專利名稱：一種提取純化唾液dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提取純化DNA的方法。
背景技術(shù)：
DNA分離純化是分子生物學(xué)實驗中非常重要的操作，核酸的質(zhì)量直接關(guān)系到后續(xù)操作能否順利進(jìn)行。生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，強化了對從各種生物檢材中獲得核酸的復(fù)雜方法的需求。例如，脫氧核糖核酸提供了廣泛的關(guān)于遺傳起源和遺傳多態(tài)性信息。 這些信息可用于法醫(yī)遺傳學(xué)鑒定實踐。目前所存在的各種核酸純化方法皆可分成以下兩大類液相純化和固相純化。在液相純化中，核酸維持為液體狀態(tài)，而雜質(zhì)通過沉淀、離心被除去或者核酸被沉淀出來，而雜質(zhì)被保留；在固相純化中，核酸被結(jié)合到固相載體上，而雜質(zhì)被選擇性洗脫。例如，采用液相純化來分離的DNA保留在液相中，而雜質(zhì)被通過諸如沉淀和/或離心之類的方法除去。在固相純化中DNA結(jié)合到固相載體上，而雜質(zhì)如RNA、蛋白質(zhì)和磷脂等被選擇性洗脫。在DNA 純化中，如果起始材料包括細(xì)胞，液相方法和固相方法都需要細(xì)胞或病毒共破裂，或裂解步驟。破裂或裂解步驟產(chǎn)生與污染物如RNA、脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)等混合的DNA。這種混合物還含有降解DNA的必須被除去和/或滅活以不感染產(chǎn)生基本上未降解的DNA的DNA酶。 兩個純化大類以前都利用常規(guī)的方法，需要繁瑣的步驟，且通常用到有害的試劑，現(xiàn)在也出現(xiàn)了更快速的提取方法，如Chelex-100法，僅需要較少的步驟，且通常較少的有害試劑。Chelex-100法一種快速液相DNA純化方法，Chelex-100是一種化學(xué)整合樹脂， 由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成。含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，整合多價金屬離子，尤其是選擇性整合二價離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強的結(jié)合力.能結(jié)合許多可能影響一步分析的其他外源物質(zhì)。通過離心除去Chelex-100顆粒，使這些與Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離，防止結(jié)合到Chelex中的抑制劑或雜質(zhì)帶到PCR 反應(yīng)中，影響下一步的DNA分析，并通過結(jié)合金屬離子，防止DNA降解。利用螯合劑去除生物樣本中金屬雜質(zhì)而達(dá)到純化的目的。該法首先用去離子水洗滌生物樣本，加入螯合樹脂的懸浮液56°C孵育一定時間，100°C孵育8分鐘，然后通過離心去除雜質(zhì)。該方法簡單、快速 (僅涉及到兩種試劑的使用)。但該法提取得到的DNA純度不夠，不能滿足微量DNA生物樣本DNA提取純化的要求。固相提取方法近年來發(fā)展迅速，在核酸提取領(lǐng)域占有非常重要的地位。這類方法一般需要四個主要步驟裂解細(xì)胞使細(xì)胞膜、核膜DNA破裂以釋放DNA ；釋放的DNA與固相載體結(jié)合；雜質(zhì)的洗滌；洗脫而得到純化的DNA。對于固相DNA純化，已使用了多種固相載體，如二氧化硅微球、薄膜過濾器、金屬氧化物、膠乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。當(dāng)核酸存在于在高濃度離液鹽以及低的PH溶液中時，能夠吸附到硅類介質(zhì)表面，并在低鹽高pH溶液中洗脫下來，從而達(dá)到提取純化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉從瓊脂糖凝膠中提取到DNA， 而Marko使用玻璃粉成功提純質(zhì)粒DNA。Boom等對該方法加以改進(jìn)，用二氧化硅和硅藻土為固相吸附劑，用來提取純化人血清或尿液中的微量病原體基因組DNA。該方法需要六步離心、五種試劑從全血種純化DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提取純化DNA的方法。