專利名稱：一種無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。特別是涉及一種無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法。具體的，涉及植物內(nèi)源基因作為植物轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化功能缺失水稻突變體，利用基因的功能互補(bǔ)作用，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株，能夠代替目前廣泛使用的通過(guò)抗生素或者抗除草劑基因作為篩選標(biāo)記基因存在的弊端，能夠獲得具有生物安全性和生態(tài)安全性的轉(zhuǎn)基因植物，具有廣闊的應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因水稻技術(shù)中，為了實(shí)現(xiàn)外源基因的高效轉(zhuǎn)化，往往采用合適的篩選標(biāo)記。到目前為止被廣泛用于選擇的標(biāo)記基因主要有兩類一是抗生素類，包括潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt)等；另一類是抗除草劑類，包括草丁膦 (glufosinate)抗性基因(bar)、草甘膦(glufosinate)抗性基因(印sps)等。這些存在于轉(zhuǎn)基因植物中的具有抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記基因是否會(huì)對(duì)環(huán)境及人類健康有不良影響和損害引起了廣泛關(guān)注。為避免用抗生素和抗除草劑基因作為篩選標(biāo)記可能引起的生物安全問(wèn)題，目前采用了一些較為安全的選擇標(biāo)記，主要有綠色熒光蛋白基因(GFP)、6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)、木糖異構(gòu)酶基因(xylA)和谷氨酸半醛轉(zhuǎn)氨酶基因(hemL) 等。盡管如此，利用外源基因作為選擇標(biāo)記仍然難以消除人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性疑慮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是無(wú)選擇標(biāo)記水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立，為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明利用水稻苗期致死基因可以互補(bǔ)白化致死突變體這一特點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種無(wú)選擇標(biāo)記基因水稻的培育方法，該方法是用水稻苗期致死基因(0sALB;3)替換原載體中的選擇標(biāo)記基因構(gòu)建成新載體，然后將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化水稻苗期致死突變體細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培育成植株，其中水稻苗期致死基因的基因序列為SEQ ID NO 1。水稻苗期致死突變體優(yōu)選為純合alb3突變體。宿主細(xì)胞可以是任何能夠轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。尤其優(yōu)選為農(nóng)桿菌細(xì)胞。上述方法中，原載體可以是PCAMBIA1300載體，原載體中選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾剡x擇標(biāo)記HPT。原載體和新載體可以裝載其他外源基因。SEQ ID NO 1所示的基因序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ IDNO :2。本發(fā)明提供一種植物表達(dá)載體，該載體中無(wú)選擇標(biāo)記基因，但存在本水稻苗期致死基因，其位于載體中如果存在選擇標(biāo)記基因的位置，所述水稻苗期致死基因的基因序列為 SEQ ID NO :1ο本發(fā)明還提供了水稻苗期致死突變體細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因受體，尤其作為培育無(wú)選擇標(biāo)記基因水稻的轉(zhuǎn)基因受體，該受體接受上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還提供了鑒定上述水稻苗期致死突變體基因(0sALB;3)的STS (序列標(biāo)簽位點(diǎn))標(biāo)記，該STS標(biāo)記的引物如下ALB3-F 5' -TTCGCTGAAATGCGCCATG-3，(SEQ ID NO 7)ALB3-R 5' -ACACGGGAGAGGTTACCAG-3，(SEQ ID NO 8)本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期艱苦的研究，通過(guò)篩選對(duì)苗期致死突變體，克隆了引起苗期致死的基因0sALB3，利用0sALB3可以在功能上互補(bǔ)苗期白化致死表型這一特點(diǎn)，將0sALB3基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上替換潮霉素選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)化苗期白化致死突變體，通過(guò)基因的互補(bǔ)作用，獲得的正常植株即為轉(zhuǎn)化植株。該體系選用的是水稻內(nèi)源功能基因，實(shí)質(zhì)是無(wú)選擇標(biāo)記，避免了選用外源基因作為選擇標(biāo)記引起的安全性疑慮，該技術(shù)在轉(zhuǎn)基因生物安全方面具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA-ALB3載體圖。MCS為多克隆位點(diǎn)。圖2是成熟單株基因型鑒定。Marker為DL2000，WT為野生型中花11，MT為純合 alb3突變體，1-21為單株，一條帶為純合野生型基因型，兩條帶為雜合體基因型。純合突變體苗期白化致死，無(wú)存活植株。圖3是雜合體收獲的種子誘導(dǎo)的愈傷組織。箭頭所示的白色胚芽誘導(dǎo)的愈傷組織為純合突變體。圖4是為白色胚芽提取DNA進(jìn)行基因型鑒定。Marker為DL2000，WT為野生型中花11，MT為純合alb3突變體，1-18為其中的18個(gè)白色胚芽提取的DNA擴(kuò)增的結(jié)果。圖5是轉(zhuǎn)基因植株。圖6是轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定。Marker為DL2000，WT為野生型中花11，MT為純合alb3突變體，1-12為轉(zhuǎn)基因植株。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。
