專利名稱：高效哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因重組蛋白質(zhì)的基因載體，尤其是能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效率地表達(dá)基因重組蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)誕生以來，基因表達(dá)技術(shù)已滲透到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。利用表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，而且是生物醫(yī)藥行業(yè)用來生產(chǎn)基因重組蛋白質(zhì)藥物和抗體藥物的主要手段。哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體是包含原核序列、啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號等組分的DNA片斷。該項技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，在一定的培養(yǎng)條件下哺乳動物細(xì)胞可表達(dá)生產(chǎn) 并最終純化獲得所需的目的蛋白。哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低，產(chǎn)量還不高，難以滿足大規(guī)模的實際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有的哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體表達(dá)量低的不足，本發(fā)明提供一種哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體，該哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體不僅能象目前常用的哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出目的蛋白質(zhì)，而且表達(dá)的效率遠(yuǎn)高于這些載體，其蛋白質(zhì)產(chǎn)量是這些載體的3-50倍。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是在載體的啟動子前插入一段長度為363堿基對的DNA序列，該DNA序列含有大量轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，對轉(zhuǎn)錄具有增強(qiáng)作用的轉(zhuǎn)錄因子如SP、AP和CREB/CBP等可以與相應(yīng)的結(jié)合位點結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)，提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。將含有該DNA片段的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，該DNA片段可以吸引大量的轉(zhuǎn)錄因子如SP、AP和CREB/CBP等，可以提高目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量3-50倍，從而達(dá)到提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的目的。本發(fā)明的有益效果是，表達(dá)蛋白質(zhì)的效率遠(yuǎn)高于目前常用的載體，目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量是這些載體的3-50倍，可以顯著提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)一步說明。圖I是本發(fā)明的質(zhì)粒圖。圖2是本發(fā)明用于插入啟動子前長度為363堿基對的DNA片段序列。圖中I.新插入的長度為363堿基對的DNA片段，2. pCMV啟動子，3.克隆位點，
4.SV40 pA, 5. SV40早期啟動子,6. neomycin/kanamycin抗性基因，7. TK基因的聚腺嘌呤信號，8. pUC origin能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制。
具體實施方式
在圖I中，新插入的長度為363堿基對的DNA片段(I)含有大量轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，對轉(zhuǎn)錄具有增強(qiáng)作用的轉(zhuǎn)錄因子如SP、AP和CREB/CBP等可以與相應(yīng)的結(jié)合位點結(jié)合，與PCMV啟動子(2)協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)，提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。克隆位點(3)主要用于插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的cDNA片段。SV40 pA (4)是真核基因的mRNA加工需要的多聚腺苷酸加尾信號。SV40早期啟動子(5)、neomycin/kanamycin抗性基因(6 )以及TK基因的聚腺嘌呤信號(7)組成Neo抗性盒，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外，載體中的pUC origin能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制,而位于此表達(dá)盒上 游的細(xì)菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)載體，其啟動子前有一段含有轉(zhuǎn)錄因子SP、AP和CREB/CBP的結(jié)合位點的DNA片段，其特征是該DNA片段的核苷酸序列為 CCCGAACCCC CCTTTGAGGA AGACGCGGCG CAGTCCTGCT TCCACGACGG AGCCGGAAGGACGCAAGGAC CGCGGCAGGG CGGAGTTTCT GCGTCCGGCG TCCGGGGGCG GGGCCGCGAC GGCGCATTGTGACGCGCCAG AGCTGAGCCG CCGGTTGGCC GGCTGGGCGC GGAGCAGAGC CGACACGGCT GGCGGGGGAGGCGGTGGAGG CGGTGGAGGC GGACAAGCGA GGACGTTTCT GGAGAGGAGA AGGGAGGGGA GGGGAGGGGATAGGGGGAGG GGGAGGAGGA GGAGGGAGTG GAGCGGCGGG AAAGATCCCT CTGACTGCCCCTGAGGCCCT GGAGGAAGGA CACTGGTGAG CTC。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高效哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體，其特征是本發(fā)明采用的DNA片段，以5 — 3方向緊鄰裝配在pCMV啟動子的上游。
全文摘要
一種哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體，該哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體不僅能象目前常用的哺乳動物細(xì)胞基因重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出目的蛋白質(zhì)，而且表達(dá)的效率遠(yuǎn)高于這些載體。它是在載體的啟動子前插入一段長度為363堿基對的DNA序列，該DNA序列含有大量轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，對轉(zhuǎn)錄具有增強(qiáng)作用的轉(zhuǎn)錄因子如SP、AP和CREB/CBP等可以與相應(yīng)的結(jié)合位點結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)，提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量。將含有該DNA片段的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，該DNA片段可以吸引大量的轉(zhuǎn)錄因子如SP、AP和CREB/CBP等，可以提高目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量3-50倍，從而達(dá)到提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的目的。
文檔編號C12N15/85GK102787137SQ20111012591
公開日2012年11月21日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者朱燕華 申請人:朱燕華