本發(fā)明提供的提取純化DNA的方法，包括以下步驟1)預(yù)處理將生物樣品與預(yù)處理裂解液接觸，去除生物細(xì)胞所粘附的固體物質(zhì)， 得到粗裂解液；2)核酸吸附將步驟1)得到的粗裂解液與裂解結(jié)合液以及磁珠懸浮液混合，DNA 將與磁珠結(jié)合，形成了含有磁性納米微球-DNA的復(fù)合體的溶液體系，收集所述溶液體系中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體；3)洗滌將步驟2)得到的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體依次用洗滌液I、洗滌液II 洗滌，然后用洗脫液溶出DNA，得到純化的DNA。上述步驟1)中，所述生物樣品是血液、血斑、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、 汗液斑或脫落細(xì)胞時，所述預(yù)處理裂解液的PH為7. 4-8. 5，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)IO-IOOmM緩沖鹽，0. 5-5g/100ml的表面活性劑，I-IOOmM的螯合劑和50_150mM的可溶性鹽，0. 2-4mg/ml的蛋白酶K。精斑和毛發(fā)中DNA的提取，需在預(yù)處理裂解液中加入DTT (二硫蘇糖醇)，上述步驟 1)中，所述生物樣品是精液、精斑或毛發(fā)時，所述預(yù)處理裂解液的PH為7. 4-8. 5，溶劑是水， 溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)10-100mM緩沖鹽，0. 5-5g/100ml的表面活性劑，I-IOOmM的螯合劑，50-150mM的可溶性鹽，0. 2-4mg/ml的蛋白酶K和0. 025-0. 05M的二硫蘇糖醇。上述預(yù)處理裂解液中，緩沖鹽的濃度優(yōu)選為20_80mM，表面活性劑的濃度優(yōu)選為 0. 5-4g/100ml，螯合劑的濃度優(yōu)選為20_80mM，可溶性鹽的濃度優(yōu)選為50_130mM，更優(yōu)選為 80-100mM ；蛋白酶K的濃度優(yōu)選為0. 2_2mg/ml，更優(yōu)選濃度為0. 2-lmg/ml。所述預(yù)處理裂解液中的表面活性劑為陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑，優(yōu)選是陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為十二烷基磺酸鈉或十二烷基肌氨酸鈉。所述預(yù)處理裂解液還包括一種可溶性鹽溶液，DNA從細(xì)胞核中釋放并與組蛋白分離后，需要提高DNA在溶液中的溶解度。DNA在一定濃度氯化鈉溶液中的溶解度很高，Na+與帶負(fù)電的DNA結(jié)合成DNA鈉鹽。這使DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)并維持DNA在溶液中的穩(wěn)定性。所以在某些實施例中，可以使用NaCl等可溶性鹽。蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。此酶經(jīng)純化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛。各種生物樣品，如血液、血斑、精液、精斑、毛發(fā)、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑或脫落細(xì)胞等首先要經(jīng)過預(yù)處理裂解液浸泡，并在50-65°C的溫度下孵育 0. 5h-4h時間后，方可進(jìn)行后續(xù)提取操作。孵育的溫度可優(yōu)選為56°C。
通過預(yù)處理裂解液對生物樣本的預(yù)處理，一是能夠使載體上黏附的細(xì)胞(如血白細(xì)胞、精子細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)和DNA與載體分離或與組織脫離，游離在預(yù)處理裂解液中；二是裂解細(xì)胞，使DNA和蛋白質(zhì)、磷脂等污染物釋放至消化液中，通過離心等方法去除載體后即形成粗裂解液并完成樣本預(yù)處理。所述步驟1)預(yù)處理中，本發(fā)明中的生物樣品如血斑、唾液斑等一般取3*3mm為宜， 這類樣本比較小，預(yù)處理裂解液可在100-200ul范圍內(nèi)變化；對于體積較大樣本，預(yù)處理裂解液的量一般以完全覆蓋住生物樣本為宜，但最多不能超過300ul。預(yù)處理后形成的粗裂解液中包含DNA及蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片、磷脂等細(xì)胞污染物。為了更充分的裂解細(xì)胞，最大程度的使DNA從細(xì)胞中釋放出來，并使釋放出來的DNA與磁性微球結(jié)合以達(dá)到分離純化的目的，可以使用裂解結(jié)合液。所述步驟2)核酸吸附中，每ml磁珠懸浮液的組分如下直徑為50-1200nm的納米級硅包被磁性微球50-100mg，其余為水。