專利名稱：紅桂木凝集素促進(jìn)CD4+T增殖活化并抑制Jurkat T細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞增殖和遷移的凝集素，特別是紅桂木凝集素促進(jìn)人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖和活化并抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病 Jurkat T細(xì)胞增殖和遷移的方法。
背景技術(shù)：
白血病是造血系統(tǒng)的惡性疾病，又稱“血癌”，是國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一。其特點(diǎn)是骨髓及其他造血組織中有大量白血病細(xì)胞無(wú)限制增生，并進(jìn)入外周血液，而正常造血細(xì)胞的產(chǎn)生及其正常的生物學(xué)功能受到明顯地抑制。該病居年輕人惡性疾病中的首位，特別是兒童成了白血病的高發(fā)人群?，F(xiàn)在，白血病已經(jīng)嚴(yán)重危害了人們的生命安全。因此，對(duì)于白血病的發(fā)生發(fā)展、診斷和防治研究顯得尤其重要。從造血系統(tǒng)中血細(xì)胞的分化發(fā)育與成熟過(guò)程來(lái)看，血細(xì)胞按所屬系列分六大系統(tǒng)，即紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系、單核細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞系、漿細(xì)胞系和巨核細(xì)胞系。每一系統(tǒng)又依細(xì)胞成熟水平分為原始、幼稚和成熟三個(gè)階段；紅系和粒系的幼稚階段又分為早幼、中幼和晚幼三個(gè)階段；而粗細(xì)胞根據(jù)胞漿所含顆粒特點(diǎn)的不同，又分為中性、嗜酸性和嗜堿性粒細(xì)胞。造血細(xì)胞的分化發(fā)育是一個(gè)異常復(fù)雜的過(guò)程，受到腦內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)作用。 例如，轉(zhuǎn)錄因子PU. 1和GATA-I是被廣泛承認(rèn)的在髓系細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起重要作用的調(diào)控因子，PU. 1表達(dá)上升會(huì)抑制GATA-I的表達(dá)，阻滯紅系分化，促進(jìn)髓系造血細(xì)胞的發(fā)育。在髓系細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中，PU. 1主要調(diào)控一系列編碼生長(zhǎng)因子和粘附分子基因的表達(dá)。PU. 1 通過(guò)結(jié)合在造血發(fā)育相關(guān)的靶基因啟動(dòng)子上的PU. 1結(jié)合位點(diǎn)，來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與造血發(fā)育的調(diào)控。紅桂木系亞熱帶、熱帶植物，廣西桂東南地區(qū)盛產(chǎn)，其種子中含有豐富的凝集素。 植物凝集素是一類具高度特異的糖結(jié)合活性的蛋白。它們能與動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞發(fā)生特異的作用，誘發(fā)一定的生理效應(yīng)。自從Sumner第一次分離純化到植物凝集素——伴刀豆球蛋白A以來(lái)，目前已有1000多種植物被報(bào)道含有凝集素。由于凝集素能選擇性地識(shí)別細(xì)胞膜糖脂或糖蛋白糖鏈的不同糖基，在生化、醫(yī)學(xué)上，植物凝集素常用于細(xì)胞的分型、分離、 糖蛋白和有絲分裂原的純化、鑒定微生物、腫瘤診斷、治療及預(yù)防和骨髓移植等；在免疫學(xué)上，植物凝集素能夠促淋巴細(xì)胞的有絲分裂，是一種重要的絲裂原。其與淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，刺激靜止淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞和有絲分裂。隨著基因工程的發(fā)展，植物凝集素已成為一種很有潛力對(duì)抗疾病的工具，可以用作定位因子與藥物或載體結(jié)合使之具有靶向功能。例如癌細(xì)胞在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化而被某些凝集素識(shí)別，當(dāng)該凝集素與藥物藕聯(lián)可賦予后者以導(dǎo)向殺傷能力，并可能有助于對(duì)病毒和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。經(jīng)檢索，紅桂木凝集素促進(jìn)人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖和活化，抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞增殖和遷移未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紅桂木凝集素促進(jìn)人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖活化抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞增殖和遷移的方法。本發(fā)明是這樣實(shí)施的紅桂木凝集素促進(jìn)CD4+T增殖抑制Jurkat T的方法，是從紅桂木種子中分離純化紅桂木凝集素，利用紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞CD4亞群的增殖和活化，并抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞的增殖。所述的分離純化紅桂木凝集素，在常規(guī)分離方法的基礎(chǔ)上，與現(xiàn)有技術(shù)不同的是本發(fā)明所有的操作均在1-5°C下進(jìn)行。得到紅桂木凝集素凍干粉經(jīng)0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，0. 22 μ m過(guò)濾器除菌，并配制不同濃度的紅桂木凝集素溶液。所述的不同濃度紅桂木凝集素溶液是0. 36 μ g/ml、1. 8 μ g/ml、3. 6 μ g/ml、 18 μ g/ml、36 μ g/ml、360 μ g/ml。所述的利用紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞CD4亞群的增殖的方法是將生長(zhǎng)良好的人外周血T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為IX 106/mL，接種于96孔板，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37°C，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，于結(jié)束培養(yǎng)前4h每孔加入20μ1 MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，先于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目。