玉米絲氨酸消旋酶基因作為篩選標記在南抗楊轉化體系中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術和植物基因工程領域，提供了一種玉米絲氨酸消旋酶基 因作為篩選標記在南抗楊遺傳轉化中的應用。
【背景技術】
[0002] 楊樹，是全世界上栽培面積最大、木材產量最高，同時也是對碳固定貢獻最大的樹 種。楊樹作為林業(yè)研宄中的模式植物，具有優(yōu)良的實驗特性，容易進行種間雜交和無性繁 殖；已建立完善遺傳轉化系統(tǒng)并且生長迅速；除此之外，楊屬植物具有豐富的遺傳多樣性。 采用常規(guī)育種方法改良林木，不僅抗性周期長、工序復雜、費時費工，而且容易受到氣候、地 域和水分等的影響，基因工程的發(fā)展為楊樹新品種的培育開辟了一條經濟且有效的途徑。
[0003] 植物的遺傳轉化研宄主要是通過將具有優(yōu)良性狀的外源目的基因導入到植物基 因組中，用標記基因篩選出真正含有目的基因片段的轉化體，并使其完整再生，通過這種方 式獲得遺傳性狀改良的轉化植株。其中標記基因可以在遺傳轉化中篩選和鑒定出轉化的植 物細胞、植物組織和轉基因植株，起到區(qū)分轉化和非轉化細胞的關鍵作用。根據(jù)篩選方法的 不同可分為選擇基因（Selectivegene)和報告基因（reportergene)。選擇基因通常是 指抗生素和除草劑抗性基因，而報告基因有葡萄糖苷酸酶基因（GUS)、熒光素酶基因（LUC) 和綠色熒光蛋白基因（GFP)等。出于對生態(tài)環(huán)境以及轉基因食品的生物安全性等方面的考 慮，標記基因又可分為傳統(tǒng)的選擇標記基因（traditionalselectivemarkergene)和生 物安全性標記基因（biosafetymarkergene)。隨著科研方面開展更多的在田間的轉基因 植物實驗，以及在消費市場中逐步投放的轉基因產品，使得社會越來越關注轉基因生物安 全性問題，相關科學工作者對這個問題也引起了高度的重視，因此對于開展生物安全性標 記基因的研宄有其必然性以及極其重要的意義。
[0004] 玉米絲氨酸消旋酶（serineracemase，SR)是一類依賴PLP型酶，同時具有消旋酶 和脫水酶的兩種活性。SR的酶活反應需要金屬離子，哺乳動物SR還需要ATP的參與，植物 SR則不需要ATP的參與。不僅能將L-/D-絲氨酸轉化成相應的D-/L-絲氨酸；而且可以將 L-/D-絲氨酸轉化成丙酮酸。之前的一些學者一直認為動植物體內的氨基酸不存在D-型氨 基酸，都是以L-型氨基酸存在的。自從在細菌的細胞壁中發(fā)現(xiàn)了D-丙氨酸和D-谷氨酸后， 人們開始研宄微生物中的氨基酸消旋酶。之后從水稻、大麥、擬南芥等物種中分離純化出絲 氨酸消旋酶，并進一步的研宄了該酶的性質。絲氨酸消旋酶作為一種無抗性選擇標記基因， 對于植物中的D-絲氨酸具有解毒的功能，并且對于生態(tài)環(huán)境不會造成污染，是一種安全的 篩選標記基因。因此研宄該標記基因能否能在木本植物中高效表達，具有重要的科學意義 和應用前景。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種玉米絲氨酸消旋酶基因及其表達載體，以及該基因作為 篩選標記在南抗楊遺傳轉化中的應用。本發(fā)明所提供的玉米絲氨酸消旋酶基因為ZmSR，其 來源于玉米屬玉米（ZeamaysL.)，該基因片段大小為1014bp。
[0006] 本發(fā)明所涉及的設計方案為一種玉米絲氨酸消旋酶基因，具有序列表中SEDID NO:l項下的序列。ZmSR通過B73自交系三葉期cDNA為模板克隆獲得，經過測序其為 1014bp，與NCBI網站公布的玉米絲氨酸消旋酶基因（NM_001143028. 1)序列一致。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種玉米絲氨酸消旋酶基因表達的載體，其特征在于能作為篩選 標記在南抗楊遺傳轉化中的應用。利用前述的玉米絲氨酸消旋酶基因將替換雙元表達載體 PCAMBIA1301上的⑶S標記基因，將該載體命名為pBI1301-ZmSR。以南抗楊組培苗的葉片為 對象，通過農桿菌介導的遺傳轉化，將pBI1301-ZmSR載體導入到南抗楊。先對南抗楊的葉 片和不定芽分別進行D-絲氨酸的敏感性試驗，確定各自的篩選的臨界濃度分別為15mM和 12. 