每ml磁珠懸浮液中的納米級硅包被磁性微球優(yōu)選是 50mgo所述裂解結(jié)合液的pH = 6. 4-7. 4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20_150mM 的緩沖鹽，3-8M的Chaotropic鹽，1-10% (體積百分比)的表面活性劑，0. 5_4g/100ml的兼性離子去污劑，IO-IOOmM的螯合劑以及15-30% (體積百分含量)的醇。上述裂解結(jié)合液中，離液鹽(Chaotropic鹽)優(yōu)選為4-6M，緩沖鹽優(yōu)選為 50-120mM的Tris-HCl，螯合劑優(yōu)選為20_80mM，表面活性劑的濃度優(yōu)選為(體積百分比)，兼性離子去污劑的濃度優(yōu)選為l_3g/100ml，醇優(yōu)選為20-28% (體積百分含量)；所述裂解結(jié)合液中的表面活性劑優(yōu)選用非離子表面活性劑，所述非離子表面活性劑為Triton X-100、Tween 20、Tween 21、Tween. 40、Tween 60、Tween80、Tween 85、NP-40、Bri j 30 或 Span 20 ；所述兼性離子去污劑是3-(3-膽胺丙基)_ 二甲氨基丙磺酸；所述醇是乙醇、 異丙醇或聚乙二醇。所述步驟2)核酸吸附中，粗裂解液與裂解結(jié)合液以及磁珠懸浮液混合可以先將粗裂解液與裂解結(jié)合液混合，然后再往粗裂解液和裂解結(jié)合液中加入磁珠懸浮液。加入磁珠懸浮液混合的條件是室溫(20-3(TC )混合5-8分鐘。上述裂解結(jié)合液與粗裂解液的比例關(guān)系是(2 3) 1。上述磁珠懸浮液與裂解結(jié)合液、粗裂解液的比例關(guān)系是(10-30) μ 1 (200-900) μ 1 (100-300) μ 1。上述步驟3)洗滌中，所述洗滌液I的溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4-6Μ 的Chaotropic鹽，25-50% (體積百分含量)的醇和IO-IOOmM的螯合劑；所述洗滌液II是 75% -80%的乙醇水溶液；所述洗脫液是是TE溶液，所述TE溶液的pH為8. 0，溶劑是水，溶質(zhì)是 0-20mM 的 Tris-HCl，0-2mM 的 EDTA。上述洗滌液I和II用來洗滌DNA-磁性納米微球形成的復(fù)合體，以除去與磁珠結(jié)合的除核酸以外的污染物如蛋白質(zhì)、磷脂。上述洗滌液I中，Chaotropic鹽的濃度優(yōu)選為4. 2-5. 8M，醇優(yōu)選為30-45% (體積百分含量)的乙醇，螯合劑優(yōu)選為20-80mM ；所述洗滌液II優(yōu)選75%的乙醇水溶液。
所述洗脫液中的Tris-HCl的濃度優(yōu)選10mM、EDTA優(yōu)選是ImM，所述洗脫液pH優(yōu)選為8. 0。在除去與固相載體結(jié)合的蛋白質(zhì)、磷脂等污染物后，必須將與固相載體結(jié)合的DNA洗脫至水相溶液中才能應(yīng)用于后續(xù)法醫(yī)DNA分析。DNA-磁性微球復(fù)合體與洗脫液接觸后， 可以使DNA與固相載體分離。洗脫液可以是低離子強度的水相溶液，也可以是無離子水或是一定PH的低離子強度的水溶液。洗脫液PH值必須能夠保證DNA穩(wěn)定性、完整性。可以是低濃度TE(10mM Tris-HCl,lmMEDTA, pH8. 0)洗脫與固相載體結(jié)合的DNA。上述步驟幻洗滌可一次或多次。步驟3)中，對于DNA含量較低的樣本(如脫落細(xì)胞，腐敗微量生物樣本等)，為了增加獲得DNA的濃度，選擇用30ul洗脫液。常規(guī)樣本一般選擇50ul洗脫體積上述緩沖鹽為Tris-HCl、磷酸緩沖鹽或HEPES緩沖鹽。上述的Chaotropic鹽在水性溶液中具有高溶解度。高濃度的Chaotropic鹽能夠引起蛋白質(zhì)打開折疊、破壞核酸的二級結(jié)構(gòu)并使變性的蛋白質(zhì)和雙鏈DNA溶解。通常認(rèn)為， 這是由于Chaotropic鹽離子能夠破壞其所在溶液體系中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使變性的蛋白質(zhì)和變性DNA表現(xiàn)出比其正確折疊或天然構(gòu)象時更高的熱動力學(xué)穩(wěn)定性，而且能夠保證讓DNA 優(yōu)先結(jié)合到磁性納米微球上。這種Chaotropic鹽可以是任何已知的Chaotropic鹽，如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍、尿素、碘化鈉、碘化鉀、氯化鋰、高氯酸鈉、三氯醋酸鹽。發(fā)明中使用的是胍鹽(如異硫氰酸胍、硫氰酸胍、鹽酸胍)。尤其是異硫氰酸胍，能夠更好的裂解細(xì)胞并抑制核酸酶的活性，是一中非常有效DNA純化試劑。