再將培養(yǎng)板離心，1500rpm，10min，棄上清，每孔加100 μ 1三聯(lián)溶解液，避光放置于37°C培養(yǎng)箱中過(guò)夜， 次日取出，微量振蕩器均勻振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD57tlnm，并計(jì)算增殖率。同時(shí)，將生長(zhǎng)良好的人外周血T淋巴細(xì)胞，以1 X 106/mL細(xì)胞濃度接種于6孔板，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C，C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，加入anti-CD3-PerCP、 anti-⑶4-FITC和anti-⑶8-PE熒光抗體，流式細(xì)胞術(shù)分析⑶4、⑶8細(xì)胞亞群比例。所述的利用紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞CD4亞群的活化的方法是將生長(zhǎng)良好的T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/ml，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組、PHA對(duì)照組和空白組，每組設(shè)3復(fù)孔，37 °C培養(yǎng)Mh，收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入anti-CD3-PerCP和 anti-CD25-PE熒光抗體，避光孵育30min，PBS洗滌，加入300 μ IPBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析⑶25的表達(dá)情況。所述的對(duì)T淋巴細(xì)胞⑶4亞群的增殖和活化，其過(guò)程如下(1)人外周血淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)按常規(guī)方法進(jìn)行。(2)紅桂木凝集素對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響用常規(guī)MTT法進(jìn)行。(3)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞周期的影響用常規(guī)PI染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。(4)紅桂木凝集素對(duì)CD4和CD8細(xì)胞亞群分布的影響用熒光抗體染色及常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。(5)紅桂木凝集素對(duì)CD25表達(dá)的影響用熒光抗體染色及常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。所述的抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞的增殖和遷移的方法將生長(zhǎng)良好的Jurkat T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 106/mL,接種于96孔板，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組、PHA對(duì)照組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。370C，C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，于結(jié)束培養(yǎng)前 4h每孔加入10 μ 1 CCK-8溶液，繼續(xù)孵育池，用酶標(biāo)儀測(cè)量0D570nm，并計(jì)算出增殖抑制率。
5所述的抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞的遷移的的方法取生長(zhǎng)良好的Jurkat T淋巴細(xì)胞，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/mL，接種100 μ 1細(xì)胞懸液于Transwell遷移小室內(nèi)，另在M孔板中加入含有20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，將Transwell小室移入M孔板內(nèi)，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組和空白組，每組設(shè)3復(fù)孔，37°C培養(yǎng)12h，取出小室，向M孔板內(nèi)加入CCK-8溶液，檢測(cè)Transwell遷移小室外的細(xì)胞數(shù)目情況，從而判斷細(xì)胞的遷移率。所述的抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞的增殖和遷移，其步驟過(guò)程如下(1) Jurkat T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以常規(guī)方法進(jìn)行。(2)紅桂木凝集素對(duì)Jurkat T淋巴細(xì)胞增殖的影響用常規(guī)CCK-8法進(jìn)行。(3)紅桂木凝集素對(duì)CD25表達(dá)的影響用常規(guī)熒光抗體染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。(4)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞因子IL-2和IFN- γ分泌的影響用常規(guī)ELISA法進(jìn)行。(5)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響用常規(guī)Armexin V/PI染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。(6)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞周期的影響用常規(guī)PI染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。(7)紅桂木凝集素對(duì)Jurkat T細(xì)胞遷移能力的影響以常規(guī)刮痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果1.本發(fā)明紅桂木凝集素促進(jìn)CD4+T增殖活化并抑制Jurkat T細(xì)胞的方法，利用本教研室自行發(fā)現(xiàn)的紅桂木凝集素作用于正常人外周血T淋巴細(xì)胞和急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、DNA分析和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)紅桂木凝集素可促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞CD4亞群的增殖和活化，為抗病毒感染及開(kāi)發(fā)疫苗增強(qiáng)劑提供了新型有效的途徑；通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、DNA分析、細(xì)胞凋亡分析、ELISA實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)等證實(shí)紅桂木凝集素可明顯抑制JurkatT淋巴細(xì)胞的增殖和遷移，為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供了新的有效的輔助手段。2.本發(fā)明方法在分離純化紅桂木凝集素過(guò)程中，所有操作均在低溫4°C下進(jìn)行， 能較好地維持紅桂木凝集素的生物學(xué)活性。紅桂木凝集素是一種比PHA更高效的CD4+T淋巴細(xì)胞絲裂原和急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制劑。