5mM。再以南抗楊組培苗的葉片為材料，通過農桿菌介導法將pBI1301-ZmSR導入到葉片 以及愈傷組織進行遺傳轉化，并以含有⑶S基因的pBI121轉化南抗楊的葉片以及愈傷組織 作為對照，對比試驗發(fā)現(xiàn)轉⑶S基因的南抗楊葉片以及愈傷組織比轉pBI1301-ZmSR分化率 高，但轉pBI1301-ZmSR的污染率較轉含有⑶S基因的pBI121的污染率低從而獲得轉基因 南抗楊植株。篩選轉化植株，最后共獲得12株D-絲氨酸抗性苗，經分子檢測共有3株植。 對轉基因植株的表型性狀進行觀察，非轉基因植株作為對照，結果表明轉pBI1301-ZmSR的 葉片生長狀況優(yōu)于非轉基因和轉含有⑶S基因的pBI121的南抗楊，且轉pBI1301-ZmSR的 南抗楊株高明顯高于轉含有⑶S基因的pBI121的南抗楊。
[0008] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了所述基因作為篩選標記在南抗楊遺傳轉化中 的應用。
[0009] 在其他實施方案中，本發(fā)明提供了包含所述玉米絲氨酸消旋酶基因的植物表達載 體。在一個實施方案中，所述載體是用所述玉米絲氨酸消旋酶基因取代植物雙元表達載體 PCAMBIA1301上的⑶S基因，從而構建得到的植物表達載體。在另一實施方案中，所述植物 表達載體能作為一種篩選標記基因在南抗楊遺傳轉化應用。
[0010] 有益效果：本發(fā)明提供了一個玉米絲氨酸消旋酶能作為一種篩選標記基因在南抗 楊遺傳轉化應用。該基因第一次作為篩選標記應用于南抗楊的遺傳轉化體系中，是一種無 抗性選擇標記基因，較抗生素作為篩選標記不僅可以篩選出陽性抗性植株，而且可以對植 株體內的D-絲氨酸具有解毒功能，具有低污染率，對植株生長發(fā)育以及對環(huán)境安全、無危 害。因此，研宄該標記基因對植物轉基因，尤其是在對大規(guī)模轉基因南抗楊苗的篩選具有重 要的科學意義和應用前景。
【附圖說明】
[0011] 圖lpBI1301-ZmSR載體雙酶切結果
[0012] M，DL-2000Marker1，NcoI和BstpI雙酶切條
[0013] 圖2D-絲氨酸臨界濃度篩選試驗
[0014] A，葉片分化抗性篩選結果；B，生根抗性篩選結果。
[0015] 圖3轉基因株檢測圖
[0016]M，DL2000 ; 1，ddH20 ; 2,為未轉化植株葉片基因組（陰性對照）；3,重組質粒 (陽性對照）；4-6,D-絲氨酸抗性植株葉片基因組；
[0017] 圖4轉基因植株的對比結果圖
[0018]CK，未轉化植株；⑶S，轉含⑶S基因pBI121載體載體植株；SR，轉pBI1301-ZmSR載 體植株
[0019] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
【具體實施方式】
[0020] 所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上海生工公司測序；Taq酶、 Trans5a感受態(tài)及相關的試劑盒購置北京全式金公司；限制性內切酶NcoI和BstpI，T4 連接酶購自TaKaRa公司；相應的抗生素來自上海生工和SIGMA公司；其余試劑均為國產分 析純。本研宄所用的表達載體PBI121以及根癌農桿菌LBA4404由本實驗室保存，雙元表達 載體PCAMBIA1301由生命科學學院作物生物重點實驗室惠贈。下述實施例中所用方法如無 特別說明均為常規(guī)方法。
[0021] 實施例1.載體構建與轉化
[0022] 以玉米B73自交系三葉期cDNA為模板克隆獲得，根據(jù)NCBI網站公布序列 (NM_001143028. 1)設計引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位點，下游加BstpI(GGTAACC)酶 切位點，引物如下：
[0023]引物 1 (上游引物）：5 ' -CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3 '
[0024]引物 2(下游引物）：5' -GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3'
[0025] PCR得到約lOOObp條帶，回收后，將回收產物用NcoI和Bs