Chaotropic鹽可以3 8M濃度存在于裂解結(jié)合液中。在本發(fā)明任何一種含有Chaotropic鹽的試劑中，Chaotropic鹽的濃度必須要低于其所在該試劑中的溶解度。一定Chaotropic鹽的濃度大小能夠影響DNA與磁性納米微球結(jié)合。Chaotropic鹽必須達(dá)到一定的濃度才能促使DNA與磁性微球的結(jié)合。 但是過高的鹽濃度會使蛋白質(zhì)變性和DNA降解，并從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)和大分子的雙鏈DNA在Chaotropic鹽濃度為0. 5 2M時穩(wěn)定存在于溶液中。相反，RNA、小分子DNA 如單鏈DNA、DNA片段，在濃度為2 5M時穩(wěn)定純在于溶液體系中。上述的螯合劑是一種能夠與Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ζη2+等金屬離子相結(jié)合的復(fù)合物。螯合劑中至少有兩個的非金屬離子與游離金屬陽離子形成共價鍵并與其結(jié)合，與螯合劑結(jié)合的金屬離子將不再游離于溶液體系中。當(dāng)溶液體系中有螯合劑存在時，會降低溶液中金屬離子的濃度。游離金屬離子濃度的降低使核酸酶失活，能夠有效防止DNA被核酸酶降解、起到保護(hù)DNA完整性的作用。很多可供使用的螯合劑，不僅限于EDTA、EGTA、CDTA寸。本發(fā)明所提供的方法能夠?qū)崿F(xiàn)從各種類型生物樣本(血液、血斑、精液、精斑、毛發(fā)、組織、陰道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑、脫落細(xì)胞等接觸性檢材、腐敗陳舊檢材)煙蒂中提取、純化DNA。且能夠同時滿足常規(guī)及微量DNA的樣本的提取要求。利用本發(fā)明方法所得的DNA無需進(jìn)一步純化，即可應(yīng)用于STR復(fù)合擴(kuò)增、DNA測序、DNA定量等下游分析操作。利用本發(fā)明的方法提取的DNA特別適合應(yīng)用于PCR擴(kuò)增(STR、DNA測序、實時熒光定量 PCR 等)。本發(fā)明提供的方法基于磁性微球的固相分離技術(shù)從各種不同類型生物樣本中提取純化DNA。包被有二氧化硅的磁性或超順磁性納米微球具備與核酸發(fā)生可逆結(jié)合的能力。 通過改變磁珠和DNA所處的溶液環(huán)境條件，能夠控制DNA與磁珠的結(jié)合和分離；通過改變外加磁場力，能夠控制固相載體和液相的分離。磁珠等固相載體在某些化學(xué)物質(zhì)和鹽配制的結(jié)合液中能夠與DNA結(jié)合，形成磁性納米微球-DNA復(fù)合體，磁分離去除液相成分后，用洗滌液洗去磁珠上結(jié)合的除核酸以外的污染物如蛋白質(zhì)、磷脂等。最后通過加入低鹽濃度的洗脫液或去離子水將結(jié)合在磁珠表面的DNA洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。本發(fā)明的有益效果如下整體操作簡單、快速廣泛的生物樣本適用范圍，能夠?qū)崿F(xiàn)大多數(shù)生物樣本的DNA提取裂解效果好，保證細(xì)胞的充分裂解以釋放DNA純化能力強，能夠在混合有大量PCR抑制劑或污染物的樣本中得到足夠純且可完全滿足于下游PCR、DNA測序、實時熒光定量等操作的DNA提取效率高。能夠達(dá)到90%以上的提取效率，最大化避免DNA在提取操作過程的損失。將該發(fā)明提供的試劑和方法應(yīng)用于已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品的提取，經(jīng)過整個提取過程，通過以下公式計算得到提取效率(洗脫得到的DNA量(ng)/加入DNA標(biāo)準(zhǔn)品(G1471， Promega 公司)總量(ng))。能夠有效提高痕量、降解等微量DNA生物樣本的STR分型成功率。靈活的試劑體系，通過擴(kuò)大試劑的操作體系，可實現(xiàn)大體積樣本中所含微量DNA 樣本的富集。整個操作能夠避免離心操作，可適用用于各種DNA自動化提取操作平臺。


