一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)及制備方法，屬于納米藥物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明制備方法包括以下步驟：（1）將兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶解于水中，并用有機溶劑稀釋；（2）將蛋白質(zhì)溶于水或有機溶劑中，配置成溶液；（3）將步驟（2）制備所得溶液加入步驟（1）制備的溶液中，超聲分散，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜；（4）將步驟（3）所成膜加入溶劑重新分散，得納米粒子溶液，經(jīng)離心、洗滌、干燥，得到包載蛋白質(zhì)藥物的仿生納米載體系統(tǒng)。本發(fā)明提供的仿生納米載體系統(tǒng)可保持蛋白質(zhì)藥物的活性，提高蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性和生物利用度，且制備條件溫和，工藝簡單，能夠在蛋白質(zhì)藥物制備中得到很好的應(yīng)用。
【專利說明】一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)及重組技術(shù)的革新，蛋白質(zhì)、多肽等藥物的種類和數(shù)量日益增多，用途越來越廣，可以用來治療一些以前無法治療或療效較差的疾病，已成為人類攻克癌癥、惡性腫瘤、心腦血管疾病等頑疾的有力工具。蛋白質(zhì)藥物大多為內(nèi)源性物質(zhì)，具有高活性、低毒性、特異性強、生物功能明確等優(yōu)點，但其存在的穩(wěn)定性差、體內(nèi)酶降解、血液半衰期短、難以穿透細胞膜等缺點，對此類藥物的臨床應(yīng)用造成了巨大障礙。
[0003]為了提高蛋白質(zhì)藥物的生物利用度和治療效果，人們發(fā)展了一系列蛋白質(zhì)藥物載體技術(shù)，如蛋白質(zhì)及其載體的聚乙二醇(PEG)化，以聚乳酸、葡聚糖、殼聚糖等可降解型高分子及其衍生物為基材構(gòu)建的微球、微囊及凝膠等作為蛋白質(zhì)藥物傳輸載體[1.S.Salmaso, P.Caliceti, Self assembling nanocomposites for proteindelivery:Supramolecular interactions of soluble polymers with protein drugs.1nt.J.Pharmac eut.2013，440，111-123 ；2.H.By sell，R.1VlanSSOn9 P.Hans son，M.Malmstenj Microgels and microcapsules in peptide and protein drug delivery.Adv.Drug Deliv.Rev.2011，63，1172-1185.]。雖然這些技術(shù)在一定程度上可以改善蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性及延長半衰期，但仍然存在種種不足，如負載蛋白質(zhì)藥物的活性往往會降低；而且載體本身也可能導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，如PEG可能引發(fā)補體激活而導(dǎo)致超敏反應(yīng)和快速血液清除，不可降解的PEG鏈段在體內(nèi)累積，等等。
[0004]近年來，人們發(fā)現(xiàn)仿細胞膜結(jié)構(gòu)的兩性離子磷酸膽堿(PC)基團改性技術(shù)可抑制源于非特異性蛋白吸附導(dǎo)致的機體防御機制激活，包括單核吞噬細胞系統(tǒng)的清除作用，改善載體的血液相容性；而且聚兩性離子鏈段可增強蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性而不損失其生物活性[1.R.Matsuno, K.1shihara, Integrated functional nanocolloids coveredwith artificial cell membranes for biomedical applications, Nano Today, 6，61 ~74(2011) ；2.A.J.Keefe, S.Jiang, Poly(zwitterionic) protein conjugates offerincreased stability without sacrificing binding affinity or bioactivity.Nat.Chem.2012，4，59-63.]。因此，利用兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物負載蛋白質(zhì)藥物形成仿生載體系統(tǒng)，可以克服蛋白質(zhì)藥物載體現(xiàn)有技術(shù)的不足，實現(xiàn)蛋白質(zhì)、多肽等蛋白質(zhì)藥物的有效包載及高效化利用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法獲得的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的高效化利用。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，具體步驟如下:
[0009]( I)將兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶于水，用有機溶劑稀釋，配制成兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶液；
[0010](2)將蛋白質(zhì)藥物溶解于溶劑中，配制成蛋白質(zhì)藥物溶液；
[0011](3)將步驟(2)配制的蛋白質(zhì)藥物溶液緩慢加入步驟(1)配制的兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶液中，超聲分散，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜；
[0012](4)將步驟(3)所成膜加水?dāng)嚢柚匦路稚?，得納米粒子溶液，經(jīng)離心、沉淀洗滌、干燥，得到用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)選方案如下:
