一種麥胚凝集素修飾的苦參堿納米粒制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種麥胚凝集素修飾的苦參堿納米粒制備方法及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在歐美國(guó)家腫瘤患者的死亡原因中位居第 二，在我國(guó)也逐漸呈高發(fā)趨勢(shì)。如何將抗癌藥物制成納米粒并賦予它主動(dòng)識(shí)別癌細(xì)胞的功 能，是藥劑學(xué)界普遍關(guān)注度問(wèn)題。ChunxiaWang等采用麥胚凝集素修飾紫杉醇納米粒，研宄 其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CaCo-2和HT-29的增值活性影響，與普通紫杉醇納米粒進(jìn)行比較，結(jié)果表 明結(jié)腸癌細(xì)胞上糖蛋白對(duì)麥胚凝集素的表達(dá)水平高于正常結(jié)腸細(xì)胞。YingLiu等用戊二醛 法將麥胚凝集素（WGA)鍵合在蟾酥靈的脂質(zhì)納米粒上，采用體外法評(píng)價(jià)法研宄其與結(jié)腸癌 細(xì)胞株CaCo-2的作用，并與未經(jīng)WGA修飾脂質(zhì)納米粒比較，發(fā)現(xiàn)前者可提高細(xì)胞對(duì)蟾酥靈 的吸收，提示可通過(guò)口服WGA修飾的脂質(zhì)納米粒提高藥物的生物利用度。SakumaS報(bào)道， 包載熒光探針香豆素-6的納米粒經(jīng)花生凝集素修飾后，可識(shí)別結(jié)腸癌特異抗原，用于內(nèi)窺 鏡檢查結(jié)腸癌的成像劑。CohenS研宄結(jié)果表明，將腫瘤靶向配體花生凝集素通過(guò)碳二亞 胺法與生物可降解熒光劑白蛋白制成的納米粒結(jié)合后，利用其與結(jié)腸癌細(xì)胞特異親和的特 性，采用NIR技術(shù)將其應(yīng)用于結(jié)腸癌檢查。大量癌變的結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上和細(xì)胞頂 端胞漿內(nèi)存在與麥胚凝集素結(jié)合位點(diǎn)；結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)蛋白上存在WGA可識(shí) 別的大量糖蛋白，而正常結(jié)腸細(xì)胞則明顯缺乏這種糖蛋白。因此，凝集素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有 特異親和作用。綜上所述，凝集素具有作為抗癌藥物載體，用于結(jié)腸癌靶向治療的可能性。
[0003] 苦參堿（Matrine，Mt)是從豆科植物苦參的干燥根中提取的主要生物堿之一，有 a-，0-，Y-，S-四種異構(gòu)體，常見(jiàn)的為a-苦參堿，溶于水、氯仿、苯、乙醚等，略溶于石油 醚。屬于四環(huán)的喹諾里西啶生物堿。研宄發(fā)現(xiàn)，Mt可顯著抑制HT-29細(xì)胞的體外侵襲力， 其機(jī)制可能與下調(diào)HT-29細(xì)胞HSPE基因表達(dá)有關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，Mt可誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW1116 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Fax和BaxmRNA表達(dá)有關(guān)。報(bào)道苦參堿體外可抑制人大腸癌 SW480細(xì)胞環(huán)氧化酶-2的表達(dá)，抑制SW620細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。因此，苦參堿是一個(gè)非常 有潛力的抗結(jié)腸癌藥物。