圖1為采用實施例1的試劑和方法提取DNA的效果驗證圖，其中圖IA是微量血液的DNA STR分型圖譜，圖IB是熒光定量PCR電泳圖譜。圖2為3 X 3_血斑(FTA卡)STR分型圖譜。圖3為棉簽上血斑Qul抗凝血)STR分型圖譜。圖4為2 μ 1液態(tài)抗凝血與PCR抑制劑等混合在無色棉布上形成血斑的STR圖譜。圖5為2 μ 1液態(tài)抗凝血滴在牛仔褲形成血斑的STR分型圖譜。圖6為1 μ 1精液在無色棉布上形成精斑的STR分型圖譜。圖7為50 μ 1唾液滴在棉簽上形成的口腔拭子的STR分型圖譜。圖8為煙蒂STR分型圖譜。圖9為自然脫落毛發(fā)STR分型圖譜。圖10為人體組織塊的DNATyperTM15STR分型圖譜。圖11為手機上的脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖12為毛衣上的脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖13為錢包上脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖14為杯口脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖15為鍵盤脫落細(xì)胞STR分型圖譜。圖16為腐敗血斑STR分型圖譜。圖17為腐敗組織STR分型圖譜。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
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下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、提取純化微量血液中的DNA以及效果驗證一、提取純化微量血液中的DNA以及STR復(fù)合擴(kuò)增分析1、試劑試劑如下預(yù)處理裂解液pH為7. 4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)IOmMTris-HCl， 0. 5g/100ml的十二烷基磺酸鈉(SDS)，ImM的EDTA和50mM的NaCl水溶液，0. 5mg/ml的蛋白酶K。裂解結(jié)合液pH為6. 4，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50mM的Tris-HCl， 3M的異硫氰酸胍，(體積百分比)的Triton X-100,0. 5g/100ml的3-(3_膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPQ，IOmM的EDTA以及15% (體積百分含量)的乙醇。洗滌液I 溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4M的鹽酸胍，25% (體積百分含量)的乙醇和IOmM的EDTA。洗滌液II 75% (體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8.0，溶劑是水，溶質(zhì)是IOmM的Tris-HCl， ImM 的 EDTA。磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級硅包被磁性微球(直徑是60nm)(奧潤微納新材料科技有限公司)為50mg，其余為水。2、用步驟1的試劑提取純化DNA1)預(yù)處理在1. 5ml離心管中首先加入IOOul預(yù)處理裂解液，然后將0. Iul液態(tài)抗凝血加入預(yù)處理裂解液中，渦旋振蕩，56°C溫浴30min。充分振蕩后，通過離心去除載體(指生物細(xì)胞所粘附或附著的固體物質(zhì))，得到粗裂解液。2)核酸吸附于固相載體往步驟1得到的粗裂解液中分別加入磁珠懸浮液(加入量為10 μ 1濃度為50mg/ ml的溶液)和300 μ 1的裂解結(jié)合液，形成了磁性納米微球-DNA的復(fù)合體，該復(fù)合體在粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中。3)復(fù)合體分離將離心管漩渦振蕩后，放于磁架上，吸棄液體，這一步是在外界磁場力的作用下， 將步驟2、中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體從粗裂解液和裂解結(jié)合液組成的溶液體系中分尚出。4)洗滌往離心管中加入500 μ 1洗滌液I，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體；往離心管中加入500μ 1洗滌液II，漩渦振蕩洗滌后吸棄液體，重復(fù)本操作一次。洗滌可以將結(jié)合在固相載體(磁性納米微球)上的核酸之外的物質(zhì)去除。5)洗脫在洗滌結(jié)束后，用20ul槍頭吸干殘留液體，室溫晾干5-lOmin(室溫超過30°C時， 晾干5min即可；室溫低于30°C時晾干7_10分鐘，但最多不可超過IOmin)。然后往離心管中加入30 μ 1的洗脫液，65°C溫浴5-8min，磁分離，吸取DNA，4°C或_20°C保存。