圖1為紅桂木凝集素聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖2為倒置顯微鏡觀察T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)情況；圖3為紅桂木凝集素(ALL)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖；圖4為紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞周期的影響；圖5為紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞CD4和⑶8亞群分布的影響；圖6為紅桂木凝集素增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活化分子⑶25的表達(dá)；圖7為CCK-8法測(cè)定紅桂木凝集素對(duì)Jurkat T細(xì)胞增殖的影響；圖8為鏡下觀察紅桂木凝集素抑制Jurkat T細(xì)胞的生長(zhǎng)；圖9為紅桂木凝集素(ALL)增強(qiáng)Jurkat T淋巴細(xì)胞表面⑶25分子的表達(dá)；圖10為紅桂木凝集素促進(jìn)Jurkat T細(xì)胞分泌IL_2 ；
圖11為紅桂木凝集素促進(jìn)Jurkat T細(xì)胞分泌IFN- γ ；圖12為紅桂木凝集素誘導(dǎo)Jurkat T淋巴細(xì)胞凋亡；圖13為紅桂木凝集素誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞周期S期停滯；圖14為紅桂木凝集素(ALL)抑制Jurkat細(xì)胞的遷移能力。圖中標(biāo)識(shí)圖1 I-Lanel為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，2_Lane2為樣品；圖 3 :*P < 0. 05vs control 為對(duì)照組比較，P < 0. 05 ；圖 7 :*P < 0. 05vs control 為對(duì)照組比較，P < 0. 05 ；圖 10 :*P < 0. Olvs Control 為對(duì)照組比較，P < 0. 05 ；圖 11 :*P < 0. Olvs Control 為對(duì)照組比較，P < 0. 05 ；圖 14 :*P < 0. 05vs control ；*flP < 0. 05vs different concentrations 為對(duì)照組比較，P < 0. 05 不同濃度組間比較，P < 0. 05。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、紅桂木凝集素的分離純化紅桂木凝集素的分離純化的所有操作，均在4°C下進(jìn)行。先取紅桂木種子30g，粉碎研磨，按1 5的比例加入0. 01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7. 2，含0. lmol/L NaCl) 150ml, 磁力攪拌器攪拌池，浸泡抽提Mh。抽提液凝血活力在29-2"之間。將抽提液過(guò)濾，濾液以 3000rpm離心15min，于上清液中加入硫酸銨至30%飽和度。3000rpm離心20min，棄沉淀物。上清液同上法加入硫酸銨至60%飽和度，放置12h。3000rpm離心20min。棄上清液， 用少量0. 01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7. 2 7. 4，含0. mol/L NaCl)溶解沉淀。將粗提液依次對(duì)流水、蒸餾水透析，最后對(duì)0. Olmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7. 2，含0. lmol/L NaCl)透析至無(wú)NH4+。3000rpm離心20min，將上清液上Gal_kpharose 6B親和層析柱，以0. Olmol/ L磷酸鹽緩沖溶液洗脫，當(dāng)A28tl降至0. 05后，換0. 2mol/moL半乳糖溶液繼續(xù)洗脫。收集洗脫峰，透析及超濾除去半乳糖。超濾液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，顯示一條蛋白質(zhì)帶(圖 1)。超濾液經(jīng)冷凍干燥備用，所得紅桂木凝集素凍干粉經(jīng)0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液溶解， 0. 22 μ m過(guò)濾器除菌，用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，并配制不同濃度的紅桂木凝集素溶液 0. 36 μ g/ml、l. 8 μ g/ml、3. 6 μ g/ml、18 μ g/ml、36 μ g/ml、360 μ g/ml。2、紅桂木凝集素促進(jìn)T淋巴細(xì)胞⑶4亞群的增殖和活化(1)人外周血淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)a.抽取靜脈血20ml，注入含有2ml肝素溶液的無(wú)菌試管中搖勻，再加入等量PBS 液(無(wú)菌)混勻。b.取細(xì)1淋巴細(xì)胞分離液置于離心管中，將稀釋血液沿管壁緩緩疊加于分層液上，形成清晰界面，2000r/min離心20min。c.用滴管直接吸出單個(gè)核細(xì)胞層置于另一離心管中，4倍量的PBS液，充分混勻， 1000r/min離心IOmin,棄上清，再用PBS液洗2次。d.用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)為106/ml， 37°C 5% CO2 培養(yǎng) Ih。
e.收集非黏附細(xì)胞，IOOOrpm離心lOmin。棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。f.將無(wú)菌的尼龍毛柱置于超凈臺(tái)內(nèi)。打開(kāi)閥門(mén)調(diào)節(jié)流速在大約3-^il/min。先用 3-4倍柱體積的無(wú)血清培養(yǎng)基平衡，再用相同體積的含有10%血清的完全培養(yǎng)基平衡。g.將上述的細(xì)胞懸液(5.0X108Cells/ml)加入尼龍毛柱內(nèi)，37°C溫育lh。打開(kāi)閥門(mén)控制流速在3-^il/min，收集含有T淋巴細(xì)胞的流出液。h.將T淋巴細(xì)胞以1 X IO6個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種于含10%胎牛血清，100U/mL青霉素和ΙΟΟμ g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37°C，5% CO2培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，用2%臺(tái)盼蘭拒染方法鑒定細(xì)胞活力大于95%。