底進(jìn)行等離子(PLASMA)處理3min ；
b.將經(jīng)步驟a處理后的樣品浸入含4%體積分?jǐn)?shù)的3-巰基丙基三甲氧硅烷 (MPTMS)的無水乙醇溶液中，反應(yīng)l_2h后用無水乙醇漂洗3次。c.將經(jīng)步驟b處理后的樣品浸入10 μ mol mL—1的4_馬來酰亞胺基丁酸_N_琥珀酰亞胺脂(GMBS)的二甲基亞砜(DMSO)溶液中，然后用無水乙醇稀釋10倍，反應(yīng)30 -60min 后用無水乙醇漂洗3次。d.將50 μ g mL-iS K(Streptavidin)溶液滴到經(jīng)步驟c處理后的樣品表面上， 孵育30 -60min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。e.將10 μ g mL—1的anti-EpCAM溶液滴到經(jīng)步驟d處理后的樣品表面上，孵育30 -60min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，然后浸入新鮮PBS溶液中，待用。C.基于微納米級電紡纖維襯底的結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)捕獲實(shí)驗(yàn)(如圖2)
a.準(zhǔn)備ImL細(xì)胞密度為IO5 cells mL—1 HCT116細(xì)胞懸浮液，然后加入二乙酸熒光素(FDA，終止?jié)舛?00 μ g mL-1)，對CTCs進(jìn)行活體染色10_15min。b.將經(jīng)過anti-EpCAM修飾的上述樣品放入多孔培養(yǎng)板的腔室中，然后向培養(yǎng)孔室注入ImL細(xì)胞密度為IO5 cells mL—1 HCT16細(xì)胞懸浮液。 c.將多孔培養(yǎng)板放置在二氧化碳培養(yǎng)箱，在37 5% (v/v) CO2條件下孵育1 h。d.用磷酸鹽緩沖液(PBS)對附著有HCT116細(xì)胞的襯底輕柔地沖洗5次，然后用氮?dú)饩徛蹈?，待用。D.對微納米級電紡纖維襯底所捕獲的結(jié)腸癌細(xì)胞的觀測和計(jì)數(shù)
a.將捕獲有HCT116細(xì)胞的樣品，放置在倒置熒光顯微鏡下，進(jìn)行明場與暗場的光學(xué)觀測，如圖2所示。b.利用C⑶數(shù)字?jǐn)z像裝置和IPP成像軟件，對上述樣品表面所捕獲的細(xì)胞進(jìn)行圖像拍攝和數(shù)據(jù)處理。如圖3所示，縱坐標(biāo)表示維納米級纖維襯底上捕獲的細(xì)胞密度與平整硅襯底上捕獲的細(xì)胞密度之比，第一個(gè)柱圖表示未經(jīng)任何修飾的兩種襯底所捕獲細(xì)胞的密度之比；第二個(gè)柱圖表示只經(jīng)過聯(lián)酶親和素(SA)修飾后兩種襯底所捕獲細(xì)胞的密度之比；第三個(gè)柱圖表示經(jīng)過聯(lián)酶親和素(SA)和抗體(anti-EpCAM)修飾后兩種襯底所捕獲細(xì)胞的密度之比。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，經(jīng)過修飾SA和anti-EpCAM后，維納米級電紡纖維襯底跟平整硅襯底相比，其捕獲細(xì)胞的性 能有15-20倍的提高。
權(quán)利要求
1.一種基于微納米纖維的細(xì)胞捕獲方法，其特征在于，對微納米纖維表面進(jìn)行化學(xué)修飾，嫁接待捕捉細(xì)胞的抗體；然后，通過細(xì)胞表面的抗原和微納米纖維襯底上嫁接的相應(yīng)抗體之間的免疫反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的捕獲。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞捕獲方法，其特征在于，所述微納米纖維的的直徑以及孔隙尺寸都在100-2000 nm之間。
3.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞捕獲方法，其特征在于，所述微納米纖維在同一平面上。
4.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞捕獲方法，其特征在于，所述微納米纖維采用電紡的方法來制備，具體包括以下步驟a.電紡前驅(qū)液的配制稱量鈦酸丁酯、乙酰丙酮、乙二醇單甲醚和異丙醇，配成混合溶液，攪拌至澄清，再加入聚乙烯吡咯烷酮，常溫?cái)嚢?-3 h至高分子充分溶解，備用；b.在電紡裝置上進(jìn)行微納米級電紡纖維襯底的制備選擇潔凈硅片或載玻片作為襯底的面板，調(diào)節(jié)金屬噴管的管徑、噴管與襯底面板間的距離、施加的直流電壓以及電紡時(shí)間等參數(shù)以獲得直徑范圍在100-2000 nm間，且微納米纖維網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸在100-2000 nm 間的微納米級纖維襯底；c.將硅片或載玻片上收集的微納米級纖維材料，放入馬弗爐煅燒，燒除電紡纖維中的高分子支架材料聚乙烯吡咯烷酮。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于微納米纖維的細(xì)胞捕獲方法。對微納米纖維表面進(jìn)行化學(xué)修飾，嫁接可識別待捕捉細(xì)胞表面特定抗原的抗體；然后，通過細(xì)胞表面的抗原和微納米纖維襯底上嫁接的相應(yīng)抗體之間的免疫反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的捕獲。本發(fā)明方法具有捕獲效率高、操作簡便、成本低廉、高質(zhì)量的細(xì)胞成像、所捕獲細(xì)胞活性良好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N5/07GK102226168SQ20111010452
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者臺啟東, 張南剛, 趙興中, 鄧宇亮 申請人:武漢大學(xué)