具體實(shí)施例方式為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常用分子生物學(xué)、組織培養(yǎng)技術(shù)和農(nóng)學(xué)手冊(cè)所記載的方法。實(shí)施例1載體的構(gòu)建l、cDNA 的獲得RT-PCR的實(shí)驗(yàn)具體步驟參照Huang等的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行(Huang等， Down-regulation of SLIENT INFORMATION REGULAT0R2_relatedhistone deacetylase gene, OsSRTl, induces DNA fragmentation and cell deathin rice, Plant Physiol, 2007 :1508-1519)。具體步驟如下(I)RNA材料準(zhǔn)備挑選約100株野生型中花11的種子播種于小缽中。播種15天后每份樣品取1克左右的新鮮葉片提取RNA，每份RNA樣品各取 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。(2) RNA樣品抽提及反轉(zhuǎn)錄方法如下用Axygen公司的Trizol試劑分別提取總RNA。每份材料各取IygS RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程如下在0. 2 μ 1的離心管中加入1μ g總RNA，ly 1 oligo (dT) 18 (Promega公司)，加無(wú)RNA酶水至8 μ 1，在70°C水浴變性5分鐘，冰上冷卻5分鐘，稍離心后加入4 μ 1的5 X First strand Buffer (Promega 公司)、5μ 1 的 2· 5mMdNTPs (Takara 公司)、1 μ 1 RNase inhibitor (Takara 公司)及 1 μ 1MMLVReverse Transcriptase (Promega 公司)，輕輕混勻，42°C 反應(yīng) 1 小時(shí)，70°C 5 分鐘，終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于后續(xù)PCR反應(yīng)。2、全長(zhǎng)0sALB3的獲得設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增0sALB3全長(zhǎng)ORF的引物(引物的序列為ALB3-F-SalI :5，-GAGTCGACTCCTAAACCCCTCCTC-3，(SEQ ID NO 3)ALB3-F-SalI :5，-CCAGTCGACATCGCATCTGCAAAAGG-3，(SEQ IDNO 4)擴(kuò)增上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，反應(yīng)體系50 μ L PCR體系包括2 XPrimeSTARGC buffer 25 μ L, dNTPs(2. 5mmol/L)4 μ L,弓| 物(10mmol/L)各 1 μ L，PrimeSTAR DNA Polymerase (TaKaRa) (5U/ μ L) 0· 5 μ L，cDNA 1 μ L,無(wú)菌水 17. 5 μ L。在 MJ PCR 儀上進(jìn)行 PCR0反應(yīng)條件為94°C下預(yù)變性5min ；94°C下30s，60°C下30s，72°C下3min，;35個(gè)循環(huán)； 72°C下延伸lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3、酶切、連接RT-PCR獲得的預(yù)期大小的片段用愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司的AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)序獲得的基因序列為SEQ ID N0:1，其為 0sALB3基因?；厥盏钠斡肕il酶切。pCAMBIA1300空載體用BioI單酶切OihoI酶與 Sal I酶是同尾酶，即兩種酶產(chǎn)生的粘性末端相同)，的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收大片段，酶切產(chǎn)生的粘性末端用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理，末端去磷酸化。將上述DNA片段和處理后的載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取10個(gè)生長(zhǎng)正常的菌斑搖菌提取質(zhì)粒，用PCR驗(yàn)證是否插入，PCR引物ALB3-IS-F位于0sALB3的5’端，35S-IS-R位于CaMV 35S啟動(dòng)子3’ 端，只有裝載方向正確的陽(yáng)性克隆才能擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)物大小530bp，引物如下ALB3-IS-F 5' -GCGCTGCATGTACTTGAAC-3，(SEQ ID NO 5)35S-IS-R 5' -TATCCTTCGCAAGACCTTCC-3，(SEQ ID NO 6)選取擴(kuò)增出預(yù)期大小的克隆，將菌液送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證正確，無(wú)堿基突變的克隆命名為pCAMBIA-ALB3(圖1)，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。實(shí)施例2受體的選擇1、受體植株基因型鑒定由于alb3突變體苗期白化致死，不能獲得純合種子，所以必須選擇雜合植株的種子用于誘導(dǎo)愈傷組織，alb3突變體是在第一外顯子處缺失了 31bp，導(dǎo)致mRNA移碼，蛋白質(zhì)翻譯提前終止。在該缺失兩端設(shè)計(jì)了一個(gè)STS標(biāo)記，可以鑒定植株的基因型，STS標(biāo)記引物如下ALB3-F 5' -TTCGCTGAAATGCGCCATG-3，(SEQ ID NO 7)ALB3-R 5' -ACACGGGAGAGGTTACCAG-3，(SEQ ID NO 8)野生型DNA可以擴(kuò)增出210bp的片段，純合突變體可以擴(kuò)增出ISObp的片段，雜合體可以擴(kuò)增210bp和ISObp兩條片段。抽穗期選取植株葉片提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取擴(kuò)增出兩條帶的植株即雜合體，收獲種子曬干用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)(圖2)。