3、STR復(fù)合擴(kuò)增分析將實施例1提取的DNA進(jìn)行STR復(fù)合擴(kuò)增，復(fù)合擴(kuò)增采用的是市售的商業(yè)STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒(如美國ABI公司的Id試劑盒)。然后用3130型遺傳分析儀檢測，結(jié)果如圖IA所示，STR位點完整，分型準(zhǔn)確，無等位基因丟失、不平衡擴(kuò)增、Pullup峰、stutter帶、 split峰等現(xiàn)象出現(xiàn)，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。二、提取純化微量血液中的DNA以及濃度檢測1、提取 DNA從不同體積(1、2、3、4和5 μ 1)的液態(tài)抗凝血中提取DNA。提取的方法與上述步驟一相同，其區(qū)別在于所用試劑的量提取1、2、3、4 μ 1液態(tài)抗凝血中的DNA的方法與上述步驟一相同，并且所用的預(yù)處理裂解液均是100 μ 1 ；磁珠懸浮液均是IOul ；裂解結(jié)合液均是300ul ；洗滌液I均是500ul ； 洗滌液II均是500ul ；洗脫液均是30ul。提取5 μ 1液態(tài)抗凝血中的DNA，所用的預(yù)處理裂解液200 μ 1 ；磁珠懸浮液20ul ； 裂解結(jié)合液600ul ；洗滌液I 500ul ；洗滌液II500ul ；洗脫液50ul。利用實時熒光定量PCR試劑盒(Quantifier Human, ABI公司)和Qubit 熒光定量系統(tǒng)檢測所提取的DNA的濃度，結(jié)果如表1所示，該試劑盒整體提取效率高。表1還顯示采用兩種不同的定量方法(實時熒光定量PCR和染料定量)，兩種方法定量結(jié)果相當(dāng)，表明DNA完整性卓越，表明DNA在提取的過程中DNA斷裂極少。表1.不同體積液態(tài)抗凝血中提取的DNA的濃度檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.提取純化DNA的方法，包括以下步驟1)預(yù)處理用預(yù)處理裂解液裂解生物樣品，得到粗裂解液，所述生物樣品是唾液；其中， 預(yù)處理裂解液pH為8. 0，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50mM Tris-HCl, 3g/100ml的十二烷基磺酸鈉SDS，50mM的CDTA和IOOmM的NaCl水溶液，0. 2mg/ml的蛋白酶K;2)核酸吸附將步驟1)得到的粗裂解液與裂解結(jié)合液以及磁珠懸浮液混合，形成含有磁性納米微球-DNA的復(fù)合體的溶液體系，收集所述溶液體系中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體；其中，裂解結(jié)合液pH為7. 0，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)100mM的Tris_HCl，5M的異硫氰酸胍，5% (體積百分比)的Triton X-100，2g/100ml的3-(3-膽胺丙基)-二甲氨基-1-丙磺酸，50mM的EDTA以及20% (體積百分比)的乙醇；磁珠懸浮液每ml磁珠懸浮液中的納米級硅包被磁性微球為50mg，其余為水，納米級硅包被磁性微球的直徑是200nm ；3)洗滌將步驟2)得到的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體依次用洗滌液I、洗滌液II洗滌，然后用洗脫液溶出DNA，得到純化的DNA ；其中，洗滌液I 溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)5M的鹽酸胍，35% (體積百分含量)的乙醇和50mM的EDTA。洗滌液II 75% (體積百分含量)乙醇水溶液。洗脫液是TE溶液，所述TE溶液的pH為8. 0，溶劑是水，溶質(zhì)是IOmM的Tris-HCl，ImM 的 EDTA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取純化唾液DNA的方法。該方法包括以下步驟1)預(yù)處理將唾液與預(yù)處理裂解液接觸，去除生物細(xì)胞所粘附的固體物質(zhì)，得到粗裂解液；2)核酸吸附將步驟1)得到的粗裂解液與裂解結(jié)合液以及磁珠懸浮液混合，形成含有磁性納米微球-DNA的復(fù)合體的溶液體系，收集所述溶液體系中的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體；3)洗滌將步驟2)得到的磁性納米微球-DNA的復(fù)合體依次用洗滌液I、洗滌液II洗滌，然后用洗脫液溶出DNA。本發(fā)明提供的方法提取DNA的效率可達(dá)90％，提取的DNA可應(yīng)用于STR復(fù)合擴(kuò)增、DNA測序、DNA定量等下游分析操作。
文檔編號C12N15/10GK102220310SQ201110105238
公開日2011年10月19日 申請日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者葉健, 周云彪, 趙興春 申請人:公安部物證鑒定中心