但目前關(guān)于苦參堿各類(lèi)納米粒的報(bào)道較多，如：氧化苦參堿膠束納 米粒制備及其體外抗腫瘤活性研宄，《中國(guó)藥業(yè)》2011年第15期；苦參堿納米粒在小鼠體內(nèi) 組織分布和藥動(dòng)學(xué)研宄，《中南藥學(xué)》2010年第7期；苦參堿/羧甲基殼聚糖/磷酸化殼聚 糖納米粒子的制備及性能表征，《材料導(dǎo)報(bào)》2010年第6期；苦參堿聚氰基丙烯酸正丁酯納 米粒凍干粉針劑的制備及體外釋放，《中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志》2009年第6期；HPLC法測(cè)定苦參 堿白蛋白納米粒的包封率，《藥物分析雜志》2008年第1期；苦參堿固體脂質(zhì)納米粒的試制 及物相分析，《中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志》CS⑶2005年第4期；苦參堿固體脂質(zhì)納米粒的制備，《中 國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》2013年第19期；磁性聚乳酸-羥基乙酸氧化苦參堿納米粒的制備及其 特性，《生物醫(yī)學(xué)工程與臨床》2012年第3期；氧化苦參堿聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的體 外釋藥及肝臟分布研宄，《中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)》CSCD2010年第6期，但未見(jiàn)麥胚凝集素修飾 的苦參堿納米粒的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種麥胚凝集素 修飾的苦參堿納米粒制備方法及其應(yīng)用，可有效解決麥胚凝集素修飾的苦參堿納米粒的制 備及苦參堿靶向性低，使用效果差的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：所述的麥胚凝集素修飾的苦參堿納米粒是在苦參堿納米粒 上通過(guò)化學(xué)鍵連接有麥胚凝集素，其制備方法包括以下步驟：
[0006] (1)制備苦參堿納米粒（Mt-NPs):稱(chēng)取苦參堿（MT)0. 4-0. 6g，用水0.8-1. 2ml水 浴加熱溶解，成苦參堿水溶液；稱(chēng)取聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)O. 25-0. 3g，用18-22ml 丙酮水浴加熱溶解，作為有機(jī)相；在1600r?mirT1轉(zhuǎn)速攪拌下，將苦參堿水溶液滴注入 有機(jī)相中，形成初乳，以質(zhì)量濃度為〇.46%的聚乙烯醇（?￥4)水溶液12〇-13〇1111作為水 相，在815r?mirT1轉(zhuǎn)速攪拌下，將初乳注入水相中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，揮去丙酮，在4°C、 40000r^化―1下離心lh，收集沉淀，沉淀用蒸餾水洗滌3次，一50°C預(yù)凍10h，升溫至一 30°C 維持6h，再升溫至一 20°C維持2h，最后升溫至10°C維持3h，得干燥物，干燥物研磨成粉末 狀，即為苦參堿納米粒（Mt-NPs);
[0007] (2)制備麥胚凝集素修飾苦參堿納米粒（WGA-Mt-NPS):取上述制備的苦參堿納 米粒（Mt-NPs)用PBS溶液45-55ml溶解，將碳二亞胺（DEAC)O. 7g和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)O. 03g，加入PBS溶液溶解成25ml，然后加入苦參堿納米粒（Mt-NPs)的PBS溶液中， 攪拌均勻，室溫下活化4h，4000r?mirT1離心lOmin，取上清液加入含麥胚凝集素（WGA)濃 度為0. 12mg/ml的PBS溶液25ml，4°C下孵化14h，4°C下40000r?mirT1離心lh，收集沉淀， 沉淀用蒸餾水洗滌3次，于一 50°C預(yù)凍10h，升溫至一 30°C維持6h，再升溫至一 20°C維持 2h，最后升溫至1(TC維持3h，得干燥物，將干燥物研磨成粉末狀，即為麥胚凝集素修飾苦參 堿納米粒（WGA-Mt-NPS);
[0008] 所述的PBS溶液為pH值7. 2-7. 4的PBS溶液。