2、愈傷組織誘導(dǎo)取水稻成熟種子，人工或者機(jī)械脫殼，挑取飽滿光潔無(wú)菌斑的種子，消毒后，放在無(wú)菌濾紙上吸干，置入成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，觀察種子發(fā)芽后的表型，選取胚芽為全白色的種子誘導(dǎo)的愈傷繼代培養(yǎng)(圖幻，棄掉綠色胚芽的種子及愈傷組織，將白色胚芽逐個(gè)剪下，微量提取DNA，用實(shí)施例2所述的STS標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 鑒定種子的基因型，發(fā)現(xiàn)白色胚芽的基因型均為純合突變型，可用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)(圖4)。實(shí)施例3遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of T-DNA. Plant J，1994，6 :271-282)，利用實(shí)施例 2 所述方法選擇的具有白色胚芽的成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后，挑選生長(zhǎng)旺盛愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體，將PCAMBIA-ALB3載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25°C條件下共培養(yǎng)3天后，再將愈傷在預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照條件下培養(yǎng)。分化出綠色苗的轉(zhuǎn)化子應(yīng)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗，待苗長(zhǎng)至Icm左右，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中壯苗，一個(gè)月左右得到轉(zhuǎn)基因植株(圖5)。實(shí)施例4轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)選取生長(zhǎng)旺盛的轉(zhuǎn)化苗葉片提取DNA，用實(shí)施例2所述的STS標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行分子鑒定，由于在愈傷組織階段選取白色胚芽的愈傷，經(jīng)鑒定為純合突變體誘導(dǎo)的愈傷組織， STS鑒定白色胚芽的基因型為純合突變體，PCR只能擴(kuò)增出ISObp的突變帶型，轉(zhuǎn)化苗DNA 擴(kuò)增后可以獲得2IObp和180bp兩條帶(圖6)，其中2IObp來(lái)源于pCAMBIA_ALB3載體攜帶的異位插入的野生型ALB3基因型，表明轉(zhuǎn)基因植株確實(shí)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。本實(shí)驗(yàn)中獲得的12株綠色的轉(zhuǎn)化苗100%為陽(yáng)性苗。本發(fā)明所描述的基因、蛋白及其應(yīng)用的方法已經(jīng)通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)行了描述。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本發(fā)明的內(nèi)容適當(dāng)改變?cè)?、工藝條件等環(huán)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒(méi)有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)選擇標(biāo)記基因水稻的培育方法，該方法是用水稻苗期致死基因0SALB3替換原載體中的選擇標(biāo)記基因構(gòu)建成新載體，然后將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化水稻苗期致死突變體細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培育成植株，其中水稻苗期致死基因的基因序列為SEQ ID NO 1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中水稻苗期致死突變體優(yōu)選為純合alb3突變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中原載體是PCAMBIA1300載體，原載體中選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾剡x擇標(biāo)記HPT，原載體和新載體可以裝載其他外源基因。
5.一種植物表達(dá)載體，該載體中無(wú)選擇標(biāo)記基因，但存在水稻苗期致死基因，其位于載體中如果存在選擇標(biāo)記基因的位置，所述水稻苗期致死基因的基因序列為SEQ ID NO :1。
6.鑒定水稻苗期致死突變體基因0sALB3的STS標(biāo)記，該STS標(biāo)記的引物序列如下SEQ ID NO 7 禾口 SEQ ID NO 8 ALB3-F :5’ -TTCGCTGAAATGCGCCATG-3‘ALB3-R 5' -ACACGGGAGAGGTTACCAG-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法。該方法采用水稻內(nèi)源功能基因作為選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化水稻功能缺失突變體，獲得無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻的方法。該方法包括轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、水稻遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化植物鑒定等步驟。本發(fā)明利用植物內(nèi)源基因作為植物轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化功能缺失水稻苗期白化致死突變體，利用基因的功能互補(bǔ)作用，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株，能夠代替目前廣泛使用的通過(guò)抗生素或者抗除草劑基因作為篩選標(biāo)記基因存在的弊端，能夠獲得具有生物安全性和生態(tài)安全性的轉(zhuǎn)基因植物，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102226187SQ20111012266
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月11日
發(fā)明者李素娟, 汪得凱, 陶躍之 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院