[0014]步驟(1)中所述兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物，其特征在于分子結(jié)構(gòu)如式I所示:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于具體步驟如下: (1)將兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶于水，用有機溶劑稀釋，配制成兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶液； (2)將蛋白質(zhì)藥物溶解于溶劑中，配制成蛋白質(zhì)藥物溶液； (3)將步驟(2)配制的蛋白質(zhì)藥物溶液緩慢加入步驟(1)配制的兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶液中，超聲分散，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜； (4)將步驟(3)所成膜加水?dāng)嚢柚匦路稚ⅲ眉{米粒子溶液，經(jīng)離心、沉淀洗滌、干燥，得到用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)； 步驟(1)中所述兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物的分子結(jié)構(gòu)如式I所示:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于:所述的兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物通過下述方法制備獲得: 1)將殼聚糖改性得到6-0-三苯基甲醚化殼聚糖，溶于反應(yīng)介質(zhì)；加入雙取代膽堿膦酸酯，其中6-0-三苯基甲醚化殼聚糖中的氨基與膦酸酯的摩爾比為1:2~10，于O~40°C攪拌反應(yīng)12~24小時；旋干溶劑，加入甲酸，室溫攪拌0.5~2小時；旋干甲酸，加入堿性水溶液，水解0.5~4小時，用去離子水透析，冷凍干燥，得到磷酸膽堿化殼聚糖衍生物； 2)將磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶于pH=2~7的酸性或中性水溶液中，利用N-酰化反應(yīng)引入疏水基團，控制反應(yīng)溫度在10~40°C，反應(yīng)24~72小時，控制疏水化試劑與磷酸膽堿化殼聚糖衍生物中氨基的摩爾比為0.05~0.6:1 ;產(chǎn)物經(jīng)純化，干燥，得到兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于: 步驟I)所述殼聚糖為脫乙酰度70%~100%、平均分子質(zhì)量5000~IOOW的殼聚糖； 步驟I)所述的將殼聚糖改性得到6-0-三苯基甲醚化殼聚糖的改性方法為殼聚糖先后通過N-鄰苯二甲?；?-0H的三苯基氯甲烷醚化，再用水合肼脫去鄰苯二甲?；玫剑? 步驟I)所述反應(yīng)介質(zhì)為二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每IOOmL二甲基乙酰胺中含有I~IOg的6-0-三苯基甲醚化殼聚糖，其中三乙胺、四氯化碳與6-0-三苯基甲醚化殼聚糖的氨基摩爾比為6:4:1 ; 步驟I)所述雙取代膽堿膦酸酯由氯化膽堿和對苯氧基膦酸酯按摩爾比2:1在二甲亞砜/吡啶混合溶劑中反應(yīng)2小時制得； 步驟I)所述的堿性水溶液為氨水、氫氧化鉀或氫氧化鈉水溶液中的一種；pH值為10~13。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于:步驟2)所述的酸性水溶液為乙酸或鹽酸水溶液中的一種； 步驟2)所述的磷酸膽堿化殼聚糖衍生物的濃度為5~20g/L ； 步驟2)所述的N-?；磻?yīng)為1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽作為偶聯(lián)劑，將疏水化試劑上的疏水基團通過酰胺鍵偶聯(lián)在氨基上； 步驟2)所述的疏水基團為脫氧膽酰基、去羥基膽酰基、膽酰基、膽固醇半琥珀?；⑿刘；⒐秕；?、肉豆蘧酰、棕櫚?；?、油酰基或亞油?；械闹辽僖环N； 步驟2)所述的反應(yīng)溫度為室溫； 步驟2)所述的磷酸膽堿化殼聚糖衍生物中氨基、疏水化試劑的羧基和偶聯(lián)劑的摩爾比為 1:0.05 ~0.6:0.15 ~0.9 ; 步驟2)所述的純化方法為透析； 步驟2)所述的干燥方法為冷凍干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述的兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶于水形成的水溶液濃度為0.05 ~10mg/mL ； 步驟(1)中所述的有機溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的至少一種，有機溶劑與水之體積比為1:1~19:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述蛋白質(zhì)藥物為親水性小肽、疏水性小肽、多肽或蛋白質(zhì)中的至少一種； 步驟(2)中所述的溶劑為水或適于溶解疏水性蛋白質(zhì)藥物的有機溶劑；所述的適于溶解疏水性蛋白質(zhì)藥物的有機溶劑為甲醇、乙醇或乙腈中的至少一種； 步驟(2)中所述的蛋白質(zhì)藥物溶液的濃度為0.05~10mg/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述加入的兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物溶液與蛋白質(zhì)藥物溶液中兩親性磷酸膽堿化殼聚糖衍生物與蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量之比為在1:1~5:1 ; 步驟(3)中所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為30~60°C ； 步驟(3)中所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜的轉(zhuǎn)速為50~300rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述的攪拌的時間為10~20min ； 步驟(4)中所述的離心的轉(zhuǎn)速為12000~20000rpm ;離心時間為15~60min ;離心溫度為4°C ； 步驟(4)中所述的洗滌為去離子水洗滌，洗滌次數(shù)為三次； 步驟(4)中所述的干燥為冷凍干燥。
9.一種用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)由權(quán)利要求1~8中任一項所述的制備方法獲得。
10.權(quán)利要求9所述的用于蛋白質(zhì)藥物傳輸?shù)姆律{米載體系統(tǒng)在蛋白質(zhì)藥物制備中 應(yīng)用。
【文檔編號】C08B37/08GK103536895SQ201310451917
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】曾戎, 董宏偉, 梁昊, 屠美, 趙劍豪 申請人:暨南大學(xué)