[0009] 所述的麥胚凝集素修飾的苦參堿納米粒在制備抗結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明利用結(jié)腸癌細(xì)胞存在凝集素的結(jié)合位點(diǎn)及凝集素受體的表達(dá)，將麥胚凝集 素（WGA)修飾在苦參堿制成的納米粒（NPS)上，使之與結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生特異親和作用，選擇 性殺傷癌細(xì)胞并發(fā)揮長(zhǎng)效作用，能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤特異性靶向，且制備的條件容易滿(mǎn)足，原料來(lái) 源豐富，成本低，是腫瘤治療藥物上的創(chuàng)新。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為本發(fā)明不同濃度MT-NPS隨時(shí)間變化對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用；
[0012] 圖2為本發(fā)明不同濃度WGA-MT-NPS隨時(shí)間變化對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)說(shuō)明。
[0014] 本發(fā)明在具體實(shí)施中可由以下實(shí)施例給出。
[0015] 實(shí)施例1
[0016] 本發(fā)明麥胚凝集素修飾的苦參堿納米粒的制備方法，包括以下步驟：
[0017] (1)制備苦參堿納米粒（Mt-NPs):稱(chēng)取苦參堿（MT)0. 5g，用水1. 0ml水浴加熱溶 解，成苦參堿水溶液；稱(chēng)取聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)O. 279g，用20ml丙酮水浴加熱 溶解，作為有機(jī)相；在1600r?mirT1轉(zhuǎn)速攪拌下，將苦參堿水溶液滴注入有機(jī)相中，形成初 乳，以質(zhì)量濃度為〇. 46%的聚乙烯醇（PVA)水溶液125ml作為水相，在815r?mirT1轉(zhuǎn)速 攪拌下，將初乳注入水相中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，揮去丙酮，在4°C、40000r?mirT1下離心lh， 收集沉淀，沉淀用蒸餾水洗滌3次，一 50°C預(yù)凍10h，升溫至一 30°C維持6h，再升溫至一 20°C維持2h，最后升溫至1(TC維持3h，得干燥物，干燥物研磨成粉末狀，即為苦參堿納米粒 (Mt-NPs)；
[0018] (2)制備麥胚凝集素修飾苦參堿納米粒（WGA-Mt-NPS):取上述制備的苦參堿 納米粒（Mt-NPs)用PBS溶液50ml溶解，將碳二亞胺（DEAC)O. 7g和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)O. 03g，加入PBS溶液溶解成25ml，然后加入苦參堿納米粒（Mt-NPs)的PBS溶液中， 攪拌均勻，室溫下活化4h，4000r?mirT1離心lOmin，取上清液加入含麥胚凝集素（WGA)濃 度為0. 12mg/ml的PBS溶液25ml，4°C下孵化14h，4°C下40000r?mirT1離心lh，收集沉淀， 沉淀用蒸餾水洗滌3次，于一 50°C預(yù)凍10h，升溫至一 30°C維持6h，再升溫至一 20°C維持 2h，最后升溫至1(TC維持3h，得干燥物，將干燥物研磨成粉末狀，即為麥胚凝集素修飾苦參 堿納米粒（WGA-Mt-NPS)。
[0019] 實(shí)施例2
[0020] 麥胚凝集素修飾的苦參堿納米粒的制備方法，包括以下步驟：
[0021] (1)制備苦參堿納米粒（Mt-NPs):稱(chēng)取苦參堿（MT)0. 4g，用水0. 8ml水浴加熱溶 解，成苦參堿水溶液；稱(chēng)取聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA) 0. 26g，用18ml丙酮水浴加熱溶 解，作為有機(jī)相；在1600r?mirT1轉(zhuǎn)速攪拌下，將苦參堿水溶液滴注入有機(jī)相中，形成初乳， 以質(zhì)量濃度為〇. 46%的聚乙烯醇（PVA)水溶液122ml作為水相，在815r?mirT1轉(zhuǎn)速攪拌下， 將初乳注入水相中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，揮去丙酮，在4°C、40000r?mirT1下離心lh，收集沉淀， 沉淀用蒸餾水洗滌3次，一 50°C預(yù)凍10h，升溫至一 30°C維持6h，再升溫至一 20°C維持2h， 最后升溫至l〇°C維持3h，得干燥物，干燥物研磨成粉末狀，即為苦參堿納