(2)MTT法檢測(cè)紅桂木凝集素對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響將生長(zhǎng)良好的人外周血T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/mL，接種于96孔板， 設(shè)不同濃度的紅桂術(shù)凝集素組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37°C，0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，于結(jié)束培養(yǎng)前4h每孔加入20 μ 1 MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，先于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目。再將培養(yǎng)板離心，1500rpm, IOmin,棄上清，每孔加100 μ 1三聯(lián)溶解液，避光放置于 37°C培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日取出，微量振蕩器均勻振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD57tlnm，并計(jì)算增殖率。細(xì)胞增殖率(％ )=實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值X 100%結(jié)果于倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，不同濃度的紅桂木凝集素組細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞集落形成逐漸增多變大，細(xì)胞形態(tài)均勻增大輪廓清晰，透光度增加較圓亮，高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞染色質(zhì)疏松、胞質(zhì)豐富。顯示細(xì)胞數(shù)量隨紅桂木凝集素濃度的增加而增加 (圖 2)。采用MTT法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的增殖率，結(jié)果如圖3所示，表明紅桂木凝集素顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，增殖率隨著紅桂木凝集素濃度的增加而升高。PHA對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖也有促進(jìn)作用。(3)細(xì)胞周期分析將生長(zhǎng)良好的T淋巴細(xì)胞用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Mh，獲得GO期細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/mL，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組、PHA對(duì)照組和空白組，每組設(shè)3復(fù)孔，接種于6孔板，恢復(fù)正常培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)4 后收集細(xì)胞，PBS洗滌，70 %乙醇。C 固定 30min，冷 PBS 洗滌 2 次，加入 PI 溶液(含有 50mg/L PI，lmL/L Triton X-100， 0. ImMol/LEDTA和50μ L/mL RNase)，避光放置15min，用流式細(xì)胞儀及CellQuest軟件分析細(xì)胞周期。結(jié)果如下圖4和表1所示，與空白組相比，隨著紅桂木凝集素的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸降低，S期和G2/M期的細(xì)胞比例逐漸增多，表明紅桂木凝集素明顯促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)一步證實(shí)紅桂木凝集素可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖分裂。表1 人外周血T淋巴細(xì)胞經(jīng)紅桂木凝集素作用后的細(xì)胞周期分布
權(quán)利要求
1.一種紅桂木凝集素促進(jìn)CD4+T增殖活化并抑制Jurkat T細(xì)胞的方法，是從紅桂木種子中分離純化紅桂木凝集素，利用紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞CD4亞群的增殖和活化，并抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞的增殖和遷移。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的分離純化紅桂木凝集素，在常規(guī)分離方法的基礎(chǔ)上，所有的操作均在1_5°C下進(jìn)行，得到紅桂木凝集素凍干粉經(jīng)O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，0. 22 μ m過(guò)濾器除菌，并配制不同濃度的紅桂木凝集素溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的不同濃度紅桂木凝集素溶液是 0. 36 μ g/ml、l. 8 μ g/ml、3. 6 μ g/ml、18 μ g/ml、36 μ g/ml、360 μ g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的利用紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞 ⑶4亞群的增殖的方法是將生長(zhǎng)良好的人外周血T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/mL， 接種于96孔板，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，于結(jié)束培養(yǎng)前4h每孔加入20 μ 1 MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，先于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目，再將培養(yǎng)板離心，1500rpm, IOmin,棄上清，每孔加100 μ 1三聯(lián)溶解液，避光放置于37°C培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日取出，微量振蕩器均勻振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀測(cè)量 OD57tol，并計(jì)算增殖率；同時(shí)，將生長(zhǎng)良好的人外周血T淋巴細(xì)胞，以IXlO6AiL細(xì)胞濃度接種于6孔板，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，加入anti-CD3-PerCP、anti_CD4_FITC和anti_CD8_PE熒光抗體，流式細(xì)胞術(shù)分析⑶4、⑶8細(xì)胞亞群比例；所述的利用紅桂木凝集素對(duì)T淋巴細(xì)胞CD4亞群的活化的方法是將生長(zhǎng)良好的T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/mL，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組、PHA對(duì)照組和空白組， 每組設(shè)3復(fù)孔，37°C培養(yǎng)Mh，收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入anti-CD3-PerCP和anti_CD25_PE 熒光抗體，避光孵育30min，PBS洗滌，加入300 μ IPBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析⑶25的表達(dá)情況。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的方法，其特征在于所述的對(duì)T淋巴細(xì)胞CD4亞群的增殖和活化，其過(guò)程如下(1)人外周血淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)按常規(guī)方法進(jìn)行；(2)紅桂木凝集素對(duì)人外周血T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響用常規(guī)MTT法進(jìn)行；(3)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞周期的影響用常規(guī)PI染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行；(4)紅桂木凝集素對(duì)CD4和CD8細(xì)胞亞群分布的影響用熒光抗體染色及常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行；(5)紅桂木凝集素對(duì)CD25表達(dá)的影響用熒光抗體染色及常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病 JurkatT細(xì)胞的增殖的的方法將生長(zhǎng)良好的Jurkat T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 106/mL， 接種于96孔板，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組、PHA對(duì)照組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔， 370C，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，于結(jié)束培養(yǎng)前4h每孔加入10 μ 1 CCK-8溶液，繼續(xù)孵育池，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD57tlnm，并計(jì)算增殖抑制率；所述的抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞的遷移的的方法取生長(zhǎng)良好的JurkatT淋巴細(xì)胞，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為lX106/mL，接種100 μ 1細(xì)胞懸液于Transwell遷移小室內(nèi)，另在M孔板中加入含有20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，將Transwel 1小室移入M孔板內(nèi)，設(shè)不同濃度的紅桂木凝集素組和空白組，每組設(shè)3復(fù)孔，37°C培養(yǎng)12h，取出小室，向24孔板內(nèi)加入CCK-8溶液，檢測(cè)Transwell 遷移小室外的細(xì)胞數(shù)目情況，從而判斷細(xì)胞的遷移率。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的方法，其特征在于所述的抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病 Jurkat T細(xì)胞的增殖和遷移，其步驟過(guò)程如下(1)JurkatT淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以常規(guī)方法進(jìn)行；(2)紅桂木凝集素對(duì)JurkatT淋巴細(xì)胞增殖的影響用常規(guī)CCK-8法進(jìn)行；(3)紅桂木凝集素對(duì)CD25表達(dá)的影響用常規(guī)熒光抗體染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行；(4)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分泌的影響用常規(guī)ELISA法進(jìn)行；(5)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響用常規(guī)ArmexinV/PI染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行；(6)紅桂木凝集素對(duì)細(xì)胞周期的影響用常規(guī)PI染色及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行；(7)紅桂木凝集素對(duì)JurkatT細(xì)胞遷移能力的影響以常規(guī)刮痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種紅桂木凝集素促進(jìn)人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖活化并抑制人急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat T細(xì)胞增殖和遷移的方法，從紅桂木種子分離純化紅桂木凝集素整個(gè)過(guò)程中在1-5℃條件下進(jìn)行，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、DNA分析和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)紅桂木凝集素能促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞CD4亞群的增殖和活化，是一種比PHA更高效的CD4+T淋巴細(xì)胞絲裂原，為抗病毒感染及開(kāi)發(fā)疫苗增強(qiáng)劑提供了新型有效的途徑；通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、DNA分析、細(xì)胞凋亡分析、ELISA實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)等證實(shí)紅桂木凝集素能明顯抑制Jurkat T淋巴細(xì)胞的增殖和遷移，是一種比PHA更高效的急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制劑，為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療提供了新的有效的輔助手段。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102226170SQ20111011074
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者崔博, 曾麒燕, 王婧娉 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)